Att upptäcka Ligand-bindande domänen Dimerization aktiviteten av östrogen Receptor alfa med däggdjur två-Hybrid-analys
Summary
Vi presenterar en metod för att analysera 4-hydroxi-tamoxifen-beroende östrogen receptor ligand-bindande domänen dimerization alfaaktiviteten med däggdjur två-hybrid-analys.
Abstract
Östrogen receptor alfa (ERα) är en östrogena ligandberoende transkription regulator. Sekvensen av ERα protein är starkt bevarad bland arter. Det har varit tänkt att fungera av mänskliga och mus ERαs är identiska. Vi visar differentiell 4-hydroxi-tamoxifen (4OHT) på mus och mänsklig ERα ligand-bindande domänen (LBD) dimerization verksamhet med däggdjur två-hybrid (M2H) analys. M2H analysen kan påvisa effektiviteten hos LBD homodimerization aktivitet i däggdjursceller, utnyttja transfection av två protein uttryck plasmider (GAL4 DNA-bindande domänen [DBD] fusion LBD och VP16 transkription domänen [VP16AD] fusion LBD) och en GAL4-responsive element (GAL4RE) smält luciferas reporter plasmid. När GAL4DBD fusion LBD och VP16AD fusion LBD gör en dimer i cellerna, detta proteinkomplex binder till GAL4RE och sedan aktiverar ett luciferas genuttryck genom aktiviteten VP16AD beroende transkription. 4OHT-medierad luciferas aktiveringen är högre i HepG2 celler som var transfekterade med musen ERα LBD fusion protein uttryck plasmidsna än i de mänskliga ERα LBD fusion protein uttryck plasmid transfekterade cellerna. Detta resultat tyder på att effekten av 4OHT-beroende musen ERα LBD homodimerization aktivitet är högre än mänsklig ERα LBD. Utnyttjandet av M2H analysen är i allmänhet inte idealisk för utvärdering av nukleär receptor LBD dimerization aktivitet, eftersom agonistiska ligander öka den basala nivån för aktiviteten LBD och som försvårar upptäckten av LBD dimerization aktivitet. Vi hittade att 4OHT inte ökar ERα LBD basal aktivitet. Det är en nyckelfaktor för att kunna avgöra och detektera 4OHT-beroende LBD dimerization aktiviteten för framgångsrikt med M2H analys. ERα LBD-baserade M2H analyser kan användas för att studera aktiviteten partiell agonist av selektiv östrogen receptor modulatorer (t.ex., 4OHT) i olika proteintillverkningen.
Introduction
Östrogen receptor alfa (ERα) är en östrogena ligandberoende transkription regulator. Den amino syran sequenceof ERα är mycket bevarad bland arter. På grund av den högre homologi mellan människa och mus ERα, funktionen av dessa receptorer är tänkt som identiska och differentiell aktiviteten av östrogena substanser (t.ex.tamoxifen) hos dessa arter orsakas av artens skillnader i kemiska ämnesomsättning snarare än av de strukturella skillnaderna i ERα. ERα har starkt konservativa domän strukturer som är vanliga bland nukleär receptor (NR) överfamiljen, designerat A till F domäner. Den E domänen eller ligand-bindande domän (LBD) inkluderar ligand-bindande fickan och transkriptionell aktiveringen funktion 2, heter AF-2. Domänen F är lokaliserad direkt anslutning till E-domänen och är mest variabla domänen bland NRs. Även mellan mänskliga och mus ERα, homologi mellan domänen F är betydligt lägre än för andra domäner1. Den ligand-bundna LBD av ERα förbättrar homodimerization av proteinet ERα att binda det specifika östrogenkänsliga DNA elementet direkt för att reglera den ligandberoende gentranskription (klassisk åtgärd av ERα). Kristallografiska studier har avslöjat den differentiella positionering av helix 12 (AF-2 core-domän) med estradiol (E2)- eller 4-hydroxi-tamoxifen (4OHT) – bundna LBD dimerer2,3. Domänen ERα F (45 aminosyror) ansluta helix 12 direkt. Dock finns det ingen information om effekten av denna utvidgning av 45 aminosyror (F domän) från spiralen 12 på den ERα LBD dimerization. I denna studie visar vi bidrag F domänen till den artspecifika 4OHT-beroende ERα LBD homodimerization med ett däggdjur två-hybrid (M2H) analys.
M2H analysen är en metod att påvisa protein-protein interaktioner i däggdjursceller införa de tre olika kontrollplasmid-DNA: två protein uttryck plasmider, som uttrycker GAL4 DNA-bindande domänen (DBD) fusion ERα LBD och VP16AD fusion ERα LBD, och en GAL4RE-smält luciferas uttryck reporter plasmid. När GAL4DBD fusion ERα LBD och VP16AD fusion ERα LBD interagera (göra en dimer) i cellerna, detta proteinkomplex binder till GAL4RE och, sedan, aktiverar luciferas genuttryck genom funktionen VP16AD-beroende transkription. Nivån på LBD homodimerization kan utvärderas av aktiviteten luciferas.
Den jäst två-hybrid (Y2H)-analysen är en alternativ metod baserat på samma princip som använder jäst som värdmiljön. Tidigare rapporter med hjälp av Y2H systemet visade att F-domän-stympad människa ERα LBD ökar E2-beroende coactivator rekrytering, sluta att F domänen förhindrar E2-medierad transkription4. Detta resultat är oförenligt med andra rapporter som visat försvagat transkriptionell aktiviteten av F-domän-trunkeras mänskliga ERα i däggdjursceller5,6. Nyligen visat vår studie, använda M2H, att aktiviteten E2-beroende coactivator rekrytering av mänskliga ERα LBD är minskade F domän trunkering i däggdjursceller och överensstämmer med transkription aktivitet1. Dessa observationer tyder på att den fysiologiska rollen protein-protein interaktioner skiljer sig i en cell typspecifika sätt och sammanhang. M2H analysen kan påvisa protein-protein interaktioner aktivitet i samma cellulära sammanhang som används för att bestämma aktiviteten transkriptionell. Detta ger en fördel M2H analysens jämfört med Y2H eller annan in vitro- protein-protein interaktioner analyser.
Det finns fortfarande frågor rörande de molekylära mekanismerna för aktiviteten partiell agonist av selektiva östrogenreceptormodulatorer (SERMs) (t.ex., 4OHT) att reglera ERα-medierad transkription. ERα LBD-baserade M2H analyser kan användas för att studera mekanismen för partiell agonist aktiviteten av SERMs i olika proteintillverkningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Häri, beskrev vi protokollet för M2H analysen, med fokus på analys villkoren för att upptäcka homodimerization aktiviteten av ERα LBD som ett exempel. M2H analysen är i allmänhet inte populär för bedömning av ligandberoende ERα LBD dimerization aktivitet. Detta beror på den ERα LBD besitter en transkriptionell aktiveringen funktion; vars verksamhet stör, i vissa fall resultaten av M2H analysen. Men, som vi visar här, M2H analysen kan användas för att analysera LBD dimerization aktiviteten av vissa ämne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Drs. Sueyoshi och Wang på nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) för deras kritisk läsning av manuskript och Tanner Jefferson för att utföra procedurer på videon. Detta arbete stöds av de nationella institut för hälsa Grant 1ZIAES070065 (till K.S.K.) från NIEHS Division av intramurala forskning.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
- Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
- Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
- Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
- Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
- Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
- Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
- Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
- Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
- Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).
