Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere musen peritoneal makrofag fagocytose ved hjælp af forbedrede grønne fluorescens protein-udtrykker Escherichia coli.
Abstract
Dette manuskript beskriver en simpel og reproducerbar metode for at udføre en fagocytose assay. Den første del af denne metode indebærer etablering af en pET-SUMO-EGFP vektor (SUMO = lille ubiquitin-lignende modifier) og give udtryk for forbedret grønne fluorescens protein (EGFP) i Escherichia coli (BL21DE). EGFP-udtrykker E. coli er coincubated med makrofager i 1 timer ved 37 ° C; negativ kontrolgruppen er udruget på is i den samme mængde tid. Makrofager er klar til vurdering. Fordelene ved denne teknik omfatter dens enkel og ligetil trin, og fagocytose kan måles ved begge flow forskellige og fluorescens mikroskop. EGFP-udtrykker E. coli er stabil og vise en stærk fluorescens signal, selv efter makrofager er rettet med PARAFORMALDEHYD. Denne metode er ikke kun egnet til vurdering af makrofag cellelinjer eller primære makrofager in vitro- men også egnet til evaluering af granulocyt og monocyt fagocytose i perifert blod mononukleære celler. Resultaterne viser, at peritoneal makrofager fra unge (otte uger gamle) mus fagocyterende kapacitet er større end makrofager fra alderen (16-måned-forhenværende) mus. I Resumé, denne metode måler makrofag fagocytose og er velegnet til at studere funktionen medfødte immunsystem.
Introduction
Makrofag fagocytose assays bruges ofte til at studere det medfødte immunforsvar. Det medfødte immunforsvar kan indikere modtagelighed for infektion. Makrofag cellelinjer er meget udbredt i immunologi undersøgelser. Men den udvidede passage kan medføre tab af genet og kompromitteret immun funktioner i disse cellelinjer. De primære peritoneal makrofager er derfor det ideelle objekt i at studere celle funktion1.
Selv om den medfødte immunforsvar var menes at være intakt i alderen kroppen, kan fagocyterende evnen falde i forhold til, at i den yngre krop2,3. Her vil vi vise en metode til at vurdere fagocytose af peritoneal makrofager fra young (otte uger gamle) og alderen (16-måned-forhenværende) mus ved hjælp af EGFP-udtrykker E. coli, som er nem, hurtig og økonomisk gennemførlig.
Brug af en EGFP-udtrykker E. coli -stamme er en af fordelene ved denne analyse, fordi disse bakterier er stabil og vise en stærk fluorescens signal, selv efter makrofager fastsættes ved 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD. Derudover ved hjælp af de EGFP udtryk for E. coli, forskerne behøver ikke yderligere farvning efter fagocytose, hvilket sparer tid. Makrofager er desuden immunoresponsive for E. coli overflade antigen, hvilket gør E. coli mere velegnet til fagocytose assay end ved hjælp af EGFP-udtrykker svampe eller fluorescein-mærket perler.
Med EGFP-udtrykker E. coli, kan en fagocytose assay nemt udført i 2 h og målt af begge flow flowcytometri og Fluorescens mikroskopi, afhængigt af forskerens formål. Da denne metode måler direkte fagocyterende evne, er resultaterne mere reproducerbare end andre indirekte metoder.
Denne metode er også blevet valideret i en RAW264.7 cellelinje og humant perifert blod mononukleære celler4. Nedenstående tekst giver detaljerede trinvise instruktioner til at udføre denne analyse og fremhæver de kritiske faser, som forskerne kan ændre for at opfylde behovene hos deres eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført under de nationale institutter sundhed retningslinjer for pleje og brugen af forsøgsdyr, og protokollerne, der blev godkendt ved Animal Care og brug Udvalget af Dalian medicinske universitet. Seksten-måned-forhenværende (med en kropsvægt på 30-35 g) og otte uger gamle (20-25 g) SPF (specifikke-patogen-fri) mandlige C57BL/6 mus blev indhentet fra SPF dyr midt i Dalian medicinske universitet. Alle mus blev holdt i dyr bolig med adgang til mad og vand ad libitum. Temperaturen blev holdt ved 20-24 ° C, luftfugtigheden var 40% - 70%, og belysningen var 12 h lys/12 h mørke. Dyr fik lov til at acclimate til miljøet for mindst 7 dage før forsøget.
1. opførelse af pET-SUMO-EGFP plasmid og induktion af EGFP udtryk
- Syntetisere EGFP gen fragment (en 717 bp sekvens syntetiseret af en brugerdefineret gen syntese service, se Tabel af materialer og supplerende fil 1 for sekvensen) og forstærke fragment med fremad primer ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') og vende primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), ved hjælp af high-fidelity Taq DNA polymerase.
- For at sikre, at polymerase kædereaktion (PCR) produkter har enkelt 3' adenin udhæng for TA kloning i det næste trin, skal du bruge filtypenavnet 30 min ved 72 ° C, efter sidst cyklus (Se supplerende fil 1 til PCR betingelser). Kontrollere PCR produkt ved agarosegelelektroforese gelelektroforese.
- Klon PCR-produktet i den pET-SUMO vektor (Se Tabel af materialer) ved hjælp af TA kloning metode5 med T4 DNA ligase. Inkuber reaktion ved stuetemperatur (20-25 ° C) i 30 min. Vektoren er lineariseret mellem nukleotider 653 og 654 med en 1 bp 5 ' T-udhæng på hver enkelt linje.
- Omdanne ligatur produkt til den kemisk kompetente BL21(DE) E. coli -stamme som følger: Tilsæt 5 µL (100 ng) af PCR produkt til 100 µL af BL21(DE) kompetente celler via varme chok på 42 ° C til 90 s; holde blandingen på is i 3 min, og derefter tilføje 400 µL af lysogeny bouillon (LB) medium forvarmes ved 37 ° C, ryster det i 1 time ved 37 ° C og 120 rpm.
- Podes 100 µL af bakterier på overfladen af en LB-kanamycin (100 µg/mL) plade med inducer laktose (0,5 mmol/L), giver EGFP udtryk stamme. Inkuber plade ved 37 ° C natten over.
Bemærk: Hvis EGFP udtrykkes med succes, nogle kolonier kan iagttages som glødende grønt lys i mørke.- Du kan vælge kolonier til at kontrollere den indsatte EGFP fragment af DNA-sekventering. Primere for DNA-sekventering er: fremad, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; omvendt, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
- Podes en positiv koloni i 5 mL af LB medium med 100 µg/mL kanamycin. Inkuber i et 37 ° C ryster inkubator ved 120 rpm i 2 timer, og derefter tilføje inducer laktose til en endelig koncentration på 0,5 mmol/L og fortsætte med at ryste for 6 h, inducerende EGFP udtryk. Empirisk, når ryste for 6 h, den optisk tæthed på 600 nm (OD600) kan nå 0,7 eller højere.
- Tilsæt 10 µL af det bakterielle næringssubstratet på et dias, dække det med en coverslip og undersøge udtryk for EGFP under en inverteret fluorescens mikroskop. EGFP udtryk for bakterierne kan gemmes i medium ved 2-8 ° C i flere uger.
2. med musen peritoneal makrofag isolation og primære kultur
- Tilsættes 3,5 g thioglycolate til 100 mL med destilleret vand og autoklave blandingen til sterilitet før brug. Pumpe thioglycolate medium ind i 1 mL sterilt sprøjten i hætten peritoneal injektionsvæske mus. Brug en mus per sprøjte til at undgå infektion. Brugen af thioglycolate kan øge antallet af makrofager. De residente peritoneal makrofager kan isoleres uden thioglycolate men med lavere makrofag udbytter.
- Bedøver musen ved hjælp af en metode, der er godkendt af de lokale dyrs pleje og brug udvalget. Indsprøjte 1 mL af 3,5% thioglycolate medium i musens bughulen med 1 mL sprøjte, ved hjælp af en 23 G nål.
Bemærk: Ved at inducere anæstesi, peritoneal injektion kan udføres nemt og reducerer risikoen for skader på de indre organer forårsaget af injektion. - Opretholde mus med vand og mad ad libitum i 3 dage. Overvåge legeme vægt og mad indtag af dyret hver dag. Hvis kroppen vægttab er større end 10% inden for 3 dage, udelukke dyret fra eksperimentet.
- Efter 3 dage, aflive mus af cervikal dislokation efter hurtigt inducerende anæstesi af Sevofluran i en lukket boks. Alternativt kan du bruge en metode, der er blevet godkendt af de lokale dyrs pleje og brug udvalget at aflive mus.
- Sætte musen i et fad (med en 10 cm i diameter) med 75% ethanol til at sterilisere, og overføre det hurtigt til emhætten. Placer musen på en plade og fastgøre den forreste pote til bestyrelsen til at lave muss holdning.
- Ved hjælp af en 5 mL sprøjte knyttet til en 20 G tilføre kanyle, placere nål facetten op på en vinkel på 30° - 40°, 5 mL koldt (4-10 ° C) fosfatbufferet saltopløsning (PBS) på underlivet musens bughulen, undgå punktering tarmen. Hvis tarmen (eller ethvert andet organ) er punkteret, kan musen og dens celler ikke længere bruges til eksperimenter, som dette kan aktivere celler, ikke der egner sig til primære cellekultur.
- Udfør en blid massage på de to sider af musens maven. Derefter Aspirér væsken langsomt og forsigtigt. Dispensere peritonealvæske i et 50 mL-centrifugerør. Gentag disse trin 2 x eller 3 x.
- Der centrifugeres de suspenderede celler i 10 min på 400 x g i en nedkølet centrifuge (4-8 ° C). Supernatanten og resuspenderes celle i RPMI 1640 medium med 10% føtal bovint serum (FBS). Tælle cellerne. Empirisk, er celle tæthed cirka lig med 5 x 106 celler/mL, når cellerne er genopslemmes i 10 mL af medium.
- Tilføj 5 x 106 celler i hver brønd med en 6-godt plade for flow flowcytometri assay og 5 x 105 celler pr. brønd i en 24-godt pladen for et fluorescens mikroskop. Kultur celler ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator natten over. Næringssubstratet kan opdateres efter 3 h til at fjerne nonadherent celler, fordi de fleste af disse er lymfocytter. De vedhængende celler er hovedsagelig makrofager, og de kan holde sig godt til væv-kultur-behandlet plast.
3. makrofag fagocytose analyse ved hjælp af fluorescens mikroskop
- Observere celler under en lysfelt mikroskop til at evaluere cellernes levedygtighed og celle tæthed.
- Fjerne næringssubstratet fra 24-godt plade. Tilsæt 100 µL af frisk næringssubstratet og 10 µL af bakteriel suspension (ca 2 x 107 celler) i hver brønd, som beskrevet i tabel 1. Inkuber i 1 time i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Forsigtigt vaske 3 x-5 x med 500 µL koldt PBS pr. brønd udviske noninternalized bakterier.
- Inkuber celler med 4% formaldehyd i PBS ved stuetemperatur i 30 min.
- Vaske de faste celler 3 x med PBS (500 µL/brønd).
- Tilføje 200 µL af phalloidin 633 fluorescens dye konjugeret brugsopløsning (Se Tabel af materialer) at plette F-actin. Butikken i et mørkt, fugtigt sted (60-80%) ved stuetemperatur for 60 min. Skyl celler 3 x med PBS (500 µL/brønd) til at fjerne eventuelle overskydende phalloidin. Ved farvning F-actin, cytoplasma kan skitseres og bidrage til at skelne de internaliseret bakterier.
- Tilføje 200 µL af DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) brugsopløsning (1 µg/mL) til pletten cellekernen og Inkuber i 5 min i et mørkt, fugtigt sted ved stuetemperatur. Skyl 1 x med PBS (500 µL/brønd) og 1 x med den samme mængde destilleret vand. Så bliver cellerne klar til observation i en inverteret fluorescens mikroskop.
4. makrofag fagocytose analyse ved hjælp af flowcytometri
- Minimere de eksperimentelle fejl og foretage en korrekt fortolkning af resultaterne, indstille grupperne og kontrollere rør for eksperimentet, som anført i tabel 2.
- For kontrolgruppen, som vil blive lagt på is (gruppe 4 i tabel 2), fjerne medium fra 6-godt-plade og vask det 1 x med PBS. Derefter tilsættes 1 mL af 70 mM kolde EDTA i brønden at frigøre cellerne og overføre dem til flow flowcytometri tube. Tilsæt 50 µL af bakteriel suspension i røret og placere den på køl i 1 time.
- For de andre grupper, fjerne næringssubstratet. Der tilsættes 1 mL af frisk medium til hver brønd. Tilsæt 50 µL af bakteriel suspension i brønd ifølge indstillingen gruppe, som beskrevet i tabel 2. 6-godt pladen anbringes derefter i 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 1 h.
- For at slukke fluorescens af noninternalized E. coli, tilføje 200 µL af 0,8% krystalviolet (CV) vand løsning i brønden og svaje kort, således at man undgår en falsk-positive resultatet af EGFP-udtrykker E. coli binding til overfladen af den makrofager men ikke internaliseret. Vaske cellerne 3 x med PBS til at fjerne enhver resterende CV.
- Derefter tilsættes 1 mL af 70 mM kolde EDTA i brønden at frigøre cellerne og overføre dem til flow flowcytometri tube.
- Der centrifugeres rør ved 400 x g i 5 min, og supernatanten.
- Tilsæt 100 µL af PBS til resuspend cellerne. Tilføj 5 µL af F4/80-PE-konjugeret antistof (en overflade antigen udtrykt på musen makrofager) ind i rør, eller brug IgG2a-PE isotype, ifølge indstillingen gruppe. Vortex kort og inkuberes prøver på is i 5-10 min. i mørke.
- Der tilsættes 1 mL PBS i hvert rør og centrifugeres ved 400 x g i 5 min. supernatanten. Resuspend celle pellets med 200-300 µL af PBS for flow flowcytometri analyse. Kør hver tube og erhverve data for mindst 10.000 begivenheder af F4/80+ celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PET-SUMO vektor udnytter en lille ubiquitin-lignende modifier for at give udtryk for native proteiner i E. coli. SUMO fusion kan markant forbedre EGFP opløselighed, gør det muligt at blive opdaget nemt. Hvis EGFP udtrykket er med held induceret af laktose, kan grønne kolonier observeres i mørke (figur 1A). Grønne prikker, som repræsenterer den EGFP giver udtryk for E. coli, kan overholdes under et fluorescens mikroskop ved hjælp af en 40 x mål linse (figur 1B).
Mikroskopi analyse viser fluorescens billeder (figur 1 c) af peritoneal makrofager fra de unge og ældre grupper. Figur 1 c viser den røde fluorescens af F-actin, den grønne fluorescens af EGFP-udtrykker E. coli, den blå fluorescens af DAPI nukleare farvning og det flettede billede af alle tre fluorescens kanaler. 16 måneder gamle mus, som blev betragtet som de alderen mus, var svarende til 60 - 65-årige mennesker. Disse billeder tyder på, at makrofager fra de unge mus præsenteret en stærkere fagocytose evne end dem fra alderen mus.
Flowcytometri (figur 2) blev brugt til at kvantificere og sammenligne makrofag fagocytose fra gruppen unge og ældre. Figur 2A viser en repræsentativ flow flowcytometri analyse af unge, ældre og kontrolgrupper. F4/80-PE antistof blev brugt til at identificere og gate af makrofager, og EGFP-positive signaler angive de makrofager, der phagocytosed E. coli. Andelen af F4/80+ og EGFP+ celler angiver makrofager fagocyterende evne. Resultat (figur 2B) af den unge gruppe var 62.7% ± 5,1% (gennemsnit ± SEM), som var betydeligt højere end den 35,2% ± 2,9% (mener ± SEM) af gruppen alderen. Disse resultater stemmer overens med tendensen til fluorescens mikroskopi resultater.
Figur 1 : EGFP-udtrykker E. coli og dens fagocytose af makrofager. (A) EGFP-udtrykker E. coli kolonier. PET-SUMO-EGFP plasmid blev omdannet til BL21(DE) celler; bakterier blev podet på en LB-kanamycin (100 µg/mL) plade. En belægning af 0,5 mmol/L laktose på LB plade overflade blev brugt som inducer, giver EGFP udtryk. Hvis EGFP udtrykkes med succes, er gullig grøn kolonier observeret ved hjælp af UV-lys i mørke. (B) Fluorescens mikroskopi af EGFP udtryk for E. coli. Det grønne signal repræsenterer EGFP-udtrykker E. coli. Skalalinjen = 50 µm. (C) multikanals fluorescens billeder af makrofager, der phagocytosing E. coli. Cellerne blev inkuberet med at udtrykke EGFP E. coli (grøn) for 1 h, efterfulgt af en vask med PBS, fiksering med 4% PARAFORMALDEHYD, og farvning for F-actin ved hjælp af phalloidin 633 konjugat brugsopløsning (rød) og DAPI (blå). Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Flow flowcytometri resultater. (A) repræsentative flow flowcytometri analyse af unge, ældre og kontrolgrupper. Peritoneal makrofager blev farves med F4/80-PE efter coincubation med EGFP-udtrykker E. coli. F4/80+ og EGFP+ celler var sjældne i negativt kontrol og kontrol (gruppe 4: unge gruppe på is) grupper. Strømmen af unge og ældre cytometric parceller repræsenterer grupper 5 og 6, henholdsvis. (B) resultater fra flow flowcytometri analyse af de unge og ældre grupper. En Mann-Whitney test blev brugt til at undersøge forskellen mellem disse to grupper. Andelen af F4/80+ og EGFP+ celler i den unge gruppe var betydeligt højere end i den ældre gruppe (*P < 0,05). Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Gruppe | Navn | Celler | EGFP E. coli | Co inkubationstiden |
| 1 | Unge | 2 x 105 | 2 x 107 | 1 h |
| 2 | Alderen | 2 x 105 | 2 x 107 | 1 h |
Tabel 1: gruppere indstilling til fluorescens mikroskopi. To grupper, den ældre gruppe (16-måned-forhenværende C57BL/6, n = 3) og den unge gruppe (8-uge-forhenværende C57BL/6, n = 3), blev brugt til at forberede peritoneal makrofager. De peritoneale makrofager i hvert mus blev føjet til separate brønde. Ca 2 x 105 celler i et volumen på 100 µL blev tilføjet i hver brønd; derefter, ca 2 x 107 EGFP-udtrykker E. coli celler i et volumen på 10 µL blev føjet til hver godt og coincubated i 1 timer ved 37 ° C.
| Gruppe | Navn og tilstand | Celler | EGFP | F4/80-PE | PE ISOTYPE |
| E. coli | |||||
| 1 | Isotype kontrol ved 37° C | 2 x 106 | — | — | Tilsættes 5 μl |
| 2 | PE positiv kontrol ved 37° C | 2 x 106 | — | Tilsættes 5 μl | — |
| 3 | EGFP positiv kontrol ved 37° C | 2 x 106 | 1 x 108 | — | — |
| 4 | Ung gruppe på is | 2 x 106 | 1 x 108 | Tilsættes 5 μl | — |
| 5 | Ung gruppe ved 37° C | 2 x 106 | 1 x 108 | Tilsættes 5 μl | — |
| 6 | Aldersgruppe ved 37° C | 2 x 106 | 1 x 108 | Tilsættes 5 μl | — |
Tabel 2: gruppe indstilling til flowcytometri. De primære peritoneal makrofager fra de unge og alderen mus blev sat som seks grupper. Gruppe 1 var sæt som isotype kontrol; gruppe 2 og 3 blev sat som enkelt positiv kontrol for PE eller EGFP kanalen, henholdsvis. For at sikre, at den internaliseret Fluorescens er specifikke for fagocytose, blev gruppe 4 udruget på is. Fagocytose er stoppet på isen på grund af den lave temperatur. Inkubationstiden blev 1 time for alle grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trinene i denne protokol er ganske enkel og ligetil. Et af de vigtige skridt er at fremkalde EGFP udtryk på E. coli. Normalt, når et gen fra eukaryoter, som EGFP, er planlagt til at udtrykke i prokaryoter som E. coli, er der en risiko at proteinet vil danne inaktive aggregater (inklusion organer), som ændrer proteinets indfødte struktur og aktivitet. Ved hjælp af pET-SUMO vektor og konstruere pET-SUMO-EGFP plasmid, EGFP-SUMO fusion protein udtrykt med succes, og den lyssignal var stærk nok til at blive opdaget af både et fluorescens mikroskop og et flow Flowcytometret.
De andre kritiske trin er at slukke fluorescens af bakterier, som ikke var internaliseret af makrofager. Selvom Trypan blå har vist sig at slukke fluorescens af fluorescein isothiocyanat (FITC)-mærket, Varme-dræbte bakterier, det gjorde ikke arbejde nemlig den levende E. coli. Ved hjælp af en 0,8% krystalviolet vand løsning kan slukke de fleste af fluorescens af E. coli , som binder på cellens overflade. Nogle litteratur tyder på, at vask med antibiotika i stedet for med Trypan blå kan hjælpe til at slukke fluorescens, men der var ikke effektivt i dette eksperiment10.
Celle tæthed kan begrænse denne teknik. Fordi cellerne består af en blanding af lymfocytter og makrofager, er makrofager normalt lavere end celle massefylden beregnes ud fra hemocytometer når hovedkød celler fra mus bughulen, hvilket kan resultere i et utilstrækkeligt antal af celler til flowcytometri og Fluorescens mikroskopi. I tilfælde af utilstrækkelige antal makrofager, kan celler fra to til tre mus i samme koncern blandes til fagocytose assay. Når denne teknik er anvendt til at makrofag cellelinjer, såsom RAW264.7, kan celletab være et problem, fordi disse celler er forholdsvis nonadherent; således kan celler gå tabt under vask procedure. Vask forsigtigt eller bruge kultur plader med celle-behandlede overflader, som kan øge celle vedhæftning.
Der er mange andre metoder til at vurdere muligheden for fagocytose. Som en af de klassiske metoder, blev kylling erytrocytter eller bejdset døde celler brugt som markører for fagocytose. Følsomheden af disse metoder var begrænset af den store variation af resultaterne. En anden alternativ metode til at undersøge fagocytose er at bruge celler inficeret med bakterier i flere timer, og derefter lyse celler med Triton X-100 og plade på en LB-agar petriskål natten over ved 37 ° C. Fagocyterende kapacitet bestemmes ved at tælle antallet af kolonidannende enheder (CFUs)6. Denne metode kræver så længe som 2 dage for at få CFU data, og variansen af de optalte numre var store, fordi cellelysater fortyndes flere gange. Derefter, FITC-mærkede perler7 eller E. coli blev indført for fagocytose assays8. Fordi disse perler manglede specifikke overflade antigener, var ekstra preopsonization påkrævet for optimal optagelse. Også, metoden til at bruge de FITC-mærket bakterier kan hæmme fagocytose fordi FITC kompromitteret bakteriel virulens9.
Et andet nyligt indførte metode er at bruge kommercialiseret farvestoffer, der er pH følsomme og kun fluorescerer når de er inde i den sure lysosomet, hvilket eliminerer den dæmper trin10. Den kommercialiserede kit kan dog være omkostningseffektivt uoverkommelige. Når EGFP-udtrykker E. coli -stamme er bygget, bakterier gengives let, og Fluorescens er stabil i flere uger, hvilket gør denne metode, enkle og økonomisk. Fordi EGFP har en stærk fluorescens, kan denne metode også være kan ændres til en høj overførselshastighed fluorometriske teknik til at vurdere makrofag fagocytose, som kan udføres i en uigennemsigtig 96-brønd plade11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Den National Natural Science Foundation of China (nr. 31800046) og Natural Science Foundation i Liaoning provinsen (no. 20170540262) støttet dette arbejde. Dette arbejde blev udført i laboratorierne i videnskabelig Research Center på det andet Hospital i Dalian medicinske universitet. Forfatterne vil gerne takke Xiao-Lin Sang for hendes hjælp med flowcytometri, og Bo Qu og Dong-Chuan Yang for deres hjælp i at producere video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | - | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | - | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | - | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
