Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

İstikrarlı DNA motifleri, 1D ve 2D nanoyapıların küçük dairesel DNA molekülleri inşa

Published: April 12, 2019 doi: 10.3791/58744
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Bu makale T4 ligasyonu ve küçük dairesel DNA molekülleri tavlama, denaturing sayfa arıtma için detaylı bir protokolü sunar ve yerel sayfa analizi dairesel fayans, montaj ve AFM görüntüleme 1D ve 2D DNA nanoyapıların yanı sıra özel jel sonlu DNA nanoyapıların Elektroforez ve Santrifüjü arıtma.

Abstract

Bu makalede küçük dairesel DNA molekülleri, sentezi için detaylı bir protokol sunar besleme dairesel DNA motifleri ve 1 D ve 2D DNA nanoyapıların inşaatı. On yıl içinde DNA nanoteknolojisi hızla gelişmesi doğrusal DNA'lar kullanmak için kaynak malzemesi olarak atfedilir. Örneğin, DAO (crossover, antiparalel, garip yarım döner) döşeme iyi 2D DNA kafesler inşası için bir yapı taşı olarak bilinir; DAO çekirdek yapısı iki ipler bir sağ el büyükanne düğüm yapma gibi iki doğrusal tek iplikçikli (ss) oligonucleotides yapılmıştır. Burada, DNA fayans cDAO (eşleşmiş DAO) adı verilen yeni bir tür inşa edilir bir küçük dairesel ss-DNA'yı c64nt veya c84nt kullanarak (dairesel 64 veya 84 nukleotid) İskele iplikçik ve birkaç doğrusal ss DNA'lar zımba iplikçikler olarak olarak. Mükemmel 1D ve 2D nanoyapıların cDAO fayans monte: sonsuz nanowires, nanospirals, nanotüpler, nanoribbons; ve sonlu nano-dikdörtgenler. Detaylı iletişim kuralları açıklanmıştır: 1) hazırlık 3) Montaj yerel sayfa analiz, ardından 2) istikrarlı dairesel fayans, tavlama T4 ligaz ve arıtma sayfa (polyacrylamide Jel Elektroforez) küçük dairesel oligonucleotides denaturing tarafından sonsuz 1 D nanowires nanorings, nanospirals, sonsuz 2D kafesler nanotüpler ve nanoribbons ve sonlu 2D nano-dikdörtgenler, AFM (Atomik kuvvet mikroskobu) görüntüleme tarafından takip ettim. Basit, sağlam ve çoğu labs için ekonomik yöntemdir.

Introduction

DNA molekülleri on yıl içinde pek çok nanoyapıların oluşturmak için kullanılmaktadır. Tipik motifler içerir DAE (çift crossover, antiparalel, hatta yarı-döner) ve DAO fayans1,2,3, yıldız fayans4,5,6,7, tek (ss) fayans8,9,10ve DNA origami11,12,13telli. Bu DNA motifleri ve kafesler doğrusal ss-DNA'lar monte edilir. Son zamanlarda, biz ve diğerleri dairesel ss-oligonucleotides kullanımı motifleri, 1 D nanotüpler ve 2D kafesler14,15,16,17oluşturmak için iskele bildirdi. Holliday Kavşağı (HJ)18,19,20,21 c64nt ortasına de ekleyerek, bir çift iki eşleşmiş DAO döşeme kurulan17olabilir. Bu yeni cDAO motifi ve onun türevleri stabildir ve 2D montajı katı DNA 3 × 5 µm2kafesler. Bu yazıda, kullandığımız bir terim "dairesel çini", bir dairesel iskele ve ss-oligonucleotides doğrusal diğer zımba ile inşa istikrarlı bir DNA karmaşık molekül olarak tanımlanır ve başka bir terim olan doğrusal tam bir dizi inşa "doğrusal çini" SS-oligonucleotides.

Bu iletişim kuralı DNA nanoyapıların iskele olarak küçük dairesel DNA molekülleri ile beş çeşit oluşturmak gösterilmiştir: 1) sonsuz 1 D c64nt ve c84nt nanowires, 2) sonsuz 2D cDAO-c64nt-O ve cDAO-c64nt-E (-O temsil eden bir tek sayı 5 yarı-döner ve -E 4 yarı-turnike temsil bir çift sayı) Kafesler, 3) sonsuz 2D cDAO-c84nt-O ve cDAO-c84nt-E Kafesler, 4) sonlu 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O ve 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O dikdörtgenler, 5) sonsuz 1 D acDAO-c64nt-E nanorings ve nanospirals ( lütfen bakın Şekil 3-5 şematik çizimler ve DNA nanoyapıların yukarıdaki beş çeşit görüntüleri için). 1D c64nt ve c84nt nanowires her c64nt ve c84nt iskele iki doğrusal zımba ile sırasıyla ilişkili monte edilir. CDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt veya cDAO-c84nt dairesel her parçasına c64nt, c74nt veya c84nt dört doğrusal zımba ile ilgili kendi iskele üzerinden sırasıyla komplementer olan. Sonsuz 2D kafesler iki dairesel döşemeleri farklı ard arda geliş ile aynı tür gelen monte edilir. İki sonlu 2D dikdörtgen kafesler 32 dairesel alt döşeme iki kümelerinden sırasıyla monte edilir. Para kazanmak için sadece bir sıralı c64nt, c74nt ve c84nt kullanılır ilgili iskele farklı çıkıntılar 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt ve 20 cDAO-c84nt dairesel alt fayans sırasıyla ilk adımdaki alt döşeme tavlama, sonra tavlamak için kullanılır ise karşılık gelen 32 dairesel alt fayans karıştırın ve sonlu 5 × 6 cDAO-c64nt-O ve 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O Kafesler, sırasıyla montajı adım tavlama ikinci kafes uygulayın. Daha fazla para ve uğraşları mal olacak ancak kesinlikle, dairesel iskele farklı sıralı sonlu boyutu taşınımı, çeşitli birleştirmek için kabul edilebilir. Sonsuz 1D acDAO-c64nt-E nanorings ve nanospirals gelen bir sıralı asimetrik acDAO-c64nt fayans 4 yarı-döner çift sayıda doğrusal bağlantıları ile komplementer. CDAO-c64nt ve cDAO-c84nt, 4 ve 5 yarı-döner tek sayıda çift sayıda intertile mesafeler tarafından sırasıyla ayırt edilirler dairesel fayans sonsuz 2D kafesler monte için iki yaklaşım vardır. Eski tüm taşlar aynı şekilde hizalanmasını gerektirir; İkinci münavebe Helisel eksenler boyunca iki komşu fayans yüz gerektirir. Döşemeyi katı ve düzlemsel, cDAO-c64nt gibi her iki yaklaşımın düzlemsel nanoribbons oluşturur; döşemeyi cDAO-c84nt, 4 çift sayıda intertile bağlantı gibi bir yöne doğru kavisli ise yarım döner nanotüpler, oluşturmak 5 sayılı intertile bağlantı yarım sırayla düzlemsel nanoribbons ortadan kaldırılması nedeniyle üretecek eğri döşeme diğer hizalama eğriliği önyargılı büyüme. 1D ve 2D DNA nanoyapıların dairesel fayans üzerinden başarılı Meclisi bu yeni yaklaşımın birkaç avantajları gösterir: istikrar ve doğrusal fayans üzerinde dairesel fayans, kiral karoları asimetrik nanoyapıların Meclisi için sertlik gibi zorunlu nanorings ve nanoribbons, anlama DNA mekaniği ve moleküler yapıları, vbüzerinde yeni vizyonlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dairesel DNA'lar hazırlanması

  1. Doğrudan doğruya ezelî daha fazla arıtma ticari şirketler tarafından sağlanan tüm doğrusal DNA'lar kullanın.
  2. Tüpler altındaki tüm DNA parçaları toplamak 5 min için 5000 × g de DNA örnekleri santrifüj kapasitesi. DNA çözülmeye TE arabellek (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) uygun bir hacmi ekleyin.
  3. "A" ng/µL mikro UV Spektrometre 260 kullanarak her ss-DNA çözüm için konsantrasyon ölçmek nm. "B" µM için "a" ng/µL dönüştürmek b = × 103 / (DNA'ın molekül ağırlığı strand). TE eriyik-e doğru yapmak a 10 µM DNA hisse senedi eriyik miktarını belirleyin.
  4. T4 DNA ligaz 5'-fosforile doğrusal DNA şablonları ( şekil 1) c64nt, c74nt ve ticari şirketler doğrudan sağlanan c84nt 3' ve 5' ucuna bağlanmak için kullanın.
  5. 5'-fosforile doğrusal DNA dizisi (3,5 µM) ve onun karşılık gelen ateli DNA dizisi (4,5 µM) 200 µL PCR test tüpü1580 µL TE arabellekte karıştırın. 95 ° C su ile dolu bir açık termo şişe tüpte kuluçkaya. Sıcak su oda sıcaklığında (25 ° C) için yaklaşık 2-3 saat laboratuvar atmosfer altında sakin.
  6. 10 x T4 arabelleği (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DTT, 1 mM ATP) 10 µL ekleyin ve T4 ligaz (300 U/µL) son hacmi 100 µL. karışıma için 10 µL 16 saat 16 ° C'de bir thermocycler karışımı kuluçkaya
    Not: Yukarıdaki DNA konsantrasyonları ve ~ 100 µL tepki hacmi optimize edilmiş yüksek ligasyonu verimlilik ve doğru oligo-monomer cyclization yüksek verim için. İki veya daha fazla tüp ligasyonu reaksiyonların deneysel tasarım göre aynı zamanda çalıştırın. Bir alternatif kuluçka için ligasyonu değiştirmektir adım 1.6 4 saat 25 ° C'de yöntemdir
  7. Kuluçka sonra T4 ligaz 95 ° C su 5 minminutes için devre dışı bırakabilirsiniz. Sonra tüp bir buz su banyosu aktarmak ve 5 dakika soğuması kuluçkaya.
  8. 10 ben tampon eksonükleaz x 10 µL ve 10 µL eksonükleaz aktivitesi ekleyin ben (5 U/µL) çeliklerini karışıma ve tüp su banyosu için seçmeli olarak kalan doğrusal DNA'lar sindirmek ve circularized DNA'lar olduğu gibi bırakmak 30 dk içinde 37 ° C'de kuluçkaya.
  9. % 10 sayfa jel denaturing hazırlayın.
    1. Lastik eldiven ve gözlük duman başlıklı sayfa jel hazırlarken giymek. 6.67 mL %30 (w/v) Akrilamid/bisacrylamide çözeltisi (19:1), 2 mL 10 ekleyin x TAE· MG arabellek (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12,5 mM Mg(Ac)2), üre (7 M) ve son hacmi 40 mL santrifüj tüpü 20 mL deiyonize su 8.4 g.
      Dikkat: %30 (w/v) Akrilamid/bisacrylamide çözüm (19:1) çözüm zehirlidir.
    2. Tetramethylethylenediamine (TEMED) 20 µL ekleyin ve amonyum persülfat (APS, % 10 w/v) 40 ml 100 µL tüp transferden önce Jel Elektroforez sistemi çözümü hemen. 1,5 mm kalınlığında ve 10-iyi tarak yerleştirin. Jel çözüm katılaşmış kadar en az 20 dakika bekleyin.
    3. 85 × 80 × 1.5 mm bir jel için 80 V sabit voltaj ayarla3 (genişlik × yükseklik x kalınlık). 1 x TAE· Ekle MG arabelleğe Elektroforez Sistemi ve prerun jel 10 V/cm 20 dk için.
  10. PCR test tüpü içinde adım 1.8 95 koymak ° C su eksonükleaz devre dışı bırakabilirsiniz için 5 dakika ben. Sonra tüp bir buz su banyosu aktarmak ve başka bir 5 min için kuluçkaya.
  11. Formamide 20 µL tüp 140 µL son bir birime ve çözüm karıştırın. 7-9 denaturing sayfa jel Wells'le aynı derecede 16-20 µL her jel için çözüm de dağıtın. Mix 2 µL boya (% 0.05 bromophenol mavi, % 0.05 Ksilen cyanol FF, % 60 gliserol, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7,6) ile ilgili öncü doğrusal DNA'ın 8 µL yükleme (10 µM) ve başvuru için ayrı iyi karışımı enjekte.
    Not: Formamide ek sayfa jel altına de batan için yükleme çözümü yoğunluğunu artırmak için ve ayrıca DNA artıkları bazı çift ilişkisini kaldırmak zor durumda.
  12. Yaklaşık 2 saat için jel 10 V/cm çalıştırın ve Ksilen cyanol FF cam levha çıplak gözle 2/3 konumunda olduğunda Koşmayı bırakın.
  13. Lastik eldiven ve gözlük deri ve gözleri korumak için giyin. Cam levha dışarı jel al. Jel bir floresan TLC (ince tabaka Kromatografi) tabağa yerleştirin. Hedef jel bantları bir jilet tarafından kesin olarak tam olarak UV ışınlama (Şekil 2) tarafından gölgeli.
    Dikkat: UV ışık gözleri ve derileri için zararlıdır.
    Not: Altında UV ışınlama 254, nm, DNA ışığı absorbe ederek TLC plaka üzerine bir gölge düşürdü. Dairesel DNA karşılık gelen habercisi doğrusal DNA'sının göre biraz daha yavaş koştu. Eğer onlar toplanan bazı sindirilmemiş doğrusal DNA'lar ve gölgeli hedef grubu çevreleyen küçük miktarlarda istenmeyen dairesel DNA'lar dairesel DNA kirleten.
  14. Jel bantları 2.0 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Hava kuru veya darbe jel bantları kuru ve jelleri bir hamur içine bir spatula veya düzleştirilmiş cam çubuk ile püre. Jel tamamen dairesel DNA yüksek verim için kritik bir hamur içine ezilmiş emin olun. İki kez jel birim deiyonize su tüpün içine ekleyin ve tüp oda sıcaklığında gecede sallamak.
  15. Supernatants 2.0 mL microcentrifuge tüp içinde toplamak için karışımı filtre. Herhangi bir kalıntı DNA küçük hacmi deiyonize su ve tekrar supernatants birleştirmek için filtre durulama tarafından yeniden elde etmek.
  16. N-butanol eşit hacmi ile eluent ayıklayın. Sulu cilt için yaklaşık 200 µL azalır kadar bu yordamı yineleyin.
  17. Mutlak etanol (−20 ° C) 500 µL ekleyin ve 3 M NaOAc (pH 5.1) DNA yağış için karışıma 20 µL. Tüp −20 ° C 30 dk için saklayın.
  18. Tüp, 12.000 × g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi, süpernatant atın. Kalan DNA çökelti tüp içinde yaklaşık 100 µL var.
  19. 600 µL % 75 etanol (−20 ° C) tüp eklemek ve −20 ° C 30 dk için saklayın. O zaman 4 ° C'de 10 dakika için 12.000 × g, santrifüj süpernatant atmak. Kalan DNA çökelti yaklaşık 100 µL tüp tekrar çözümdür. İki kez yordamı yineleyin.
  20. Son Santrifüjü sonra süpernatant mümkün olduğu kadar atın. Kuru vakum yoğunlaştırıcı ile kalır.
  21. Mağaza arıtılmış dairesel DNA tüp −20 ° C.
  22. Bir 10 µM dairesel DNA stok çözüm adımı gerektiğinde 1.3 göre yapmak TE arabellekte dairesel DNA resuspend.

2. montaj çözümleri, tavlama

  1. Her döşeme veya nanostructural derleme çözüm c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt ve acDAO-c64nt-E doğrusal ve dairesel DNA'lar tasarlanmış bir dizi ile bir pot tavlama için hazırlayın.
    1. Her birleştirme çözümü için 10 2 µL mix x TAE· MG tampon, doğrusal ve dairesel iplikçikleri eşit molar oranları ve 200 µL PCR tüp bebek son konsantrasyonu 0.5 µM ve son hacmi 20 µL. her Strand ek TE arabellekte bir dizi her DNA hisse senedi çözeltinin 1 µL derleme çözümde tavlama bir 25 ° C 48 h üzerinden termo biberondan 95 ° c.
  2. Doğrusal ve dairesel DNA'lar tasarlanmış bir dizi cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E ve cDAO-c84nt-O 2D sonsuz kafesler her birleştirme çözümü iki aşamalı tavlama için hazırlayın.
    1. Her öncül alt döşeme derleme çözüm 10 2 µL karıştırılarak hazırlamak x TAE· MG tampon, eşit molar oranları doğrusal ve dairesel lifler ve 200 µL PCR test tüpü 0.5 µM her strand için son bir konsantrasyon ve son hacmi 20 µL ek TE arabellekte bir dizi her DNA hisse senedi çözeltinin 1 µL. İlk alt döşeme tavlama adımda her öncül alt döşeme çözümünde bir hızlı doğrusal soğutma 95 ° c ila 25 ° C 2,5 h üzerinden yöntemiyle bir PCR thermocycler tavlama.
    2. Yukarıdaki dört sonsuz kafesler her birleştirme çözümü her iki karşılık gelen alt döşeme çözümleri birlikte her strand için 0.25 µM son bir konsantrasyon için 10 µL karıştırarak hazırlayın. Adım tavlama ikinci kafes içinde 50 ° C 2 h için kaldıkları ve 20 ° c, yaklaşık 24 h Toplam 5 dakika başına 0.1 ° C oranında soğutma yavaş soğutma yöntemi kullanarak bir PCR thermocycler 20 µL karışımı tavlamak.
      Not: İki paralel deney aynı anda veya daha sonra ikinci tavlama adımda 2D her sonsuz kafes için çalıştırabilirsiniz.
  3. Montaj çözümleri, 5 × 6 cDAO-c64nt-O ve 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O iki sonlu dikdörtgen derleme iki aşamalı tavlama için hazırlayın.
    1. Her öncül alt döşeme derleme çözüm 10 1 µL karıştırılarak hazırlamak x TAE· MG tampon, 0.5 µL her DNA hisse senedi çözümünün eşit molar oranları doğrusal ve dairesel lifler ve 200 µL PCR test tüpü 0.5 µM her strand için son bir konsantrasyon ve son hacmi 10 µL ek TE arabellekte bir dizi. İlk tavlama adımda her öncül alt döşeme çözümünde bir hızlı doğrusal soğutma 95 ° c ila 25 ° C 2,5 h üzerinden yöntemiyle bir PCR thermocycler tavlama.
    2. 32 x (her alt döşeme çözümünün 2 µL) ~ 15 son bir konsantrasyon için 200 µL PCR test tüpü içinde birlikte karıştırılarak her sonlu dikdörtgen kafes derleme çözüm hazırlamak nM her alt döşeme ve 64 µL son hacmi için. İkinci tavlama adımda 50 ° C 2 h için kaldıkları ve 20 ° c, 5 min başına 0.1 ° C oranında toplam yaklaşık 24 saat soğutma yavaş soğutma yöntemi kullanarak bir PCR thermocycler 64 µL karışımı tavlamak.
      Not: Beş paralel deneyler aynı anda veya daha sonra ikinci tavlama adımda her sonlu dikdörtgen derleme için çalıştırabilirsiniz.

3. yerel sayfa analizi

  1. Bir % 10 yerli sayfa hazırlamak aşağıda adım 1.9 üre bileşeni dışında.
  2. Denetim örnekleri için c64bp ve c84bp, her derleme çözümünün 2 µL ve boya 3 µL TE arabelleği için ayrı ayrı denetimler olarak yükleme 1 µL ekleyin. Her şekil 3' te listelenen diğer derlemeler için her derleme çözümünün 1 µL ve boya 4 µL TE arabelleği için yükleme 1 µL ekleyin.
  3. Her biri bir jel için yukarıdaki çözümler de enjekte et. 5 µL DNA işaretçisini (25-500 bp) başvuru için ayrı bir de ekleyin.
  4. Yaklaşık 4 saat 10 V/cm bir buzlu su banyosunda jel çalıştırın. Ksilen cyanol FF cam levha dışarı çalışır.
  5. Lastik eldiven ve gözlük deri ve gözleri korumak için giyin. Jel cam levha dışarı almak ve 100 mL deiyonize su ile bir nükleik asit jel leke için 30 dk 10 µL bırakın.
    Dikkat: Nükleik asit jel leke çözüm zehirlidir.
  6. Jel görüntüleme sistemi bir UV altında gözlemlemek ve lekeli jel (şekil 3) bir resmini çek.

4. arıtma sonlu kafesler

  1. Yerel bir % 2 özel Jel Elektroforez arıtma sonlu kafesler için hazırlayın.
    1. Özel toz, 5 mL 10 1 g mix x TBE· MG arabellek (89 mM Tris, 89 mM Borik asit, 2 mM EDTA, pH 8.0, 12,5 mM Mg(Ac)2), nükleik asit 2 µL jel leke ve 47,5 mL deiyonize su 250 mL üçgen şişede. Baloncuklar haline kadar küçük ve yoğun karışımı kaynatın. Sıcak su şişe 50 mL toplam hacmi ve % 2 özel bir konsantrasyon ekleyin.
    2. Kalın eldiven giymek. Jel çözüm 7 x 10 x 1 cm3 (genişlik × uzunluk × kalınlık) plastik jel şişe içine dökün. 1.5 mm kalınlığında ve 12-iyi jel tarak yerleştirin. Jel oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Gerekirse, jel 4 ° C buzdolabına koyun.
      Dikkat: çözüm çok sıcak olduğundan haşlanmaya unutmayın.
    3. 0.5 x TBE· Ekle Elektroforez Sistemi mg arabellek. 5 V/cm 50 V sabit voltaj adlı bir buzlu su banyosunda 20 dk için jel prerun.
    4. Her özel jel 2.3 adımda iyi hazırlanmış sonlu kafes çözüm 20 µL enjekte ve 5 µL DNA işaretçisini (100-3000 bp) için ayrı bir de ekleyin. Bir buzlu su banyosunda 5 V/cm 2 h için jel çalıştırın.
    5. Lastik eldiven ve gözlük deri ve gözleri korumak için giyin. Hedef grup UV ışık ve onları içine adet ince ve bir filtre sütun8içine ezilmiş jelleri koyun dilim altında 1000 bp marker için benzer bir pozisyonla jel kes.
    6. 2.000 x g 4 ° C'de 5 min için adresindeki sütun santrifüj kapasitesi Örnek çözümü üzerinden sütun ayıklayın. AFM görüntüleme için çözüm toplamak.
  2. Sonlu kafesler PEG yağış tarafından arındırmak.
    1. Adımda hazırlanan sonlu kafes çözüm mix 50 µL 2.3 ile eşit bir güç (w/v) % 15 PEG8000 tampon (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 mM EDTA ve 505 mM NaCl)22. Belgili tanımlık eriyik vasıl 18.000 × g 30 dk için 4 ° C'de santrifüj kapasitesi.
    2. Süpernatant kaldırın ve PEG arabelleği 100 µL ekleyin. Santrifüjü yineleyin.
    3. Süpernatant kaldırdıktan sonra Pelet 1 çözülür x TAE· AFM görüntüleme için mg arabellek.
      Not: Arıtma sonlu kafesler 5 × 6 cDAO-c64nt-O ve 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O AFM görüntüleme ve diğer uygulamalar için gereklidir. Verim çok düşükse, Santrifüjü hızını artırmak. Ürün yeterince saf değilse, 4.2.2 adımları yineleyin.

5. AFM görüntüleme

  1. C64nt nanowire, c84nt nanowire, acDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-E(O) ve cDAO-c84nt-E(O), sonsuz 2D örgüleri 2 μL tavlanmış örnek bir taze i ciddi Mika yüzey üzerinde Kasası. DNA Kafesler, adsorpsiyon için için 2 dk Mika yüzeye bırakın. İki kez 100 µL deiyonize su ile yüzey yıkama ve basınçlı hava kuru.
  2. Sonsuz DNA kafesler hava görüntülerini AFM modu dokunarak altında üçgen AFM probları ile Mika yüzey tarayarak elde edilir. Tarama için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: tarama boyutu 0.5 ~ 5 mikron, tarama çözünürlüğü 512 satırlarının ve tarama hızı 3.5 Hz (şekil 4).
  3. 5 × 6 sonlu DNA kafesler için cDAO-c64nt-O ve 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-Hayır, mevduat 1 80 µL x TAE· MG arabellek bir taze i ciddi Mika yüzey üzerinde. Daha sonra 5 µL sonlu örnek arabellek içine ekleyin. DNA Kafesler, adsorpsiyon için için 2 dk Mika yüzeye bırakın. 1 başka bir 50 µL ekleyin x TAE· MG arabellek AFM sonda üzerinde.
  4. Sonlu DNA kafesler sıvı görüntülerini AFM modu dokunarak altında üçgen AFM probları ile Mika yüzey tarayarak elde edilir. Tarama için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: tarama boyutu 0.5-1 µm, tarama çözünürlüğü 256 satırlarının ve tarama hızı 1,5 Hz (şekil 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dairesel DNA jel lifleri23,24,25' habercisi doğrusal DNA'sının gözenek dairesel DNA içinde nüfuz çünkü sayfa (Şekil 2) denaturing ve geri zekalı göre biraz daha yavaş hareket eder. Oligo-monomer cyclization doğru ligasyonu tepki verimliliği bağlıdır yüzey sıra ve konsantrasyon, reaksiyon ısısı, zaman, vb. Bir öncü konsantrasyon doğrusal DNA yaklaşık 3,5 µM, cyclization ürünler c64nt (veya c84nt) yeterince yüksek ve bu protokol habercisi başvurusunda olabilir doğrudan UV ışığı altında TLC plaka bantlarında olarak ölmeden gölgeli. Dairesel DNA bantları belirsiz ya da görünmez, tüp ligasyonu reaksiyon ya da bir çok düşük ürün verim, başarısızlık gösteren varsa. Bazen doğru oligo-monomer ring dışında bir ek oligo-dimer yüzüğü atıfta doğrusal öncü grup yukarıda iki grup vardır. Sadece daha yüksek bantları rahat bırak ve daha düşük olanlar toplamak. Arıtılmış dairesel DNA ürünler vakum kurutma sonra tüp içinde beyaz toz olarak görülebilir. Denaturing sayfa dışında DNA saflık UV Spektrometre ile ölçülebilir. 260 DNA emilimi en yüksek olan nm. DNA saflık için iki standart ölçütleri 1.8 280 nm/260 nm Absorpsiyon oranı ve 280 nm/230 nm 2.0-2,2 aralığında genellikle vardır. Yukarıdaki iki oranları standart değerleri saparsanız, kalıntıları tekrar aşağıdaki adımları 1.18-1,20 tarafından çıkarılan. C64nt ve c84nt doğru oligo-monomer cyclization için verimi Bu protokole göre % 30-60 mesafeden ölçülür.

Yerel sayfa çözümlemesi sağlayan motifi'nın istikrar, saflık, sertlik, monomer veya polimer, derleme modu hakkında bilgi bir sürü vb (şekil 3). C64bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, cDAO-c64nt ve acDAO-c64nt c64nt derleme ailelerinin tek bir açık ve temiz grubu temsil eden her bir derleme için var onlar istikrarlı monomer motifleri vardır. HJ-c84nt, tHJ-c84nt ve cDAO-c84nt fayans c84nt derleme ailelerinin onların ana grup Hedef monomer motifleri dışında küçük yan ürünleri gösteren, çevresinde smear varken. Yanlış ortakları küçük yan ne olursa olsun, yüksek verim ile mükemmel cDAO-c84nt-O (E) kafesler monte edilebilir. Açık ve temiz Elektroforez görüntü almak için yükleme hacmi en fazla 10 µL olmalı ve DNA miktarı 0,01 olmalıdır ~ 0.02 µg/mL.

Deneyler başarısı sonunda AFM tarafından (şekil 4 ve şekil 5) görüntüsü 1 D ve 2D DNA nanoyapıların tarafından değerlendirilir. Her derleme mikrometre ölçekte nanowires, nanotüpler, nanospirals, nanoribbonsgibi kendi morfolojik özelliklere sahiptir. Ayrıca, DNA derlemeler nanometre ölçeğinde detaylı dokular teorik dairesel kiremit boyutlarının korelasyon ve organizasyon modları çok iyi sırasıyla anahtar başarılı ve doğru montaj doğrulanması için vardır. Bu nedenle, mikrometre ve nanometre ölçekler panoramik ve yüksek çözünürlüklü AFM Albümdeki alınması gerekir. Seçimler AFM yöntemleri ve probları yüksek kaliteli AFM görüntüler için büyük önem taşımaktadır. Tarama kuvvet küçük 50 pN26olarak ayarlanmalıdır. Tarama kuvvet çok büyük ise, DNA nanostructural desenleri zedeleyecek. Çevre temizlik sıvı temiz ve güzel yüksek çözünürlüklü AFM görüntü almak için başka bir anahtar parametresidir. Tüm arabellekleri 0,22 µm filtre tarafından filtre gerekir; sonda tutucu ve cımbız deterjan tarafından yıkanmış ve deiyonize su ile durulanır. Çevre tarafından partikül enkaz kirli, sonda ipucu zarar görmüş veya böylece AFM görüntü kalitesini etkileyen arabellek, parçacıklar tarafından sarıldı.

Figure 1
Resim 1 . Dairesel DNA sentezi. Akış Diyagramı nasıl mavi uzun 5'-fosforile doğrusal Oligonükleotid dairesel bir DNA molekülü geliştikçe temsil eder. İki kısa kırmızı lifler ateli oligonucleotides temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . DNA cyclization ürünleri UV ölmeden ışığı altında denaturing sayfa fotoğrafı. Bir öncü doğrusal 64nt DNA'sı kadar sol lane ve cyclization ürünleri, dairesel 64nt (c64nt) DNA 9 bantları, aynı yatay olarak diğer 9 yolları düzeyi görünür grubudur. C64nt 9 bantları dairesel DNA'lar soyutladığı için kesilecektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Ölen ve şematik çift sarmallı modelleri dairesel döşeme sonra yerel sayfa fotoğraf. C64nt nanowire ve c84nt nanowire her iki polimerler iki nokta yukarıdaki hizalandığı içinde onların basit katlama birimi hücreleri tarafından temsil edilen ve her birim hücre dikey olarak en fazla birim hücre sonsuz hizalamasını belirtmek ve aşağı, arasında eşit uzaklıklarda ile Dubleks formu nanowires için. Monomer dairesel fayans, c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt ve tHJ-c84nt içinde A) hiçbir çıkıntılı çıkıntılar yüzüklerini, dışarı cDAO-c64nt, acDAO-c64nt ve cDAO-c84nt içinde B) hem künt uçlu 10 bp çıkıntılar sırasıyla var ise var. Dizileri, DNA dizileri tablo için bakınız. Bu rakam önceden yayınlanmış şekil17değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Havada taranmış AFM görüntüleri tipik 1D ve 2D sonsuz DNA derlemeler. A) c64nt nanowire, B) sonsuz acDAO-c64nt-E, C) sonsuz cDAO-c64nt-E, D) sonsuz cDAO-c64nt-O, E) sonsuz cDAO-c84nt-E ve F) sonsuz cDAO-c84nt-O sonun uyum ile komplementer. Tüm doku bu AFM görüntüler organizasyon modları çok iyi ve döşeme boyutunu doğrultusunda ayrıntılardır. Dizileri, DNA dizileri tablo için bakınız. Bu rakam önceden yayınlanmış şekil17değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Sıvı taranmış AFM görüntüleri sonlu dikdörtgen derlemeler. A) 5 × 6 cDAO-c64nt-O 32 cDAO-c64nt alt fayans ve B) 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O oluşmaktadır sonlu dikdörtgen Meclisi 12 cDAO-c74nt ve 20 cDAO-c84nt alt fayans oluşmaktadır. Dizileri, DNA dizileri tablo için bakınız. Bu rakam önceden yayınlanmış şekil17değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo DNA dizilerinin. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makale odak küçük dairesel DNA molekülün sentez ve DNA nanoyapıların Meclisi sunulan iletişim kuralları. Rasgele sıralı DNA tasarımlar çoğunu bu protokol için kullanılabilir. Dairesel DNA'lar saflığı DNA derlemeler başarısı için önemlidir. Cyclization üretim verimini doğrusal DNA 5'-fosforile konsantrasyonu azaltarak geliştirilebilir; Ancak, bu dairesel DNA'lar aynı miktarda üretmek için iş yükünü artırır. Ateli DNA iplikçikleri uzunluğunu da doğru ligasyonu tepki etkiler, yaklaşık 20 nükleotit için optimize edilmiştir hem c64nt hem de c84nt için uzun.

Magnezyum katyonlar uygun bir konsantrasyon (örn., 12,5 mM) sırasında çözümünde ve sonra derleme oluşumu ve DNA nanoyapıların bakımı için önemlidir. Böylece, 12,5 mM bir magnezyum ba * konsantrasyon her zaman tavlama işlemleri sırasında tutulur, yerel sayfa, özel Jel Elektroforez ve PEG arabellek Santrifüjü purifications, AFM görüntüleme, vs.

PEG arabellek Santrifüjü arıtma DNA nanoyapıların doku ayrıntılarını zarar verir iken 5 × 6 cDAO-c64nt-O ve 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O sonlu dikdörtgen derlemeler için özel jel arıtma doku ayrıntıları etkilemez yüksek çözünürlüklü AFM görüntüler.

İstikrar yarar ve sertlik dairesel döşeme çok iyi organize edilmiş üretmek daha kolaydır ve büyük boyutlu tek kristal 2D doğrusal fayans ve scaffolded origami9,11, dairesel modüllerden rağmen kafesler ekstra iş sentez ve dairesel DNA molekülleri arındırmak için gereklidir. Aynı çekirdek yapısı olarak tek bir dairesel DNA ile birçok dairesel modüller ile farklı çıkıntılar oluşturulabilir; çıkıntılar belirli sonun cohesions aracılığıyla sonlu nanoyapıların inşa edilebilir; Bu strateji iş yükünü ve sonlu nanoyapıların maliyetini azaltır. Dairesel DNA nanoyapıların bir önemli avantajı ikincil ve üçüncül yapılar DNA moleküllerinin çözünürlüğe ve onların temel unsuru Holliday bağlantısı üzerinden tek kristal örgüleri doku ayrıntılarını gibi olması. 1D 2D ve 3D nanoyapıların dairesel modülleri ve Biyoloji, tıp ve nano-mühendislik potansiyel uygulamalarında oluşturulan DNA nanoteknolojisi yeni bir aile üyesi gelecekte olacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

NSFC (hibe No 91753134 ve 21571100) ve devlet anahtar laboratuvar Bioelectronics, Güneydoğu Üniversitesi finansal destek için sana şükrediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
  6. Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
  7. Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
  8. Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
  9. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  10. Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
  11. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  12. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  13. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  14. Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
  15. Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
  16. Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
  17. Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
  18. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
  19. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1 (1), 157-181 (1990).
  20. Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
  21. Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
  22. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  23. de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
  24. Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579 (1985).
  25. Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
  26. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).

Tags

Kimya sayı: 146 DNA dairesel DNA Holliday bağlantısı DNA nanoteknolojisi dairesel kiremit Polyacrylamide Jel Elektroforez Atomik kuvvet mikroskobu
İstikrarlı DNA motifleri, 1D ve 2D nanoyapıların küçük dairesel DNA molekülleri inşa
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J.… More

Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J. Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules. J. Vis. Exp. (146), e58744, doi:10.3791/58744 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter