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Cancer Research

Erkennung der Liganden-bindende Domäne Dimerisierung Aktivitäten von Östrogen-Rezeptor Alpha mit den Säugetieren Zweimischling Assay

Published: December 19, 2018 doi: 10.3791/58758
Automatic Translation
1, 1
1Reproductive Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIH)

Summary

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse der 4-hydroxy-Tamoxifen-abhängigen Rezeptor alpha Liganden-bindende Domäne Dimerisierung Östrogenaktivität mit Säugetieren Zweimischling Assays.

Abstract

Östrogen-Rezeptor Alpha (ERα) ist eine Östrogene Liganden-abhängige Transkription-Regler. Die Reihenfolge der ERα Protein ist stark zwischen den Arten erhalten. Es ist gedacht worden, dass die Funktion von Mensch und Maus ERαs ist identisch. Wir zeigen die differenzielle 4-hydroxy-Tamoxifen (4OHT) Wirkung auf Maus und menschliche ERα Liganden-bindende Domäne (LBD) Dimerisierung Tätigkeit mit den Säugetieren Zweimischling (M2H) Assay. M2H Assay kann die Effizienz der LBD Homodimerization Aktivität in Säugerzellen, unter Verwendung der Transfektion von zwei Protein Ausdruck Plasmide (GAL4 DNA-bindende Domäne [DBD] Fusion LBD und VP16 werden Domain [VP16AD] Fusion LBD) nachweisen und eine Gal4-responsive Element (GAL4RE) verschmolzen Luciferase Reporter Plasmid. Wenn die GAL4DBD Fusion LBD und die VP16AD Fusion LBD ein Dimer in den Zellen vornehmen, dieses Protein-Komplex bindet an die GAL4RE und dann aktiviert eine Luciferase-gen-Expression durch die VP16AD-abhängige Transkription-Aktivität. Die 4OHT-vermittelten Luciferase-Aktivierung ist in den HepG2-Zellen, die mit der Maus ERα LBD Fusion Protein Ausdruck Plasmide als in den menschlichen ERα LBD Fusion Protein Ausdruck Plasmid transfizierten Zellen transfiziert wurden höher. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Wirksamkeit der 4OHT-abhängige Maus ERα LBD Homodimerization Tätigkeit höher als menschliche ERα LBD. Die Nutzung des Assays M2H eignet sich im Allgemeinen nicht für die Bewertung der nuklearen Rezeptoren LBD Dimerisierung Aktivität, da agonistische Liganden der basalen Ebene der LBD Aktivität Verbesserung und das erschwert die Erkennung des LBD Dimerisierung Aktivität. Wir fanden, dass 4OHT nicht ERα LBD basale Aktivität verbessert. Das ist ein entscheidender Faktor für die Möglichkeit, zu bestimmen und erkennen der 4OHT-abhängige LBD Dimerisierung Aktivität für M2H Assay erfolgreich im Einsatz. ERα LBD-basierte M2H Assays können angewendet werden, um die teilweisen Agonist Tätigkeit der selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (z.B. 4OHT) zu studieren, in verschiedenen Säugetier-Zelle.

Introduction

Östrogen-Rezeptor Alpha (ERα) ist eine Östrogene Liganden-abhängige Transkription-Regler. Die Aminosäure Sequenceof ERα ist stark zwischen den Arten erhalten. Wegen der höheren Homologie zwischen Mensch und Maus ERα, die Funktion dieser Rezeptoren ist gedacht als identisch und die differenzielle Aktivität der östrogene Substanzen (z.B. Tamoxifen) in jenen Sorten entsteht durch die Arten Unterschiede in chemischen Stoffwechsel und nicht durch die strukturellen Unterschiede der ERα. ERα hat sehr Domänenstrukturen konserviert, die häufig bei der nuklearen Rezeptoren (NR)-Superfamilie, Bezeichnung A bis F Domänen sind. Der E-Domäne oder Liganden-bindende Domäne (LBD) beinhaltet die Liganden-Bindungstasche und die transkriptionelle Aktivierungsfunktion 2, AF-2 genannt. Die F-Domäne ist unmittelbar neben der E-Domäne lokalisiert und ist die variabelste Domäne unter der NRs. Auch zwischen Mensch und Maus ERα, die Homologie des Geschäftsfeldes F ist deutlich geringer als die der anderen Domänen1. Die Liganden gebundenes LBD ERα erhöht die Homodimerization des ERα-Proteins, das jeweilige Östrogen reagierende DNA-Element direkt für die Regulierung der Liganden-abhängige Gentranskription (klassische Aktion des ERα) zu binden. Kristallographische Untersuchungen haben ergeben, dass die differentielle Positionierung der Helix 12 (AF-2 zentrale Domäne) mit Estradiol (E2)- oder 4-hydroxy-Tamoxifen (4OHT) - LBD Dimere2,3gebunden. Die ERα F-Domäne (45 Aminosäuren) Helix 12 direkt verbinden. Allerdings gibt es keine Informationen über die Wirkung dieser Erweiterung von 45 Aminosäuren (F Domäne) aus der Helix 12 auf ERα LBD Dimerisierung. In der vorliegenden Studie zeigen wir den Beitrag der F-Domäne, die artspezifische 4OHT-abhängige ERα LBD-Homodimerization mit einem Säugetier Zweimischling (M2H) Assay.

Die M2H-Assay ist eine Methode, um Protein-Protein-Interaktionen in Säugerzellen, die Einführung der drei verschiedenen Plasmid-DNA nachweisen: zwei Protein Ausdruck Plasmide, die GAL4 DNA-bindende Domäne (DBD) Fusion Fusion ERα LBD und VP16AD ERα LBD zum Ausdruck bringen, und ein GAL4RE verschmolzen Luciferase Reporter Expressionsplasmid. Wenn die GAL4DBD Fusion ERα LBD und die VP16AD Fusion ERα LBD interagieren (stellen ein Dimer) in den Zellen dieser Protein-Komplex bindet an die GAL4RE und dann aktiviert Luciferase-gen-Expression durch die Funktion VP16AD-abhängigen werden. Die LBD Homodimerization können durch die Luciferase-Aktivität bewertet werden.

Die Hefe Zweimischling (Y2H) Test ist eine alternative Methode, basierend auf dem gleichen Prinzip, das Hefe als der Host-Umgebung verwendet. Frühere Berichte über das Y2H-System gezeigt, dass F-Domäne-abgeschnitten menschlichen ERα LBD E2-abhängige Coactivator Einstellung erhöht, zum Schluss, dass die Domain F E2-vermittelten Transkription4verhindert. Dieses Ergebnis widerspricht andere Berichte, die die abgeschwächte transkriptionelle Aktivität der F-Domäne-abgeschnitten menschlichen ERα in Säugerzellen5,6unter Beweis gestellt haben. Vor kurzem, nachweislich unsere Studie mit dem M2H System, die E2-abhängige Coactivator Rekrutierung Aktivität des menschlichen ERα LBD verringerte sich um F Domäne abschneiden in Säugetierzellen und steht im Einklang mit Transkription Aktivität1. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die physiologische Rolle von Protein-Protein Interaktion in einer Zelle Art-spezifisch und Kontext unterscheidet. M2H Assay kann Proteinprotein Interaktion Aktivität im gleichen Zusammenhang mit zellulären zeigen, die für die Bestimmung der transkriptionellen Aktivität verwendet wird. Dies bietet einen Vorteil im Vergleich zu den Y2H oder andere in-vitro- Protein-Protein Interaktion Analysen M2H-Assay.

Es bleiben Fragen über die molekularen Mechanismen der teilweisen Agonist Tätigkeit der selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (SERMs) (z.B. 4OHT) zu ERα-vermittelten Transkription regulieren. ERα LBD-basierte M2H Assays können angewendet werden, um den Mechanismus der teilweisen Agonist Tätigkeit der SERMs in verschiedenen Säugetier-Zelle Arten zu studieren.

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Protocol

1. Vorbereitung der Plasmide Säugetier-Zweimischling Assay

  1. Verwenden Sie die folgenden Plasmide: pG5-Luc, pBIND-ERαEF und Pakt-ERαEF.
    Hinweis: Die Plasmide sind von den Autoren auf Anfrage erhältlich und werden auf Filterpapier gesendet. pG5-Luc ist das Reporter-Plasmid, das fünf Wiederholungen des GAL4 enthält ansprechende Elemente mit der Luciferase Ausdruck Einheit (Abb. 1A) fusioniert. pBIND-ERαEF ist das Protein-Expressionsplasmid für GAL4DBD verschmolzen ERα LBD Proteine. pBIND-ERαEF enthält eine Renilla-Luciferase-Ausdruck-Einheit für die Normalisierung der Transfektion Effizienz (Abbildung 1B). Pakt-ERαEF ist das Protein-Expressionsplasmid für die VP16AD verschmolzen ERα LBD-Proteine (Abbildung 1C). Das Diagramm der exprimierten Proteinstruktur aus der Plasmide ist in Abbildung 2dargestellt.
  2. Bereiten Sie Plasmid DNA.
    1. Das Plasmid-geladenen Bereich aus dem Papier mit einer sauberen Schere ausschneiden und steckte es in eine 1,5 mL-Tube. Tragen Sie Handschuhe und sauberen Pinzette das Plasmid-geladene Papier abholen. Fügen Sie nun 100 µL Tris-EDTA (TE)-Puffer (pH 8,0) und Wirbel.
    2. Fügen Sie 1 µL der Plasmid-DNA-Lösung von Schritt 1.2.1 zu kompetenten Escherichia coli Zellen (siehe Tabelle der Materialien) und halten Sie den Schlauch für 15 min auf Eis.
    3. Hitze-Schock das Plasmid hinzugefügt kompetente Zellen; inkubieren Sie die Tube(n) auf 42 ° C Wasserbad für 30 s und halten sie dann für 2 min auf Eis.
    4. Am Tube(n) und Kultur unter Schütteln bei 37 ° C für 30 min fügen Sie 250 µL super optimale Brühe mit Catabolite Repression (SOC) Medium (Raumtemperatur hinzu).
    5. Platte 100 µL des kultivierten E. coli auf eine vorgewärmte Luria Brühe (LB) Platte mit 100 µg/mL Ampicillin (10 cm Durchmesser Teller) und Kultur bei 37 ° C über Nacht.
    6. Wählen Sie eine Kolonie von der Platte, und fügen Sie es in einen 14 mL Röhrchen mit 2 mL tolle Brühe (TB) mit 100 µg/mL Ampicillin. Kultur unter Schütteln bei 37 ° C, bis das Medium schwach getrübt wird.
    7. Ein autoklaviert 250 mL Glaskolben, 50 mL von TB mit 100 µg/mL Ampicillin enthält fügen Sie 1 mL des Mediums kultivierten aus Schritt 1.2.6 hinzu. Kultur unter Schütteln bei 37 ° C für 20-24 Uhr.
    8. Übertragen Sie die kultivierten E. Coli auf eine 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 3.450 X g bei Raumtemperatur für 30 min mit der Schaukel-Eimer-Rotor. Entsorgen Sie das Medium. Speichern der E. Coli -Pellet bei-80 ° C.
    9. Geben Sie 3 mL Zelle Wiederfreisetzung Lösung (siehe Tabelle der Materialien), die E. Coli pellet und hängen Sie es vollständig. Geben Sie 3 mL Zelle Lysis Lösung (siehe Tabelle der Materialien), mischen die Röhre vorsichtig durch invertieren sie 10 X, und halten Sie es für 5 min auf Eis (immer pünktlich). 6 mL Neutralisation Lösung zugeben (siehe Tabelle der Materialien), mischen Sie das Rohr stetig mit tippen, und dann halten Sie es für 10 min auf Eis.
    10. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 3.450 X g bei 4 ° c für 30 min mit der Schaukel-Eimer-Rotor. Die DNA-haltige Lösung auf eine neue 50 mL konische Rohr übertragen und 10 mL DNA-Reinigung-Harz (siehe Tabelle der Materialien). Das Harz sanft auszusetzen.
    11. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 625 X g für 1 min mit der Schaukel-Eimer-Rotor. Die Lösung zu verwerfen und das Harz an der Unterseite halten.
    12. 15 mL Waschlösung Spalte hinzufügen (80 mM Kalium Acetat, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7.5], 40 µM EDTA und 55 % Ethanol), die 50 mL konische Rohr und schütteln Sie sie vorsichtig, um das Harz zu unterbrechen. Wiederholen Sie Schritt 1.2.11.
      Hinweis: Die Spalte-Waschlösung muss bereit sein mit Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-Wasser oder Nuklease-freies Wasser behandelt.
    13. Die 50 mL konische Röhrchen fügen Sie 5 mL Waschlösung Spalte hinzu und hängen Sie das Harz mit einer 5 mL pipettieren. Das Harz auf der Spalte anwenden (siehe Tabelle der Materialien), befindet sich auf dem Vakuum-Verteiler. Saugen Sie die Spalte, bis das Harz trocknen. 6 mL Waschlösung Spalte hinzufügen der Spalte und Vakuum.
    14. Sobald das Harz visuell trocknet, lösen Sie den Behälter aus der Spalte. Übertragen Sie den unteren Bereich der Spalte (Harz) auf eine 1,5 mL-Tube. Zentrifugieren Sie die Spalte mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min mit einem Microcentrifuge das Harz vollständig trocknen.
    15. Übertragen Sie den unteren Bereich der Spalte (Harz) auf eine neue 1,5 mL Tube. Die Spalte 300 µL Nuklease-freies Wasser hinzu und warten Sie, bis das ganze Harz getränkt wird.
    16. Zentrifugieren Sie die Spalte mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min um das Plasmid DNA-haltigen Lösung (200-250 µL) zu sammeln.
    17. Die DNA-haltige Lösung mit Phenol-Chloroform (1:1), dann mit Chloroform folgendermaßen zu behandeln.
      1. Die DNA-haltige Lösung (200-250 µL) die gleiche Menge an Phenol-Chloroform (1:1) hinzufügen, gut schütteln und mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min mit einem Microcentrifuge zentrifugieren. Die obere Schicht (DNA-haltigen Lösung) zu sammeln und Hinzufügen einer neuen 1,5 mL-Tubus. Wiederholen Sie diesen Schritt 1 X.
      2. Die DNA-haltige Lösung (200-250 µL) die gleiche Menge an Chloroform hinzufügen, gut schütteln und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min. sammeln die obere Schicht (DNA-haltigen Lösung) und fügen Sie es ein 1,5 mL-Tube.
        Hinweis: Endotoxin (Lipopolysaccharid) zellulären Signalisierung in einigen Zellen induziert. Um einen unerwarteten Effekt zu vermeiden, empfiehlt sich Schritt 1.2.17 die können Endotoxin-Kontamination zu reduzieren.
    18. Überstürzen Sie das Plasmid DNA mit Ethanol Niederschlag Technik wie folgt.
      1. Fügen Sie 1/9 der DNA-Gemisch Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 20 X 3M Natrium Acetat-Volumen von 100 % Ethanol zur DNA-haltigen Lösung. Z. B. Fügen Sie 27,8 µL 3 M Natriumacetat und 278 µL Ethanol 100 hinzu % 250 µL DNA-Lösung (der letzte Band ist 555.8 µL).
      2. Halten Sie die Lösung mindestens bei-80 ° C für 20 Minuten. Zentrifugieren Sie bei maximaler Geschwindigkeit für 20 min bei 4 ° c. Die Lösung zu verwerfen und das Pellet halten. Fügen Sie 200 µL 75 % Ethanol und spülen Sie die Innenseite des Rohres. Zentrifugieren Sie für 20 min bei 4 ° C, verwerfen Sie die Lösung zu, und halten Sie das Pellet. Das DNA-Pellet mit einem Vakuum Konzentrator zu trocknen.
      3. Das Rohr 100-250 µL TE-Puffer (pH 8,0) hinzufügen. Das DNA-Pellet auflösen und überprüfen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm. Halten Sie die DNA-Konzentration um 0,5 mg/mL.

(2) Säugetier-Zweimischling Assay

  1. Pflegen Sie die Zellen.
    1. Menschlichen hepatozellulären Karzinom HepG2 Kulturzellen in einer 750 mL, 175 cm2 Gewebekultur Kolben mit Phenol Rotfrei-minimalen wesentlichen Medien (MEM) mit 10 % fötalen Rinderserum ergänzt (FBS; Hitze-inaktivierten), 2 mM L-Glutamin, und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (Antibiotika) für die Aufrechterhaltung der Zellen.
    2. Kultur der Zellen in einer 5 % CO2-ergänzt, 37 ° C Inkubator bis die Zellen etwa 90 % Zusammenfluss sind.
      Hinweis: Um Östrogene Hintergrundaktivitäten zu verringern, sollten Phenol Rotfrei-Medium für alle M2H Experimente verwendet werden. Dieser Schritt sollte in einem sauberen Bank/biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden. Die Zellen sollten nach der allgemeinen Säugerzelle Kultur Protokoll7beibehalten werden.
  2. Bereiten Sie die Zellen zur Transfektion.
    Hinweis: Die folgende Verfahrensschritte sollte innerhalb der sauberen Bank/biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden. Die Zellen sind in einem 5 % CO2kultiviert/inkubiert-ergänzt, 37 ° C Inkubator in diesem Schritt jedes Mal.
    1. Replate 90 % konfluierende Zellen an den 24-Well-Platten; Spülen Sie die Zellen 1 X mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    2. Die Kultur-Flasche 7 mL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und genießen Sie die Zellen für 1 – 2 min. unter Beibehaltung des Kultur-Kolbens in einer sauberen Werkbank bei Raumtemperatur. Entfernen Sie einen Teil der Trypsin-EDTA-Lösung und lassen Sie 1-2 mL der Lösung in den Kultur-Kolben. Inkubieren Sie die Kultur-Küvette in den Inkubator für 1-2 min.
    3. Schlagen der Unterseite der Flasche lösen die Zellen und überprüfen die Zellen unter dem Mikroskop.
      Hinweis: Wenn die Zellen noch in den Kolben befestigt sind, noch 1-2 min inkubieren und wiederholen Sie Schritt 2.2.3.
    4. Aussetzen der Zellen in der Phenol Rotfrei-MEM ergänzt mit 10 % Kohle ausgezogen FBS (Hitze-inaktivierten), 2 mM L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung.
      Hinweis: Holzkohle abgestreift FBS muss verwendet werden, um die Wirkung der Serum-abgeleitete endogenen Östrogen zu reduzieren.
    5. Zählen der Anzahl von Zellen und Zellen in einer 24-Well-Platte bei einer Dichte von 1,2 x 105 Zellen/gut Samen. Ordnen Sie drei Brunnen für jeden Datenpunkt (dreifacher).
    6. Über Nacht Kulturzellen. Weiter zu Schritt 2.4.1.
  3. Bereiten Sie eine DNA-Mischung zur Transfektion.
    Hinweis: Die folgende Plasmid DNA sind in einem gut transfiziert: 100 ng von pG5-Luc Reporter Plasmid, 50 ng der Ausdruck Plasmide für GAL4DBD Fusionsproteine (pBIND) und 50 ng der Ausdruck Plasmide für VP16AD Fusionsproteine ("Pakt").
    1. Um die Liganden-abhängige ERα LBD Dimerisierung Aktivität zu analysieren, bereiten Sie die folgenden Kombinationen (Abbildung 3). Kombination (i): pG5-Luc pBIND-hERαEF-Pakt und pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Pakt. Kombination (Ii): pG5-Luc pBIND-hERαEF Pakt-hERαEF und pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Pakt-mERαEF. Kombination (Iii): pG5-Luc pBIND Pakt-hERαEF und pG5-Luc + pBIND + Pakt-mERαEF.
      Hinweis: Kombination (i) stellt die basalen experimentellen Ebene des menschlichen ERα LBD und Maus ERα LBD, beziehungsweise. Wenn das Ergebnis eine bemerkenswert hohe mit Liganden allein zeigt, ist diese Methode für die Verwendung mit diesem Liganden (z. B.Diäthylstilböstrol [DES]) nicht realisierbar. Kombination (Ii) stellt die Ebenen von dimerized menschlichen ERα LBD und dimerized Maus ERα LBD, beziehungsweise. Kombination (Iii) stellt Negativkontrollen; Verwenden Sie diese nur, wenn das Experiment durchgeführt wird, zum ersten Mal die Hintergrundkonzentration des Systems zu bewerten.
    2. Vor dem Mischen, berechnen die gesamte DNA-Menge benötigt, basierend auf der Anzahl von Brunnen zur Transfektion. Für Experimente in Triplicates und an fünf Datenpunkte, mischen die folgende Plasmid DNA in zwei 1,5 µL Rohre für Kombinationen (i) und (Ii): pG5-Luc, 5 (Datenpunkte) x 3 (Brunnen) X 100 ng = 1.500 ng (15 µL); pBIND-mERαEF, 5 (Datenpunkte) x 3 (Brunnen) X 50 ng = 750 ng (7,5 µL); Pakt (Kombination i) oder Pakt-mERαEF (für die Kombination Ii), 5 (Datenpunkte) x 3 (Brunnen) X 50 ng = 750 ng (7,5 µL).
      Hinweis: Die Konzentration der jeweiligen Plasmid-DNA-Lösung beträgt 0,1 µg/µL.
    3. Überstürzen Sie sich die DNA-Mischung mit der Ethanol-Niederschlag-Technik. Fügen Sie 1/9 der DNA-Gemisch Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 20 X 3M Natrium Acetat-Volumen von 100 % Ethanol auf die DNA-Mischung. Dann das Rohr Wirbel.
      Hinweis: zum Beispiel fügen Sie 3,4 µL 3 M Natriumacetat und 34 µL 100 % Ethanol 30 µL Plasmid DNA-Mischung in Schritt 2.3.2 veranschaulicht hinzu. Dieser Schritt hilft, um einen unveränderlichen Transfektion Zustand zu halten, und es ist nicht notwendig, diesen Schritt in einem biologischen Sicherheitsschrank auszuführen.
    4. Halten Sie die Mischung über Nacht bei-20 ° C. Zentrifugieren sie mit maximaler Geschwindigkeit für 20 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie die Lösung (das Pellet ist unsichtbar). Das Rohr 120 µL 75 % Ethanol hinzufügen; Spülen Sie die Innenseite des Rohres. Zentrifuge für 20 min bei 4 ° C. Die Lösung zu verwerfen und das DNA-Gemisch mit einem Vakuum Konzentrator für 30 min trocknen.
  4. Führen Sie die Transfektion.
    Hinweis: Die folgenden Schritte sollten in einem sauberen Werkbank oder einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden.
    1. Am nächsten Morgen spülen Sie die Zellen ausgesät in einer 24-Well-Platte (aus Schritt 2.2.6) 2 X mit 0,5 mL PBS (Raumtemperatur).
    2. Fügen Sie Warm (37 ° C) frische Phenol Rotfrei-MEM ergänzt um 10 % Holzkohle-FBS (Hitze-inaktivierten) und 2 mM L-Glutamin ohne Antibiotika in jede Vertiefung (0,5 mL Medium/Na) beraubt. Halten Sie die Zellen in einer 5 % CO2-ergänzt, 37 ° C Inkubator.
    3. Die getrockneten Plasmid DNA-Mischung (aus Schritt 2.3.4) in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) (kein Serum, Phenol Red-kostenlos, ohne Glutamin; 13 µL/Well) aussetzen. Berechnen Sie die Beträge der DMEM aus der Anzahl der Brunnen zur Transfektion.
      Hinweis: 15 Brunnen für Kombination (i) x 13 µL = 195 µL und 15 Brunnen für Kombination (Ii) x 13 µL = 195 µL.
    4. Aussetzen des Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien; 1,5 µL/Well) in DMEM (12,5 µL/Well) in einem anderen 1,5 mL-Tube. Berechnen Sie die Mengen von Transfection Reagens und DMEM aus der Anzahl der Brunnen zur Transfektion.
      Hinweis: 30 [15 Brunnen für die Kombination] (i) und 15 Brunnen für Kombination (Ii) x 1,5 µL Transfection Reagens + 30 x 12,5 µL DMEM = 420 µL.
    5. Fügen Sie eine gleiche Menge des Mediums Transfection Reagens (aus Schritt 2.4.4) zu jedem Röhrchen (aus Schritt 2.4.3). Inkubieren Sie die Rohre für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur.
      Hinweis: 200 µL Transfection Reagens Medium + 195 µL Kombination (i) DNA-Gemisch = 395 µL und 200 µL Transfection Reagens Medium + 195 µL Kombination (Ii) DNA-Gemisch = 395 µL. Es ist wichtig die Röhren der Kombination (i) und (Ii) ein gleiches Volumen von Transfection Reagens Medium hinzu. Es ist nicht notwendig, das Medium in diesem Schritt verwenden.
    6. Fügen Sie die kombinierten Mischung (aus Schritt 2.4.5) in jede Vertiefung (25 µL/Well) von 24-Well-Platte (aus Schritt 2.4.2) und inkubieren Sie die Zellen 6 h 5 % CO2-ergänzt, 37 ° C Inkubator.
    7. Entfernen Sie die Transfektion Medium aus 24-Well-Platte. Fügen Sie Warm (37 ° C) frische Phenol Rotfrei-MEM mit 10 ergänzt % Kohle ausgezogen, FBS (Hitze-inaktivierten), 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung und Liganden (ausgesetzt in Ethanol) (0,5 mL Medium/Na). Kulturzellen für 16-18 h in der 5 % CO2-ergänzt, 37 ° C Inkubator.
  5. Die Proben zu ernten.
    1. Spülen Sie die Zellen mit 1 mL PBS und fügen Sie 100 µL 1 x passive Lyse Puffer (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Schütteln Sie kräftig 24-Well-Platten mit einem Vortex-Mixer, die Zellen zu lösen.
    3. Einfrieren der Platten (Zelle Lysates) 1 X durch flüssigen Stickstoff oder speichern sie bei-80 ° C vor der Analyse. Unmittelbar vor der Assay schütteln Sie kräftig die Platten auf einem Boston-Shaker, bis sie bei Raumtemperatur sind.
      Hinweis: Dieser Vorgang verhindert unregelmäßig erscheinenden anomale Werte der Luciferase-Aktivität.
  6. Führen Sie einen Dual-Luciferase Assay.
    1. Vorbereiten der Reagenzien für die Dual-Luciferase Assay-System (siehe Tabelle der Materialien).
      1. Fügen Sie für die Herstellung der Luciferase Assay (LAS) Substratpuffer alle Luciferase Assay-Puffer in der Luciferase Assay-Substrat ist in einer braunen Glasflasche. Speichern des LAS-Puffers bei-20 ° C.
        Hinweis: Die LAS-Puffer sollte vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmt werden.
      2. Mischen Sie für die Herstellung des Renilla-Luciferase-Substrat (RLS)-Puffers Renilla-Luciferase-Substrat und Renilla-Luciferase-Puffer in einem Verhältnis von 01:50. Machen frische RLS für jedes Assay-Puffer und einen schwarzen Schlauch oder ein Rohr im Schatten von Alufolie verwenden. Berechnen Sie die Höhe der RLS Puffer machen einen frischen Puffer.
        Hinweis: Der RLS-Puffer sollte vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmt werden.
    2. Die Reagenzien in der Mikrotestplatte Leser gesetzt.
      1. Waschen der Injektion Linien 2 X mit 70 % Ethanol; dann waschen Sie die Linien 2 X mit Wasser.
        Hinweis: Dies ist wichtig, zu verhindern, die Untersuchungsergebnisse zu stören.
      2. Die LAS-Puffer zum P-Injektor Linie (erste Injektion) und legen Sie den RLS-Puffer für die M-Injektor-Linie (zweite Injektion). Mischen Sie diese Puffer nicht. RLS-Puffer hemmt Luciferase-Aktivität.
    3. Gelten Sie 10 µL der geernteten Proben (aus Schritt 2.5.3) für die 96-Well weißen Plastikplatte.
    4. Die folgenden Einstellungen für den Leser Mikrotestplatte anwenden. Für die P-Injektor, verwenden Sie ein Volumen von 50 µL, eine Verzögerung von 2 s und einer Geschwindigkeit von 50 µL/s. Für die M-Injektor, verwenden Sie ein Volumen von 50 µL, eine Verzögerung von 2 s und einer Geschwindigkeit von 50 µL/s. einer Integrationszeit von 15 S. Set die Temperatur auf 25 ° c einstellen
    5. Führen Sie die Mikrotestplatte Leser.
    6. Aufzeichnen der Werte der Luciferase-Aktivität (IPValue) und die Werte der Renilla Luciferase-Aktivität (IMValue) mit dem Daten-Übernahme-Programm (siehe Tabelle der Materialien).
    7. Die Einspritzleitungen nach der Datenerhebung zu waschen (siehe Schritt 2.6.2.1).
  7. Datenanalyse.
    1. Verwenden Sie die normalisierte Werte (IPValue/IMValue) für die Datenanalyse.
    2. Legen Sie den normalisierten Wert der Kombination (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + Pakt] mit Fahrzeug (0 nM Liganden) 1 für die Berechnung der basalen Ebene und die Homodimerized ERα LBD Ebene. Die Ebenen werden als "Relative Aktivität" dargestellt.

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Representative Results

Abbildung 3 zeigt das Schema der möglichen Antworten in der Kombination (i) und Kombination (Ii) Plasmid-transfizierten Zellen. Die experimentellen Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt. Die Aktivität der Kombination (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Pakt) zeigt Stimulation von 10 nM E2 (Abb. 4A), weil der ERα LBD die Liganden-abhängige werden funktionale Domäne, AF-2 enthält. Agonisten (z.B.E2), das an der ERα LBD bindet Rekruten Transkription Coactivator(s) der AF-2-Domäne. Dieses Ereignis bewirkt transkriptionelle Aktivierung ohne Interaktion mit der VP16AD Fusion LBD und macht es schwierig, die LBD Homodimerization Aktivität aufgrund der unspezifischen Hintergrund (Abb. 3C) zu bewerten. Die Aktivität der Kombination (Ii) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Pakt-mERαEF) wurde beobachtet, mit 1 nM und 10 nM E2 Behandlung (Abb. 4A). Es wäre möglich, die Agonist-abhängige ERα LBD Homodimerization Aktivität zu ermitteln, wenn die entsprechenden Liganden-Konzentration zur Erfassung der Aktivität der Kombination (Ii) ohne die Aktivierung der Kombination (i) gefunden werden kann (z. B.die Zustand von 1 nM E2 in Abbildung 4A). So ist es schwer zu erkennen, die Agonisten-vermittelten ERα LBD Homodimerization Aktivität mit M2H Assay. Auf der anderen Seite die Aktivität der Kombination (i) mit 4OHT war die gleiche wie die Fahrzeugkontrolle (0 nM) Ebene (Abbildung 4B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die AF-2 Funktion des ERα nicht durch 4OHT aktiviert ist. Damit die M2H-Assay ist eine praktikable Lösung für die Analyse der Homodimerization Aktivität von ERα LBD mit 4OHT (Abbildung 3B, 3E).

Die Aktivität von der Kombination aus Maus ERα LBD Ausdruck Plasmide (pBIND-mERαEF + Pakt-mERαEF) mit 4OHT war signifikant höher als die Kombination von menschlichen ERα LBD Ausdruck Plasmide (pBIND-hERαEF + Pakt-hERαEF) (Abb. 5A, 5 b). Dieses Ergebnis zeigt, dass die 4OHT-abhängige Homodimerization Aktivität der Maus ERα LBD stärker als menschliche ERα LBD ist. Darüber hinaus haben wir mit der Mensch-Maus F-Domäne-vertauscht ERα LBD Ausdruck Plasmide, mERαEhF (Maus ERα E Domäne mit menschlichen F Domain) und hERαEmF (menschliche ERα E Domäne mit Maus F Domain) 4OHT-abhängige LBD Homodimerization Aktivität analysiert. Die Homodimerization Aktivität der mERαEhF war deutlich geringer als die des mERαEF. Im Gegensatz dazu war die Homodimerization Aktivität der hERαEmF deutlich höher als hERαEF (Abbildung 5C). So scheint es, wie die F-Domäne eine artspezifische 4OHT-abhängige ERα LBD Homodimerization Aktivität beeinflusst.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ERα LBD Dimerisierung Aktivität des 4OHT-ähnlichen Liganden, wie z. B. SERMs, durch die M2H Assay nachgewiesen werden kann. Als Nächstes zeigen wir eine Möglichkeit, die ERα LBD Homodimerization Aktivität der agonistischen Chemikalien zu analysieren. ERα LBD Dimerisierung Aktivitäten der E2 und Diethylstilbestrol (DES) können durch M2H Assay erkannt werden, wenn Sie ein Single-amino-Säure-mutiert ERα LBD (Maus ERα-I362D) zu verwenden. Diese Mutation stört die E2-abhängige Coactivator Rekrutierung Aktivität von ERα LBD-8. Kombination (i) (pG5-Luc + pBIND-mERα-I362D + Pakt) wurde nicht aktiviert durch E2 noch DES in jeder Konzentration wir analysiert (Abb. 6B), das war anders als WT ERα LBD(Abbildung 6). Die ERα-I362D LBD Dimerisierung DES war stärker als E2 (Abb. 6B). Dieser Mutante kann für eine vergleichende Studie der Agonist-abhängige ERα LBD Dimerisierung Tätigkeit verwendet werden; Es erfordert jedoch weitere Analyse und Charakterisierung der biologischen Funktionen dieser Mutante ERα.

Figure 1
Abbildung 1 : Diagramm der Plasmide verwendet für den Assay M2H. (A) dieses Panel zeigt pG5-Luc, die Reporter-Plasmid, das eine GAL4-responsive Element (GAL4 RE) verschmolzen mit einer Luciferase kodierenden gen enthält. (B) dieses Panel zeigt pBIND-mERαEF, das Protein-Expressionsplasmid für GAL4DBD Fusion mERαEF; Renilla-Luciferase arbeitet für die Normalisierung der Transfektion Effizienz. (C) dieses Panel zeigt Pakt-mERαEF, das Protein Expressionsplasmid für nukleare Lokalisierung Signal (NLS)-VP16AD Fusion mERαEF verschmolzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Diagramm der ERα LBD Ausdruck Plasmide in diesem Experiment verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Regelung des Assays M2H. Diese Abbildung zeigt die Vertreter Zustand der Zellen transfiziert mit Kombination (i) Plasmide (links) und die Zellen transfiziert mit Kombination (Ii) Plasmide (rechts). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Liganden-abhängige Dimerisierung Aktivität der Maus ERα LBD. (A) dieses Panel zeigt, die der Luciferase-Aktivität der Zellen mit Kombination (i) Plasmide (pG5-Luc + Pakt + pBIND-mERαEF) oder Kombination (Ii) Plasmide (pG5-Luc + Pakt-mERαEF + pBIND-mERαEF) mit oder ohne E2 transfiziert. (B) zeigt dieses Fenster die Luciferase-Aktivität der Zellen mit Kombination (i) Plasmide oder Kombination (Ii) Plasmide mit oder ohne 4OHT transfiziert. Die Aktivität wird dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SD). Der Graph der Gruppe A wurde von zuvor veröffentlichten Daten11nachgebaut. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Differential Dimerisierung Aktivität von Maus und Mensch ERα LBD mit 4OHT. (A) dieses Panel zeigt der Luciferase-Aktivität der Zellen mit der Kombination von transfiziert Maus ERα LBD Ausdruck Plasmide (Pakt-mERαEF + pBIND-mERαEF) oder die Kombination von menschlichen ERα LBD Ausdruck Plasmide (Pakt-hERαEF + pBIND-hERαEF) mit oder ohne 4OHT. (B) die geringe Aktivität verschiedener Panel A ist vergrößert, um die Dimerisierung Aktivität des menschlichen ERα LBD und experimentelle basalen Ebenen (Pakt, Pakt + pBIND-mERαEF pBIND-hERαEF) zeigen. (C) zeigt dieses Fenster die Luciferase-Aktivität der Zellen mit der Maus-Mensch F-Domäne-vertauscht LBD Ausdruck Plasmide transfiziert. mERαEhF bezeichnet Maus ERα E Domäne verschmolzen mit menschlichen F Domain. hERαEmF bedeutet, dass menschliche ERα E Domäne mit Maus F Domäne verschmolzen. Die Aktivität wird dargestellt als Mittelwert ± SD. Die Diagramme sind von zuvor veröffentlichten Daten1nachgebaut. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Nachweis der Agonist-vermittelten ERα LBD Dimerisierung Aktivität mit einem AF-2 mutiert ERα LBD. (A) dieses Panel zeigt, dass, die der Luciferase-Aktivität der Zellen mit Kombination (i) Plasmide (pG5-Luc + Pakt + pBIND-mERαEF) oder Kombination (Ii) Plasmide (pG5-Luc + Pakt-mERαEF + pBIND-mERαEF) mit oder ohne Liganden transfiziert; E2 (rot), DES (lila). (B) zeigt dieses Fenster die Luciferase-Aktivität der Zellen mit Kombination (i) Plasmide (pG5-Luc + Pakt + pBIND-mERα-I362D) oder Kombination (Ii) Plasmide (pG5-Luc + Pakt-mERα-I362D + pBIND-mERα-I362D) mit oder ohne Liganden transfiziert; E2 (rot), DES (lila). Die Aktivität wird dargestellt als Mittelwert ± SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Hier beschrieben wir das Protokoll für die M2H Assay mit Schwerpunkt auf der Assay-Bedingungen für die Homodimerization Aktivität von ERα LBD als Vorbild. Im Allgemeinen ist die M2H Assay nicht beliebt für die Beurteilung der Liganden-abhängige ERα LBD Dimerisierung Aktivität. Dies ist aufgrund der ERα LBD besitzen eine transkriptionelle Aktivierungsfunktion; deren Tätigkeit stört, in einigen Fällen die Ergebnisse des M2H Assays. Wie wir hier zeigen, kann jedoch M2H Assay verwendet werden, für die Analyse der LBD Dimerisierung Aktivität bestimmter Stoffe, die nicht die AF-2 werden Funktion der LBD (z.B. 4OHT, SERMs) aktivieren. Verringerung die intrinsische Aktivität des LBD (Hintergrundaktivität), wir die niedrigsten E2-haltigen Holzkohle abgestreift FBS aus der Produktionslose ausgewählt und Hitze-inaktivierten Holzkohle abgestreift FBS verwendet. Diese Faktoren sind wichtig für den Erfolg des M2H Assays mit der WT ERα LBD und schwache Wechselwirkung Aktivität zu erkennen. Darüber hinaus zeigten wir ERα LBD Dimerisierung Aktivität des Agonisten (E2 und DES) unter Verwendung der mERα-I362D-Mutante, die stört die Agonist-abhängige Coactivator Rekrutierung Aktivität auf die AF-2. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die M2H Assay für die Beurteilung der Liganden-abhängige ERα LBD Dimerisierung Aktivität nützlicher sein könnte.

Im Bereich NR-Forschung wurde die M2H Assay für die Beurteilung der Liganden-abhängige Coactivator oder Corepressor Rekrutierung Aktivität NR Weihnachtskleidern9,10eingesetzt. Das Plasmid pBIND verschmolzen mit der NR interagierenden Region der Cofaktor dient für diese Art von Experiment anstelle der pBIND-ERαEF. Dieses Experiment wird das kurze Protein-Element, enthält die NR Interaktion Motiv (LxxLL) anstatt ein größeres strukturelles Gebiet das Coactivator verwendet. Eine Möglichkeit ist, dass die größeren Coactivator Element Transkription ohne die Einstellung des VP16AD Fusion LBD aktivieren kann; Das könnten die Ergebnisse von M2H Assay stören. Alternativ kann dieses Protokoll verwendet werden, für die Analyse der Bindung Aktivität einer Vielzahl von Substanzen, die ERα. Zum Beispiel wurden die Zellen mit pG5-Luc, pBIND verschmolzen NR interagierenden Motiv und Pakt-ERαEF Plasmide transfiziert und dann mit verschiedenen Chemikalien, wie z.B. endokrine Störung Chemikalien oder mögliche hormonelle Therapie behandelt. Wenn die Luciferase-Aktivität von einer Chemikalie in diesem Assay erhöht wird, wird vorhergesagt, dass die Chemikalie sollte die Interaktion mit der ERα LBD NR interagierenden Motiv8zu rekrutieren.

Die M2H Assay zeigt Protein-Protein-Interaktionen in Säugerzellen. Wie in der Einleitungerwähnt, kann die physiologische Rolle von Protein-Protein-Interaktionen in einer Zelle-Typ-spezifischen Kontext unterscheiden. M2h Assays können die Ergebnisse von Protein-Protein Interaktion Aktivität im gleichen Zusammenhang mit zellulären bieten, die für andere Experimente, wie die Analyse der transkriptionelle Aktivität verwendet wird. Darüber hinaus kann es die Wirkung von Zelle signalisieren Modulatoren (z.B., Inhibitoren oder Aktivatoren der Kinasen) mit Protein-Protein-Interaktionen in den Zellen analysieren. Dies ist ein Vorteil im Vergleich zu anderen Studien in Vitro Proteinprotein Interaktion M2H-Assay.

Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass die Protein-Protein-Wechselwirkungen erkannt, dass über die M2H Assay keine direkte Interaktion zwischen zwei Proteine darstellen könnte. Das heißt, gibt es die Möglichkeit, dass zelluläre bestimmt vorhanden sind, die eine Verbindung zwischen zwei Proteine erlaubt sind. Wenn solch eine Überlegung ergibt, sollte die Bewertung der in-vitro- Studien zu Protein-Protein Wechselwirkungen erforderlich, z. B. der GST-Fusion Protein Pulldown Test sein. Darüber hinaus ist es besser, die Expression von pBIND und Pakt-Plasmid-gewonnenen Proteinen in den Zellen für die Ertragskraft der Assay-System zu überprüfen. Vor allem, wenn die Interaktion Aktivität erkannt werden kann, hilft die Informationen die Proteingehalte Ausdruck, um die Ursache für das Ergebnis zu bestimmen. Anti-Gal4DBD-Antikörper und Anti-VP16AD Antikörper können für ein western-Blot Analyse verwendet werden.

Wenn das Labor des Versuchsaufbaus für Luciferase Reporter Assays, die verwendet werden können wurde, für die Analyse der Transkription Aktivität regulatorischer Elemente oder Faktoren reguliert, es ist ganz einfach den M2H Test durchführen. Die M2H-Assay ist eine vorteilhafte additive Methode für transcriptional Regelung Studien.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verzollen.

Acknowledgments

Die Autoren danken DRS. Sueyoshi und Wang an das National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts und Tanner Jefferson für die Durchführung von Verfahren auf dem Video. Diese Arbeit wurde von den nationalen Instituten der Gesundheit Grant 1ZIAES070065 (zu K.S.K.) aus der Division des intramuralen Forschung von den NIEHS unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

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References

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Cancer Research Ausgabe 142 Mammalian Zweimischling Assay Östrogen-Rezeptor Alpha nukleare Rezeptor Liganden-bindende Domäne Dimerisierung Tamoxifen selektive Östrogen-Rezeptor-modulator
Erkennung der Liganden-bindende Domäne Dimerisierung Aktivitäten von Östrogen-Rezeptor Alpha mit den Säugetieren Zweimischling Assay
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Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

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