Summary
Эта статья представляет подробный протокол для T4 перевязки и денатурируя очистки страницы небольшие круговые молекулы ДНК, отжига и родной анализ страницы круговой плитки, монтаж и АСМ изображения 1D и 2D наноструктур ДНК, а также агарозы гель электрофорез и центрифугирования очистка конечных ДНК наноструктур.
Abstract
Эта статья представляет подробный протокол для синтеза небольшие круговые молекулы ДНК, отжиг круговые мотивы ДНК, и строительство 1D и 2D ДНК наноструктур. На протяжении десятилетий быстрое развитие Нанотехнологии ДНК приписывается использования линейной ДНК как исходных материалов. Например плитка DAO (double кроссовер, antiparallel, нечетные половину повороты) хорошо известен как стандартный блок для построения 2D ДНК решетки; Основная структура DAO производится из двух линейных одноцепочечной (СС) олигонуклеотиды, как две веревки, делая узел бабушка правой рукой. Здесь, новый тип плитки ДНК называется cDAO (спаренной DAO) строятся с использованием небольшой циркуляр ss ДНК c64nt или c84nt (круговой 64 или 84 нуклеотидов) как стренги эшафот и несколькими линейных ss ННО как основной нити. Идеальный 1D и 2D наноструктур собираются из cDAO плитки: бесконечные нанопроволоки, nanospirals, нанотрубки, наноленты; и конечное нано прямоугольников. Описываются подробные протоколы: 1) подготовка лигаза T4 и очистки, денатурации страницы (электрофорез геля полиакриламида) небольшие круговые олигонуклеотиды, 2) отжиг стабильные круговые плитки, следуют родной анализ страницы, 3) монтаж бесконечные 1D нанопроволоки, nanorings, nanospirals, бесконечные 2D решетки нанотрубок и наноленты и конечных 2D нано прямоугольники, следуют AFM (атомной силовой микроскопии) изображений. Метод простой, надежной и доступной для большинства лабораторий.
Introduction
Молекулы ДНК были использованы для построения различных наноструктур на протяжении десятилетий. Типичные мотивы включают Дэ (двойной кроссовер, antiparallel, даже половины повороты) и DAO плитки1,2,3, звезда плитки4,5,6,,7сингл мель (СС) плитки8,9,10и ДНК оригами11,12,13. Эти мотивы ДНК и решетки собираются из линейной ss ННО. Недавно другие и мы сообщили использовании круговой ss олигонуклеотиды как строительные леса, чтобы построить мотивы, нанотрубок 1D и 2D решетки14,,1516,17. Вставляя Холлидей Джанкшен (HJ)18,19,,2021 в центре c64nt, пара двух спаренных DAO плитки может быть сформированный17. Этот новый мотив cDAO и его производные являются стабильными и достаточно жесткой, чтобы собрать 2D ДНК решетки до 3 × 5 мкм2. В этой статье мы используем термин «круговой плитка», который определяется как стабильная сложные молекулы ДНК, построены с одной круговой леску и других линейных скобы ss олигонуклеотиды, и еще один срок «линейной плитка», который построен из полного набора линейных SS олигонуклеотиды.
Этот протокол показывает, как построить пять видов ДНК наноструктур с небольшие круговые молекулы ДНК, как строительные леса: 1) бесконечные 1 D c64nt и c84nt нанопроволоки, 2) бесконечные 2D cDAO-c64nt-O и cDAO-c64nt-E (-O представляет собой нечетное число 5 половину повороты и -E представляет собой четное число 4 половину-поворотов) решетки, 3) бесконечные 2D cDAO-c84nt-O и cDAO-c84nt-E решетки, 4) конечных 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O и 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O прямоугольников, 5) бесконечные 1 D acDAO-c64nt-E nanorings и nanospirals (пожалуйста, обратитесь к Рисунок 3-5 схематические рисунки и изображения выше пяти видов наноструктур ДНК). 1D c64nt и c84nt нанопроволоки собираются из каждого c64nt и c84nt леса, связанные с двух линейных скобы соответственно. Каждый круговой плитка cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt или cDAO-c84nt является отожженная из его соответствующих эшафот, c64nt, c74nt или c84nt с четырьмя линейной скобы соответственно. Бесконечные 2D решетки смонтированы из того же типа две круговые плитки с различными последовательностями. Два конечных 2D прямоугольник решетки смонтированы из двух наборов плиток 32 круговой суб соответственно. Чтобы сэкономить деньги, только одну последовательность c64nt, c74nt и c84nt используется в качестве соответствующих леску в то время как различные свесы используются для отжига 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt и круговой суб плитки 20 cDAO-c84nt соответственно в первом шаге отжига суб плитки, затем Смешайте соответствующее 32 круговой суб плитки и применить второй решетки, отжиг шаг собрать конечных 5 × 6 cDAO-c64nt-O и 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O решетки, соответственно. Безусловно по-разному виртуализированных круговой леса может быть принят собрать различных наноструктур конечного размера, однако это будет стоить больше денег и труды. Бесконечные 1D acDAO-c64nt-E nanorings и nanospirals отожженная из плитки одного последовательного асимметричной acDAO-c64nt с линейной связи четное количество 4 половину повороты. Существует два подхода к собирать бесконечное 2D решетки из круговой плитки cDAO-c64nt и cDAO-c84nt, которые отличаются межизразцовые расстояния четное число нечетное количество 5 половину поворачивает и 4 соответственно. Первый требует все плитки, чтобы согласовать одинаково; Последнее требует чередование лица двух соседних плиток вдоль оси спирально. Если плитка является жесткий и плоский, например cDAO-c64nt, оба подхода будет генерировать Вселенский наноленты; Если плитка изогнута в одном направлении, например cDAO-c84nt, межизразцовые подключение четное количество 4 половина витков будет генерировать нанотрубок, тогда как межизразцовые подключение нечетное количество 5 половина витков будет производить Вселенский наноленты за счет ликвидации кривизной предвзятым роста путем альтернативных выравнивание кривой плитки. Успешной сборки 1D и 2D наноструктур ДНК от круговой плитки указывает несколько преимуществ этого нового подхода: таких как насильственные стабильности и жесткости круговой плитки через линейные плитки, хиральные плитки для Ассамблеи асимметричный наноструктур nanorings и наноленты, новые взгляды на понимание ДНК механики и молекулярной структуры и т.д.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка круговой ННО
- Используйте все линейные ННО, предоставляемые коммерческими компаниями напрямую без дальнейшей очистки.
- Центрифугуйте образцы ДНК на 5000 g × 5 минут собрать все ДНК окатышей в нижней части трубы. Добавьте соответствующий объем буфера (10 мм трис, 1 мм ЭДТА, рН 8,0) TE распустить ДНК.
- Измерить концентрацию «» нг/мкл для каждого решения ss ДНК с помощью микро УФ спектрометр на 260 Нм. Преобразовать мкм «b» «» нг/мкл b = × 103 / (молекулярный вес ДНК нить). Отрегулируйте количество TE решение сделать 10 мкм ДНК Стоковый раствор.
- Используйте T4 ДНК лигаза для подключения заканчивается 3' и 5' 5'-фосфорилированных линейной ДНК шаблонов ( рис. 1) c64nt, c74nt и c84nt, оказывается непосредственно от коммерческих компаний.
- Смешайте 5'-фосфорилированных линейной ДНК пряди (3,5 мкм) и его соответствующего стренге дна шину движения (4,5 мкм), который в 80 мкл буфера TE в 200 мкл ПЦР тест трубки15. Инкубируйте трубку в открытых термо бутылку с водой 95 ° C. Охладить вниз горячей воды комнатной температуре (25 ° C) около 2-3 часов под лаборатории атмосферу.
- 10 мкл 10 x T4 буфера (660 мм трис-HCl, 66 мм MgCl2, 100 мм DTT, АТФ 1 мм) и 10 мкл T4 лигаза (300 U/мкл) в смеси до окончательного объема 100 мкл. Инкубируйте смесь в Термоциклер 16 часов при температуре 16 ° C.
Примечание: Выше концентрации ДНК и реакции объем ~ 100 мкл оптимизированы для высокой лигирование эффективность и высокая доходность правильной oligo мономер циклизации. Запуск двух или нескольких трубок реакции перешнуровки в то же время согласно экспериментальный дизайн. Альтернативные инкубации процедура для перевязки замена шаг 1.6 — 4 часа при 25 ° C. - После инкубации деактивируют лигаза T4 в воде 95 ° C за 5 minminutes. Затем передать трубку Ванна ледяной водой и проинкубируйте 5 минут остыть.
- Добавить 10 мкл 10 x Exonuclease буфере и 10 мкл Exonuclease я (5 U/мкл) в закаленном смесь и инкубировать трубки при 37 ° C на водяной бане 30 мин, выборочно дайджест оставшиеся линейной ННО и оставить нетронутыми circularized ННО.
- Подготовка 10% Денатурирующий гель страницы.
- Надевайте резиновые перчатки и защитные очки при подготовке страницы гель в зонта. Добавить 6.67 мл раствора акриламида/bisacrylamide 30% (w/v) (19:1), 2 мл 10 x TAE· Буфер мг (40 мм трис, 40 мм HAc, 1 мм ЭДТА, рН 8,0, 12,5 мм Mg(Ac)2), 8,4 г мочевины (7 М) и обессоленной воды в окончательный объем 20 мл в пластиковых пробирок 40 мл.
Предупреждение: Раствор акриламида/bisacrylamide решение (19:1) 30% (w/v) является токсичным. - 20 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED) и 100 мкл Персульфат аммония (APS, 10% w/v) до 40 мл трубки перед передачей гель решение системы электрофореза немедленно. Вставьте толщиной 1,5 мм и 10-Ну гребень. Подождите по крайней мере 20 минут, до тех пор, пока решение гель затвердевает.
- Задать постоянное напряжение 80 V для геля 85 × 80 × 1,5 мм3 (ширина × рост × толщина). Добавить 1 x TAE· Мг буфер электрофореза системы и предпробегаю гель для 20 мин в 10 V/см.
- Надевайте резиновые перчатки и защитные очки при подготовке страницы гель в зонта. Добавить 6.67 мл раствора акриламида/bisacrylamide 30% (w/v) (19:1), 2 мл 10 x TAE· Буфер мг (40 мм трис, 40 мм HAc, 1 мм ЭДТА, рН 8,0, 12,5 мм Mg(Ac)2), 8,4 г мочевины (7 М) и обессоленной воды в окончательный объем 20 мл в пластиковых пробирок 40 мл.
- Положите ПЦР тест трубки из шага 1.8 в 95 ° C воды на 5 минут, чтобы инактивировать Exonuclease я. Затем передать трубку Ванна ледяной водой и проинкубируйте еще 5 мин.
- 20 мкл формамид в трубе в окончательный объем 140 мкл и mix решение. Распространите решение 7-9 денатурируя страницы гель скважин наравне с 16-20 мкл для каждого гель хорошо. Смешайте 2 мкл загрузки краситель (0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксилола cyanol FF, 60% глицерина, 10 мм трис-HCl, 60 мм ЭДТА, рН 7,6) с 8 мкл соответствующего прекурсоров линейной ДНК (10 мкм) и залить смесь в отдельном колодец для справки.
Примечание: Добавление формамид увеличить плотность загрузки решения для проходки в нижней части страницы гель хорошо и также чтобы отделить некоторые двойной мель ДНК остатков. - Побегите гель для около 2 часов на 10 V/см и остановить когда ксилол cyanol FF находится в позиции 2/3 стеклянной пластины с невооруженным глазом.
- Надевайте резиновые перчатки и защитные очки для защиты кожи и глаз. Возьмите гель из стеклянной пластиной. Поместите гель на флуоресцентные пластину TLC (тонкий слой хроматографии). Cut off гель полос целевой лезвие как ровно как затененный УФ облучением (рис. 2).
Предупреждение: УФ-излучения вреден для глаз и кожи.
Примечание: Под УФ-облучения в 254 Нм, ДНК будет поглощать свет и тень на TLC пластину. Круговой ДНК побежал немного медленнее, чем его соответствующих прекурсоров линейной ДНК. Некоторые непереваренных линейной ННО и нежелательных круговой ННО в небольших количествах, которые окружают затененный целевой группы будет загрязнять круговой ДНК, если они собраны. - Перевести гель полос в пробки microcentrifuge 2.0 мл. Воздух сухой или удар сухой гель полос и затем размять гели в пасту шпателем или плоский стеклянной палочкой. Убедитесь в том, что гель был полностью разгромлен в пасту, которая имеет решающее значение для высокодоходных круговой ДНК. Добавить дважды гель объем деионизированной воды в трубку и встряхнуть трубки на ночь при комнатной температуре.
- Фильтр смесь для сбора supernatants в пробки microcentrifuge 2.0 мл. Восстановление любых остаточных ДНК путем полоскать с небольшим объемом деионизированной воды и фильтров снова объединить supernatants.
- Выдержка с равным объемом н бутанолом элюента. Повторите эту процедуру до тех пор, пока Водный объем уменьшается до около 200 мкл.
- Добавьте 500 мкл абсолютного этанола (−20 ° C) и 20 мкл 3 M NaOAc (pH 5,1) в смеси для ДНК осадков. Храните трубку −20 ° C за 30 мин.
- Центрифуга для трубки на 12000 g × 10 мин при температуре 4 ° C, выбросьте супернатант. Оставшийся осадок ДНК-около 100 мкл в трубе.
- 600 мкл 75% этанола (−20 ° C) на трубу и хранить его на −20 ° C за 30 мин. Затем центрифуги на 12000 g × 10 мин при температуре 4 ° C, удалить супернатант. Оставшийся осадок ДНК снова около 100 мкл раствора в трубе. Повторите эту процедуру два раза.
- После последнего центрифугирования отбросить супернатанта как можно больше. Сухие остатки с вакуумной концентратор.
- Магазин очищенного круговой ДНК в трубе −20 ° C.
- Ресуспензируйте круговой ДНК в TE буфер, чтобы сделать 10 мкм круговой ДНК Стоковый раствор согласно шага 1.3 при необходимости.
2. отжиг решений Ассамблеи
- Подготовка каждого плитки или наноструктурных Ассамблея решения c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, ГП c84nt, УМЦД c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt и acDAO-c64nt-E разработан набор линейных и круговых ННО Однореакторный отжига.
- Для каждого решения Ассамблеи, смешать 2 мкл 10 x TAE· Буфер мг, 1 мкл каждого ДНК акций решения набора линейных и круговых нитей в равных молярное соотношение и дополнительные TE буфера в пробирке ПЦР 200 мкл до конечной концентрации каждой пряди на 0,5 мкм и окончательный объем 20 мкл. отжиг решение Ассамблеи в термо бутылка от 95 ° C до 25 ° C в течение 48 ч.
- Подготовьте каждое решение Ассамблеи 2D бесконечные решеток cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E и cDAO-c84nt-O с дизайном набор линейных и круговых ННО для отжига двухэтапный.
- Подготовка каждого решения Ассамблеи суб плитка прекурсоров путем смешивания 2 мкл 10 x TAE· Буфер мг, 1 мкл каждого ДНК акций решения набора линейных и круговых нитей в равных соотношениях молярной и дополнительные TE буфера в пробирке ПЦР 200 мкл до конечной концентрации 0,5 мкм для каждой стренги и окончательный объем 20 мкл. На первом шаге отжига суб плитки отжиг каждое решение Подкомиссии плитка прекурсоров в PCR Термоциклер с помощью быстро линейный метод охлаждения от 95 ° C до 25 ° C более 2,5 ч.
- Подготовка каждого решения Ассамблеи выше четырех бесконечные решеток путем смешивания 10 мкл каждого из двух соответствующих решений Подкомиссии плитки вместе до конечной концентрации 0,25 мкм для каждой стренги. В втором решетки, отжиг шаг отжиг 20 мкл смесь в PCR Термоциклер с помощью медленного охлаждения метода охлаждать вниз со скоростью 0,1 ° C за 5 минут до 20 ° C, около 24 ч. в общей сложности и пребывание в 50 ° C в течение 2 ч.
Примечание: Две параллельные экспериментов может выполняться одновременно либо впоследствии на втором шаге отжига для каждого 2D infinite решетки.
- Подготовьте решения Ассамблеи двух сборок конечного прямоугольника, 5 × 6 cDAO-c64nt-O и 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O двухэтапный отжига.
- Подготовка каждого решения Ассамблеи суб плитка прекурсоров путем смешивания 1 мкл 10 x TAE· Буфер мг, 0,5 мкл каждого ДНК акций решения набора линейных и круговых нитей в равных соотношениях молярной и дополнительные TE буфера в пробирке ПЦР 200 мкл до конечной концентрации 0,5 мкм для каждой стренги и окончательный объем 10 мкл. На первом шаге отжига отжиг каждое решение Подкомиссии плитка прекурсоров в PCR Термоциклер с помощью быстро линейный метод охлаждения от 95 ° C до 25 ° C более 2,5 ч.
- Подготовка каждого решения Ассамблеи решетки конечного прямоугольника, смешивая 32 x (2 мкл раствора каждого суб плитка) вместе в пробирке ПЦР 200 мкл до конечной концентрации ~ 15 Нм для каждого суб плитки и окончательный объем 64 мкл. На втором шаге отжига Отжиг 64 мкл смесь в PCR Термоциклер с помощью медленного охлаждения метода охлаждать вниз со скоростью 0,1 ° C за 5 мин до 20 ° C, 24 часа в общей сложности и пребывание в 50 ° C в течение 2 ч.
Примечание: Пять параллельных экспериментов может выполняться одновременно либо впоследствии на втором шаге отжига для каждой сборки конечного прямоугольника.
3. собственный анализ страницы
- Подготовка 10% уроженец страницы следующий шаг 1.9, за исключением компонента мочевины.
- Примеры элементов управления c64bp и c84bp добавьте 2 мкл каждого решения Ассамблеи и 1 мкл загрузки красителя 3 мкл буфера TE как элементы управления отдельно. Для каждого из других сборок, перечисленные на рисунке 3добавьте 1 мкл каждого решения Ассамблеи и 1 мкл загрузки красителя 4 мкл буфера TE.
- Придать каждой из выше решения гелем хорошо. 5 мкл ДНК маркера (25-500 bp), отдельной скважине для справки.
- Побегите гель для около 4 часов 10 V/см в ледяной воде ванны. Ксилол нефтяной cyanol FF будет работать из стеклянной пластиной.
- Надевайте резиновые перчатки и защитные очки для защиты кожи и глаз. Возьмите гель из стеклянной пластиной и погрузите его в 100 мл деионизированной воды с 10 мкл пятно гель нуклеиновой кислоты 30 мин.
Предупреждение: Решение пятен нуклеиновой кислоты гель является токсичным. - Наблюдать гель под УФ изображений системы и сфотографироваться на память цветного геля (рис. 3).
4. Очистка конечных решетки
- Подготовьте родной 2% агарозном геле для электрофореза очистки конечных решетки.
- Смешайте 1 г порошка агарозы, 5 мл 10 x TBE· Мг буфера (89 мм трис, 89 мм борной кислоты, 2 мм ЭДТА, рН 8,0, 12,5 мм Mg(Ac)2), 2 мкл нуклеиновой кислоты гель пятно и 47.5 мл деионизованной воды во флаконе 250 мл треугольник. Кипятите смесь до тех пор, пока пузырьки становятся малые и плотной. Добавьте горячей воды в бутылке суммарный объем 50 мл и концентрации 2% агарозы.
- Толстых перчатках. Залейте раствор гель в ящик пластиковый гель 7 x 10 x 1 см3 (ширина × длина × толщина). Вставьте гребень 1,5 мм толщиной и 12-ну гель. Подождите, пока гель остыть до комнатной температуры. При необходимости, поставьте гель в холодильнике 4 ° С.
Предупреждение: Помните о ожога, потому что решение очень жарко. - Добавить 0,5 x TBE· Мг буфер в системе электрофореза. Предпробегаю гель на 5 V/см 20 мин в ледяной водой ванне при постоянном напряжении 50 V.
- Придать 20 мкл раствора конечных решетки, хорошо подготовленных на шаге 2.3 в каждом геля агарозы и добавить 5 мкл ДНК маркера (100-3000 bp) в отдельный хорошо. Побегите гель 2 h на 5 V/см в ледяной воде ванны.
- Надевайте резиновые перчатки и защитные очки для защиты кожи и глаз. Вырезать целевой гель полосы с позиции похож на маркер 1000 bp под УФ света и нарезать их в изысканные кусочки и поместите измельченные гели в столбец фильтра8.
- Центрифуга для столбца на 2000 x g 5 мин при 4 ° C. Извлечь образец решения через колонку. Соберите решение для AFM изображений.
- Очищайте конечных решетки высыпанием КОЛЫШЕК.
- Mix 50 мкл конечных решетки раствором, приготовленным на шаге 2.3 с равным объемом 15% PEG8000 (w/v) буфера (20 мм Mg(Ac)2, 5 мм трис, 1 мм ЭДТА и 505 мм NaCl)22. Центрифуга решение на 18 000 × g при 4 ° C на 30 мин.
- Удалить супернатант и 100 мкл буфера КОЛЫШЕК. Повторите центрифугирования.
- После удаления супернатанта, растворяют гранулы в 1 x TAE· Мг буфер для AFM изображений.
Примечание: Очистка необходима для конечных решетки 5 × 6 cDAO-c64nt-O и 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O для AFM изображений и других приложений. Если выход является слишком низким, увеличить скорость центрифугирования. Если продукт не является достаточно чистой, повторите шаг 4.2.2.
5. АСМ изображения
- Для c64nt нанопроволоки, c84nt нанопроволоки, acDAO-c64nt-E бесконечные 2D решетки cDAO-c64nt-E(O), и cDAO-c84nt-E(O), депозит 2 мкл отожженного образца на поверхности свежезаваренным рассеченного слюды. Оставьте на 2 мин ДНК решеток для адсорбции на поверхности слюды. Дважды мыть поверхности с 100 мкл деионизированной воды и высушите сжатым воздухом.
- Получите изображения AFM бесконечные ДНК решеток в воздухе путем сканирования поверхности слюды с треугольной АСМ зондов под струей режиме. Установите следующие параметры для сканирования: сканирование размер 0,5 ~ 5 мкм, разрешение 512 линий сканирования и проверки 3.5 Гц (рис. 4).
- Для конечных ДНК решетки 5 × 6 cDAO-c64nt-O и 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O, депозит 80 мкл 1 x TAE· Буфер в мг на поверхности свежезаваренным рассеченного слюды. Затем добавьте 5 мкл конечных образцов в буфер. Оставьте на 2 мин ДНК решеток для адсорбции на поверхности слюды. Еще 50 мкл 1 x TAE· Буфер в мг на АСМ зонд.
- Получите изображения AFM конечных ДНК решеток в жидкости путем сканирования поверхности слюды с треугольной АСМ зондов под струей режиме. Установите следующие параметры для сканирования: сканирование размер 0,5-1 мкм, сканировать с разрешением 256 линий и проверять 1,5 Гц (рис. 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Круговой ДНК движется немного медленнее, чем его прекурсоров линейной ДНК в денатурации страницу (Рисунок 2), потому что проникли поры внутри круговой ДНК и отсталых гель волокна23,24,25. Эффективность реакции правильный перевязки для oligo мономер циклизация зависит от последовательности субстрата и концентрации, температуры реакции, время, и т.д. Как концентрация предвестником линейной ДНК является достаточно высоким, около 3,5 мкм, продукция циклизация c64nt (или c84nt) и прекурсоров ссылки в настоящем Протоколе может быть непосредственно затененных как полосы в TLC плита под УФ света без умирает. Если полосы круговыми ДНК, расплывчатые или невидимым, указанием провал реакции перешнуровки или много урожайности низкой продукта. Иногда есть две полосы выше полосе линейной прекурсоров, касаясь дополнительных oligo димера кольцо за исключением кольцо правильно oligo мономера. Просто оставьте более высоких диапазонах и собирать низших. Очищенный круговой ДНК продукты можно рассматривать как белый порошок в трубе после вакуумной сушки. За исключением денатурируя страницы чистоты ДНК может также измеряться УФ спектрометр. Пик поглощения ДНК находится в 260 Нм. Два стандартных критериев чистоты ДНК являются коэффициент поглощения 280 Нм/260 Нм на 1,8 и что 280 Нм/230 Нм обычно в диапазоне 2,0-2,2. Если выше двух коэффициентов отклонения от стандартных значений, остатки должны быть извлечены снова, следующие шаги 1,18-1,20. Доходность по c64nt и c84nt для правильной oligo мономер циклизация измеряются в диапазоне 30-60% согласно настоящему Протоколу.
Родной анализ страницы предоставляет много информации о стабильности мотив, чистоты, жесткость, Ассамблея режим мономеров и полимеров, и т.д. (рис. 3). C64nt Ассамблея семьи c64bp, ГП c64nt, aHJ-c64nt, cDAO-c64nt и acDAO-c64nt имеют только один четкий и чистый группы для каждой сборки, представляющие они являются стабильными мономера мотивы. В то время как c84nt Ассамблеи семьи HJ-c84nt, УМЦД c84nt и cDAO c84nt плитки имеют пятна вокруг их основных полос, указывающее незначительных побочных продуктов, за исключением целевых мономеров мотивы. Независимо от незначительных побочных продуктов неправильной associates могут быть собраны отличные cDAO-c84nt-O (E) решетки с высокой урожайностью. Чтобы получить ясным и чистым электрофорез изображения, объем загрузки должно быть не более 10 мкл и количество ДНК следует 0.01 ~ 0,02 мкг/мл.
Наконец, успех экспериментов оценивается 1D и 2D ДНК наноструктур, отображаемого на AFM (рис. 4 и 5). Каждая сборка имеет свой собственный морфологические особенности в шкале микрометра нанопроволоки, нанотрубки, nanospirals, наноленты, и т.д. Кроме того детализированные текстуры ДНК сборок в нанометровом масштабе коррелирует с их теоретической круговой плитка размеры и режимы Организации очень хорошо соответственно ключ для проверки успешного и правильной сборки. Таким образом должны быть получены панорамным и высоким разрешением АСМ изображения в микрометр и нанометровом масштабе. Выбор методы Харвестерными и зонды имеют решающее значение для АСМ изображения высокого качества. Проверка силы должны быть скорректированы как малые, как 50 pN26. Если проверка силы является слишком большой, он бы ущерб структуре наноструктурных ДНК. Экологическая чистота является другим ключевым параметром для получения чистой и красивой АСМ изображения с высоким разрешением в жидкости. Все буферы должны быть отфильтрованы по 0,22 мкм фильтром; держатель зонда и пинцета должны мыть стиральным порошком и промыть деионизированной водой. Если окружающая среда загрязняется частиц космического мусора, кончик зонда будет поврежден или цеплялся частицами в буфере, таким образом влияющих на качество АСМ изображения.
Рисунок 1 . Синтез ДНК, циркулярный. Схема представляет, как долго 5'-фосфорилированных линейной олигонуклеотида синим развивается на циркуляр молекула ДНК. Два коротких красных нитей представляют олигонуклеотиды шину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Фотография денатурации страницы ДНК циклизация продуктов под УФ света, не умирая. Группа ДНК линейной 64nt прекурсоров находится в дальнего левого Лейн и его продукции циклизация круговой 64nt ДНК (c64nt) появляются как 9 полос на же горизонтального уровня в других 9 полос. 9 полос c64nt будут отрезаны для абстрагирования круговой ННО. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Родной страница фотографии после умирающего и схема двойной спиральной модели круговой плитки. Оба полимеры c64nt нанопроволоки и c84nt нанопроволоки представлены их простой складной блок камер, в которых два выровнены точки выше и ниже каждой ячейки указать бесконечное выравнивание блока ячеек вертикально вверх и вниз, с равные расстояния между дуплексы в форме нанопроволоки. Мономер круговой плитки c64bp, c84bp, ГП c64nt, aHJ-c64nt, ГП c84nt и УМЦД c84nt в A) имеют не выступающие свесы из их кольца, тогда как cDAO-c64nt, acDAO-c64nt и cDAO-c84nt в Б) имеют оба туп законченному 10 bp свесы соответственно. Для последовательностей пожалуйста, обратитесь к таблице последовательностей ДНК. Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. АСМ изображения типичных 1D и 2D infinite ДНК сборок проверяемых в воздухе. A) c64nt нанопроволоки, B) бесконечные acDAO-c64nt-E, C) бесконечные cDAO-c64nt-E, D) бесконечные cDAO-c64nt-O, E) бесконечные cDAO-c84nt-E и F) бесконечные cDAO-c84nt-O отожженная на липкой конце сплоченности. Все текстуры подробности в этих АСМ изображения соответствуют размеров плитки и организации режимы очень хорошо. Для последовательностей пожалуйста, обратитесь к таблице последовательностей ДНК. Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . АСМ изображения конечного прямоугольника сборок отсканированы в жидкости. Ассамблея конечного прямоугольника A) 5 × 6 cDAO-c64nt-O состоит из 32 cDAO-c64nt суб плитки и B) 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O состоит из 12 cDAO-c74nt и 20 cDAO-c84nt под плитки. Для последовательностей пожалуйста, обратитесь к таблице последовательностей ДНК. Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблицы последовательностей ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протоколы, представленные в этой статье сосредоточиться на синтез небольшие круговые молекулы ДНК и Ассамблея ДНК наноструктур. Большинство конструкций, случайно последовательности ДНК может использоваться в этом протоколе. Чистоты циркуляр ННО имеет решающее значение для успеха ДНК сборок. Доходность производства циклизация может быть улучшена путем снижения концентрации 5'-фосфорилированных линейной ДНК; Однако это приведет к увеличению рабочей нагрузки производить те же суммы круговой ННО. Длина нити ДНК шина также влияет на реакции перешнуровки правильный, он оптимизирован для быть около 20 нуклеотидов долго для c64nt и c84nt.
Соответствующей концентрации катионов магния (например., 12,5 мм) в растворе в течение и после того, как Ассамблея является очень важным для формирования и поддержания ДНК наноструктур. Таким образом концентрация катионов магния 12,5 мм всегда хранится во время процессов отжига, родной страница, электрофорез геля агарозы и PEG буфера центрифугирования очищения, АСМ изображения, и т.д.
Для сборки конечного прямоугольника 5 × 6 cDAO-c64nt-O и 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O, очищение геля агарозы не влияет на текстуры подробности, в то время как PEG очистки буфера центрифугирования вредит текстуры подробности ДНК наноструктур в АСМ изображения с высоким разрешением.
Пользу от стабильности и жесткость круговой плитки, это гораздо проще для создания хорошо организованных и большого размера единого 2D кристаллических решеток от круговой модулей от линейной плитки и генерируемых оригами9,11, чем хотя дополнительная работа необходима для обобщения и очищают круговые молекулы ДНК. С только одной круговой ДНК как же основная структура многие круговой модули могут создаваться с различными свесы; с помощью конкретных липкой конце cohesions выступы могут быть построены конечных наноструктур; Эта стратегия уменьшает нагрузку и стоимость конечных наноструктур. Одним важным преимуществом круговой наноструктур ДНК является урегулирование вторичной и третичной структуры молекул ДНК и их ключевых элементов, таких как Холлидей съезда от текстуры подробности одной кристаллической решетки. 1D, 2D и 3D наноструктур, построен из круговой модулей и их потенциального применения в биологии, медицине и нано Инжиниринг станет новым членом семьи Нанотехнологии ДНК в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы признательны за финансовую поддержку от NSFC (гранты № 91753134 и 21571100) и состояние ключа лаборатории биоэлектроника из Юго-Восточной университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
References
- Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
- Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
- Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
- Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
- Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
- Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
- Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
- Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
- Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
- Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
- Duckett, D. R., et al.
- Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
- Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
- Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579 (1985).
- Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).
