Summary
我们提出了一种方法来分析 4-羟基他莫西芬依赖雌激素受体α配体结合域二聚化活性的哺乳动物双杂交法。
Abstract
雌激素受体α (erα) 是一种雌激素配体依赖性转录调节剂。在物种中, erα蛋白的序列高度保守。人们认为人和小鼠的 erα功能是相同的。我们证明了差异 4-羟基他莫西芬 (4oht) 对小鼠和人 erα配体结合域 (lbd) 二聚化活性的影响, 使用哺乳动物双杂交 (m2h) 法。m2h 分析可以利用两个蛋白质表达质粒 (gal4 dna 结合域 [dbd] 融合 lbd 和 vp16 转活化域 [vp16ad] 融合 lbd) 的转染, 证明 lbd 在哺乳动物细胞中的共读活性的有效性。gal4 反应元件 (gal4re) 熔融荧光素酶报告质粒。当 gal4dbd 融合 lbd 和 vp16ad 融合 lbd 在细胞中产生二聚体时, 这种蛋白质复合体与 gal4re 结合, 然后通过 vp16ad 依赖转录活性激活荧光酶基因表达。用小鼠 erαlbd 融合蛋白表达质粒转染的 hepg2 细胞的 4 oh 介导的荧光素酶激活率高于人 erαlbd 融合蛋白表达质粒转染细胞。结果表明, 4oht 依赖性小鼠 erαlbd 共读活性高于人 erαlbd。一般来说, m2h 分析的使用并不理想于评估核受体 lbd 二聚化活性, 因为抗性配体增强了 lbd 活性的基础水平, 并阻碍了 lbd 二聚体活性的检测。我们发现4oht 不能增强 erα lbd 的基础活性。这是能够确定和检测与4oht 相关的 lbd 二聚化活性的关键因素, 以便成功地使用 m2h 检测。基于 erα lbd 的 m2h 检测可用于研究选择性雌激素受体调节剂 (如4oht) 在不同哺乳动物细胞类型中的部分激动剂活性。
Introduction
雌激素受体α (erα) 是一种雌激素配体依赖性转录调节剂。erα的氨基酸序列在物种中高度保守。由于人类和小鼠 erα的同源性较高, 这些受体的功能被认为是相同的, 而这些物种中雌激素物质 (如他莫西芬) 的差异活性是由该物种在化学代谢, 而不是由 erα的结构差异。erα具有高度保守的域结构, 这些结构在核受体 (nr) 超家族中很常见, 被指定为 a 到 f 域。e 域或配体结合域 (lbd) 包括配体结合口袋和转录激活功能 2, 名为 af-2。f 域紧邻 e 域进行本地化, 是 nr 中变化最大的域。即使在人和小鼠 erα之间, f 域的同源性也明显低于其他域1。erα的配体 lbd 增强了 erα蛋白的同质化, 直接结合特定的雌激素反应 dna 元素, 以调节木质依赖性基因转录 (erα的经典作用)。晶体学研究揭示了螺旋 12 (af-2 核域) 与雌二醇 (e2) 或 4-羟基-他莫西芬 (4oht) 结合 lbd 二聚体2,3的差异定位。erαf 域 (45个氨基酸) 直接连接螺旋12。然而, 没有关于这种扩展45氨基酸 (f 域) 从螺旋12对 erα lbd 二聚化的影响的信息。在这项研究中, 我们证明了 f 域的贡献, 特定于物种依赖的 eα lbd 同质化使用哺乳动物双杂交 (m2h) 的分析。
m2h 检测是一种证明哺乳动物细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的方法, 它引入了三种不同的质粒 dna: 两种蛋白表达质粒, 表达了 gal4 dna 结合域 (dbd) 融合 erαlld 和 vp16ad 融合 erαldd, 和gal4re 熔融荧光素酶表达报告质粒。当 gal4dbd 融合 erαlbd 和 vp16ad 融合 erα lbd 在细胞中相互作用 (使二聚体) 时, 这种蛋白质复合体与 gal4re 结合, 然后通过 vp16ad 相关的转活化功能激活荧光酶基因表达。lbd 共氧化水平可以通过荧光素酶活性来评价。
酵母双杂交 (y2h) 检测是一种基于与宿主环境相同的原理的替代方法。以前使用 y2h 系统的报告表明, f-域截断人 erα lbd 增加了 e2 依赖协同剂的招募, 结论是 f 域阻止 e2 介导的转录4。这一结果与其他报告不一致, 这些报告表明 f-域截断人 erα在哺乳动物细胞5,6中的衰减转录活性。最近, 我们的研究表明, 利用 m2h 系统, 人类 erαlbd 的 e2 依赖共激活剂的招募活性在哺乳动物细胞中的 f 域截断降低, 并与转录活性1一致。这些观察表明, 蛋白质-蛋白质相互作用的生理作用在细胞类型特定的方式和背景不同。m2h 检测可以在用于确定转录活性的同一细胞环境中显示蛋白质-蛋白质相互作用。与 M2H 或其他体外蛋白质-蛋白质相互作用分析相比, 这提供了 m2h 分析的优势。
关于选择性雌激素受体调节剂 (serm) (例如, 4oht) 调节 erα介导的转录的部分激动剂活性的分子机制仍存在疑问。基于 erα lbd 的 m2h 检测可用于研究各种哺乳动物细胞类型中 serm 的部分激动剂活性的机制。
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Protocol
1. 哺乳动物双杂交法质粒的制备
- 使用以下质粒: pg5-luc、pbind-erαef 和 apst-erαef。
注: 这些质粒可根据要求从作者处获得, 并通过滤纸发送。pg5-luc 是一种带记者的质粒, 它包含与荧光素酶表达单元融合的 gal4 反应元素的5次重复 (图 1a)。pbind-erαef 是 gal4dbd-熔融 erα lbd 蛋白的蛋白表达质粒。pbind-erαef 包含一个雷尼利亚荧光素酶表达单位, 用于使转染效率正常化 (图 1b)。pact-erαef 是 vp16ad-融合 erα lbd 蛋白的蛋白表达质粒 (图 1c)。从质粒中表达的蛋白质结构图如图 2所示。 - 准备质粒 dna。
- 用干净的剪刀将塑料装载区域从纸张上剪下, 放入 1.5 ml 管中。戴上手套, 用干净的推子拿起装有等离子体的纸。加入100μl 的 tris-edta (te) 缓冲液 (ph 8.0) 和涡旋。
- 从步骤1.2.1 到合格的大肠杆菌细胞 (见材料表), 加入 1μl 的质粒 dna 溶液, 并将管放在冰上15分钟。
- 热休克等离子体添加的有能力细胞;在42°c 的水浴中孵育管 30秒, 然后在冰上保持2分钟。
- 在试管中加入250μl 的超最佳肉汤, 并在管道中进行分解代谢抑制 (soc) 介质 (室温), 并在37°c 下晃动30分钟培养。
- 将培养的大肠杆菌板100μl 放在预热的尿液 (lb) 板上, 并在37°c 下培养。
- 从盘子中取出一个菌落, 加入一个14毫升的管中, 其中含有2毫升的了不起的肉汤 (tb), 含有100μml 的氨匹西林。在37°c 时晃动直到介质被微弱地笼罩的培养。
- 从步骤1.2.6 将培养的培养基添加1毫升, 加入装有50毫升结核病的高压灭菌250毫升玻璃瓶, 并含有100μgml 氨匹西林。在37°c 下晃动20-24小时的培养。
- 使用摇桶转子, 在室温下将培养的大肠杆菌转移到50毫升锥形管和离心机 , 温度为 3450 x g, 时间为30分钟。丢弃介质。将大肠杆菌颗粒保存在-80°c。
- 在大肠杆菌颗粒中加入3毫升细胞再悬浮液 (见材料表), 并将其完全悬浮。加入3毫升的细胞裂解溶液 (见材料表), 将管轻轻搅拌 10倍, 并将其保持在冰上 5分钟 (准时保持时间)。加入6毫升的中和溶液 (见材料表), 将管材稳定地与攻丝混合, 然后在冰上保持10分钟。
- 使用摇桶转子, 在4°c 下以 3450 x g的温度离心管30分钟。将含有 dna 的溶液转移到新的50毫升锥形管, 并添加10毫升的 dna 纯化树脂 (见材料表)。轻轻悬挂树脂。
- 用摇桶转子以 625 x 克的速度离心管1分钟。丢弃溶液并将树脂保持在底部。
- 在50毫升锥形管中加入15毫升柱状洗涤液 (80 mm 醋酸钾、8.5 mm Tris-HCl [ph 7.5]、40μm edta 和55% 乙醇), 轻轻摇匀以树脂。重复步骤1.2.11。
注: 柱状洗涤液必须使用经过二乙基碳酸氢盐 (depc) 处理的水或无核酸水制备。 - 在50毫升锥形管中加入5毫升柱状洗涤液, 用5毫升管悬浮树脂。将树脂涂在真空歧管上设置的柱 (见材料表) 上。将色谱柱吸尘, 直到树脂干燥。在柱和真空中加入6毫升柱状洗涤液。
- 一旦树脂在视觉上干燥, 将储层从柱中分离出来。将色谱柱 (树脂) 的底部转移到 1.5 ml 管中。用微型离心机将树脂以最大速度离心2分钟。
- 将色谱柱 (树脂) 的底部转移到新的 1.5 ml 管中。在柱中加入300μl 的无核酸酶水, 并等待整个树脂被浸泡。
- 以最大速度离心柱 1分钟, 收集含有 dna 的质粒溶液 (200-250μl)。
- 用酚氯仿 (1:1) 处理含有 dna 的溶液, 然后用氯仿处理, 如下所示。
- 在含 dna 的溶液 (200-250μl) 中加入相同体积的苯酚-氯仿 (1), 用微型离心机以最大速度摇匀和离心机2分钟。收集上层 (含 dna 溶液), 并将其添加到一个新的 1.5 ml 管。重复此步骤1x。
- 将相同体积的氯仿添加到含有 dna 的溶液 (200-250μl) 中, 以最大速度摇匀, 离心机1分钟收集上层 (含 dna 溶液), 并将其添加到 1.5 ml 管中。
注: 内毒素 (脂多糖) 在某些细胞中诱导细胞信号。为了避免这种不可预测的影响, 建议采取步骤 1.2.17, 这样可以减少内毒素污染。
- 利用乙醇沉淀技术沉淀质粒 dna, 如下所示。
- 在含 dna 溶液中加入 3 m 醋酸钠 (ph 5.5) 和2倍的3m 醋酸钠体积, 即100% 乙醇。例如, 在 dna 溶液的250μl 中加入27.8μl 的 3 m 醋酸钠和278μl 的100% 乙醇 (最终体积为 555.8μl)。
- 将溶液保持在-80°c, 至少20分钟。在4°c 下以最大速度离心20分钟。丢弃溶液并保留颗粒。加入200μl 的75% 乙醇, 并冲洗管内。在4°c 下离心 20分钟, 丢弃溶液, 并保留颗粒。使用真空集中器擦干 dna 颗粒。
- 在管中加入 100-250μl te 缓冲液 (ph 值 8.0)。溶解 dna 颗粒, 并使用分光光度计检查 dna 浓度的波长为260纳米。将 dna 浓度保持在 0.5 mg/ml 左右。
2. 哺乳动物双杂交法
- 维护单元格。
- 用750毫升、175厘米 2组织培养瓶培养人类肝癌 hepg2 细胞, 用无酚最低必需培养基 (mL) 补充10% 的胎牛血清 (fbs; 热灭活)、2mm l-谷氨酰胺和1%青霉素链霉素溶液 (抗生素) 用于维持细胞。
- 在5% 的 co2 补充, 37°c 的孵化器培养细胞, 直到细胞约90% 融合.
注: 为了减少雌激素的背景活性, 所有 m2h 实验都应使用无酚的无红色介质。这一步骤应在清洁的工作台/生物安全柜内进行。细胞应按照一般哺乳动物细胞培养协议7进行维护。
- 准备转染的细胞。
注: 应在清洁工作台/生物安全柜内执行以下程序步骤。在这一步中, 细胞每次都在5% 的 co2补充、37°c 的孵化器中培养。- 将90% 的融合细胞重新装上24孔板;用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 冲洗细胞1x。
- 在培养瓶中加入7毫升0.05% 的胰蛋白酶 edta 溶液, 浸泡细胞 1-2分钟, 同时在室温下将培养瓶保持在干净的长凳上。取出部分胰蛋白酶 edta 溶液, 并将溶液的 1-2 ml 留在培养瓶中。在孵化器中孵育培养瓶1-2分钟。
- 在烧瓶底部打分离细胞, 并在显微镜下检查细胞。
注: 如果细胞仍连接到烧瓶上, 再孵育 1-2分钟, 然后重复步骤2.2.3。 - 将细胞悬浮在无酚红素 mM 中, 辅以10% 的含焦 fbs (热灭活)、2mm l-谷氨酰胺和1% 的青霉素链霉素溶液。
注: 必须使用带菌剥离的 fbs 来减少血清中源性雌激素的影响。 - 在 1.2 x 10 5 细胞的密度下, 在24孔板中计数细胞数量和种子细胞。为每个数据点分配三口井 (三式三份)。
- 培养细胞一夜之间。继续2.4.1 步骤。
- 准备用于转染的 dna 混合物。
注: 以下质粒 dna 在一口井中转染: 100 ng pg5-luc 报告质粒、50个 g4dbd 融合蛋白表达质粒 (pbind) 和 50 ng vp16ad 融合蛋白 (pact) 表达质粒。- 要分析配体依赖性 erα lbd 二聚化活性, 请准备以下组合 (图 3)。组合 (i): pg5-luc + pbind-erαef + pact, 和 pg5-luc + pbind-merαef + pact。组合 (二): pg5-luc + pbind-erαef + pact-erαef, 和 pg5-luc + pcind-merαef + pact-erαef。组合 (三): pg5-luc + pG5 + pact-erαef, 和 pg5-luc + pG5 + acct-merαef。
注: 组合 (i) 分别代表人 erα lbd 和小鼠 erα lbd 的基本实验水平。如果结果显示单独使用配体的水平非常高, 这种方法与该配体一起使用是不可行的 (例如, 二乙基雌石 [des])。组合 (ii) 分别代表二聚体人 erα lbd 和二聚体小鼠 erα lbd 的水平。组合 (三) 表示负对照;仅当第一次执行实验以评估系统的背景级别时, 才使用此集。 - 在混合之前, 根据转染井的数量计算所需的 dna 总量。对于在三联和五个数据点进行的实验, 将以下质粒 dna 混合在两个1.5 μl 管中, 用于组合 (i) 和 (ii): pg5-luc, 5 (数据点) x 3 (井) x 100 ng = 1, 500 纳克 (15μl);pbind-merαef, 5 (数据点) x 3 (井) x 50 纳克 = 750 纳克 (7.5μl);pact (组合 i) 或 pact-merαef (组合 ii)、5 (数据点) x 3 (井) x 50 纳克 = 750 纳克 (7.5 μl)。
注: 每个质粒 dna 溶液的浓度为0.1μμμl。 - 利用乙醇沉淀技术沉淀 dna 混合物。在 dna 混合物中加入 3 m 醋酸钠 (ph 5.5) 和2倍的3m 醋酸钠体积, 即100% 乙醇。然后, 旋涡管。
注: 例如, 在步骤2.3.2 中举例说明的30μl 质粒 dna 混合物中加入3.4 微米的 3 m 醋酸钠, 并加入34μl 的100% 乙醇。此步骤有助于保持不变的转染条件, 并且不需要在生物安全柜中执行此步骤。 - 将混合物保持在-20°c 过夜。在4°c 下, 以最大速度离心20分钟。丢弃溶液 (颗粒是不可见的)。在试管中加入120μl 的75% 乙醇;然后, 冲洗管的内部。在4°c 下离心20分钟。丢弃溶液, 使用真空集中器将 dna 混合物干燥30分钟。
- 要分析配体依赖性 erα lbd 二聚化活性, 请准备以下组合 (图 3)。组合 (i): pg5-luc + pbind-erαef + pact, 和 pg5-luc + pbind-merαef + pact。组合 (二): pg5-luc + pbind-erαef + pact-erαef, 和 pg5-luc + pcind-merαef + pact-erαef。组合 (三): pg5-luc + pG5 + pact-erαef, 和 pg5-luc + pG5 + acct-merαef。
- 执行转染。
注: 应在干净的长凳或生物安全柜中执行以下步骤。- 第二天早上, 用 0.5 ml 的 pbs (室温) 冲洗24孔板 (从步骤 2.2.6) 2 x 中播种的细胞。
- 在每口井 (0.5 ml/井) 中加入温热 (37°c) 新鲜的无红的 mM, 再加上10% 的带木炭的 fbs (热灭活) 和 2 mm l-谷氨酰胺, 而不添加抗生素。将细胞保存在5% 的二氧化碳补充, 37°c 的孵化器中。
- 悬浮在 dulbecco 改性的 eagle 培养基 (dmem) 中的干质粒 dna 混合物 (从步骤 2.3.4) (无血清, 不含苯酚红色, 无谷氨酰胺; 13μl/well)。根据转染井的数量计算 dmem 的数量。
注:15 口井用于组合 (i) x 13μl = 195μl, 15 口井用于组合 (ii) x 13μl = 195μl。 - 将转染试剂 (见材料表; 1.5μl/well) 悬浮在另一个 1.5 ml 管中的 dmem (12.5μl·well) 中。从转染井的数量计算转染试剂和 dmem 的数量。
注:30 [15 口井用于组合 (i) 和15口组合 (ii)] x 1.5μl 转染试剂 + 30 x 125μl 的 dmem = 420μl。 - 在每个管中添加相同数量的转染试剂介质 (从步骤 2.4.4) (从步骤 2.4.3)。在室温下将管材孵化5-10分钟。
注: 转染试剂介质 + 195μl 组合 (i) dna 混合物 = 395μl, 转染试剂介质 + 195μl 组合 (ii) dna 混合物 = 395μl。在组合 (i) 和 (ii) 的试管中添加等量的转染试剂介质是很重要的。在这一步中, 没有必要用完介质。 - 将组合混合物 (从步骤 2.4.5) 添加到24井板的每口井 (25μl·well) 中 (从步骤 2.4.2), 并在 5% co 2-补充的37°c 孵化器中孵育细胞6小时。
- 从24孔板上取出转染介质。加入温热 (37°c) 新鲜的无红蛋白 mM, 辅以10% 的含焦 fbs (热失活)、2 mm l-谷氨酰胺、1% 的青霉素链氨酸溶液和配体 (悬浮在乙醇中) (0.5 ml medium/well)。在 5% co 2 补充、37°c 孵化器中培养细胞 16-18小时.
- 收集样品。
- 用1毫升的 pbs 冲洗细胞, 然后加入100μl 的1x 被动裂解缓冲液 (见材料表)。
- 用涡流混合器大力摇晃24孔板, 使细胞分离。
- 用液氮将板材 (细胞裂解物) 冷冻 1x, 或在分析前将其保存在-80°c。在检测前, 用力摇晃振动台上的盘子, 直到它们处于室温。
注: 此过程可防止不规则地出现不规则的荧光素酶活性值。
- 进行双荧光素酶检测。
- 为双荧光素酶检测系统准备试剂 (见材料表)。
- 为使荧光素酶分析底物 (las) 缓冲液中加入所有荧光素酶分析缓冲液, 并将其添加到玻璃棕色瓶中的荧光素酶分析基板中。将 las 缓冲区保存在-20°c。
注: las 缓冲液在使用前应加热至室温。 - 为了使雷尼利亚荧光素酶底物 (rls) 缓冲液, 将雷尼拉荧光素酶底物和雷尼拉荧光素酶缓冲液混合在1:50 的比例下。为每次检测制作新鲜的 rls 缓冲液, 并使用黑色管或被锡油遮挡的管。计算 rls 缓冲区的数量, 使一个新的缓冲区。
注: 使用前, rls 缓冲液应加热至室温。
- 为使荧光素酶分析底物 (las) 缓冲液中加入所有荧光素酶分析缓冲液, 并将其添加到玻璃棕色瓶中的荧光素酶分析基板中。将 las 缓冲区保存在-20°c。
- 在微板读取器中设置试剂。
- 用70% 乙醇清洗注塑生产线 2倍;然后, 用水清洗2倍的线路。
注: 这对于防止干扰检测结果非常重要。 - 将 las 缓冲区设置为 p 型喷射器线 (第一次注入), 并将 rls 缓冲区设置为 m 型喷射器线 (第二次注入)。不要混合这些缓冲区。rls 缓冲抑制荧光素酶活性。
- 用70% 乙醇清洗注塑生产线 2倍;然后, 用水清洗2倍的线路。
- 将10μl 采集的样品 (从步骤 2.5.3) 涂在96井白色塑料板上。
- 将以下设置应用于微板读取器。对于 p 型喷射器, 使用50μl 的体积, 2秒的延迟, 速度为50μls/。对于 m 型喷射器, 使用50μl 的体积, 延迟为 2秒, 速度为 50μlss. 将积分时间设置为 15秒. 将温度设置为25°c。
- 运行微板读取器。
- 使用数据采集程序记录荧光素酶活性值 (ipvalue) 和雷尼利亚荧光素酶活性 (imvalue) 的值 (见材料表)。
- 数据收集后清洗注入行 (请参阅步骤 2.6.2.1)。
- 为双荧光素酶检测系统准备试剂 (见材料表)。
- 执行数据分析。
- 使用规范化值 (ipvalue/imvalue) 进行数据分析。
- 将组合 (i) [pg5-luc + pbind-erαef + pact] 与车辆 (0 nm 配体) 的归一化值设置为 1, 用于计算基底水平和同读 erα lbd 水平。级别表示为 "相对活动"。
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Representative Results
图 3显示了组合 (i) 和组合 (ii) 等离子体转染细胞中可能的响应方案。实验结果如图 4所示。组合 (i) (pg5-luc + pbind-merαef + pact) 的活性显示 10 nm e2 的刺激 (图 4a), 因为 erα lbd 包含配体依赖性的失活功能域 af-2。与 erα lbd 结合的农学体 (例如e2) 招募转录共动剂到 af-2 域。此事件导致转录激活, 而不与 vp16ad 融合 lbd 交互, 并由于非特异性背景的原因, 很难评估 lbd 的同质化活动 (图 3c)。通过 1 nm 和 10 nm e2 处理 (图 4 a) 观察到组合 (ii) (pg5-luc + pbind-mersaf + apstt-merαef) 的活性。如果能够找到适当的配体浓度来检测组合 (ii) 的活性, 而不激活组合 (i), 则可以确定与抗体依赖的 erα lbd 共读活性 (例如,条件为图 4a中的 1 nm e2)。因此, 使用 m2h 法检测激动介导的 erα lbd 同质化活性是很困难的。另一方面, (i) 与4oht 的组合活动与车辆控制 (0 nm) 水平相同 (图 4b)。这些结果表明, erα的 af-2 函数不是由4oht 激活的。因此, m2h 分析是分析与4oht 的 erα lbd 同质化活性的可行选择 (图 3b, 3e)。
小鼠 erαlbd 表达质粒 (pbind-merαef + apt-marαf) 与4oht 的组合所产生的活性明显高于人 erα lbd 表达质粒 (pbind-er-erαef + pact-herαef) 的组合 (图 5a, 5b)。结果表明, 小鼠 erα lbd 的4ot 依赖性均读活性比人 erα lbd 更有效。此外, 我们还利用人与人的手 f-域交换 erα lbd 表达质粒、merαehf (具有人 f 域的小鼠 erαe 域) 和 erα emf (具有小鼠 f 域的人 erα e 域) 分析了与4oht 相关的 lbd 同质化活性。merαehf 的同质化活性明显低于 merαef。与此形成对照的是, erα emf 的同质化活性明显高于 erαef (图 5c)。因此, 似乎 f 域对特定于物种的4oht 依赖 erα lbd 共读活性有影响。
这些结果表明, m2h 法检测到 4 oh 样配体 (如 serm) 的 erα lbd 二聚化活性。接下来, 我们展示了一种分析激动化学物质 erα lbd 共读活性的可能方法。使用单氨基-酸突变的 erα lbd (小鼠 erα-i362d) 时, m2h 法检测出 e2 和二乙基雌酚 (des) 的 erα lbd 二聚体活性。这种突变破坏了 erα lbd 8 的 e2 相关共激活剂招募活动.组合 (i) (pg5-luc + pbind-merd-mer-i362d + pact) 在我们分析的任何浓度下没有被 e2 或 des 激活 (图 6b), 这与 wt erα lbd (图 6a) 不同。des 的 erα-i362d 二聚化活性高于 e2 (图 6b)。该突变体可用于对激动性依赖 erα lbd 二聚化活性的比较研究;然而, 它需要进一步的分析和这个突变的 erα的生物功能的表征。
图 1: 用于 m2h 检测的质粒示意图.(a) 这个面板显示 pg5-luc, 记者质粒, 其中包含一个 gal4 反应元素 (gal4 re) 融合与荧光素酶编码基因。(b) 该面板显示 pbind-merαef, gal4dbd 融合 merαef 的蛋白表达质粒;雷尼拉荧光素酶的工作原理是使转染效率正常化。(c) 该面板显示 pact-merαef, 核定位信号 (nls) 的蛋白表达质粒-融合 vp16ad 融合 merαef。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 本实验中使用的 erαlbd 表达质粒图.请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: m2h 检测方案.此图显示了组合 (i) 质粒 (左) 转染的细胞和组合 (ii) 质粒 (右) 转染的细胞的代表性状况。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 小鼠 erα lbd 的配体依赖性二聚化活性.(a) 该面板显示了与组合 (i) 质粒 (pg5-luc + pG5 + pbind-merer) 转染的细胞的荧光素酶活性α ef) 或组合 (ii) 质粒 (pg5-luc + apst-melαef + 双苯醚-梅尔α-ef), 有或没有 e2。(b) 该面板显示与组合 (i) 质粒或组合 (ii) 具有或不具有4oht 的质粒转染的细胞的荧光素酶活性。该活动表示为标准偏差 (sd) 的均值±。面板a的图形是根据以前公布的数据11重新创建的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5* 小鼠和人 erα lbd 与4oht 的微分二聚化活性.(a) 该面板显示小鼠 erα lbd 表达质粒 (aptt-merαef + p) 联合转染的细胞的荧光素酶活性. 或人 erαlbd 表达质粒 (pact-erαef + pbind-er-erαef) 与或没有4oht。(b) 放大 a 面板的低活度, 以显示人 erα lbd 和实验基础水平 (pact + pbind-mer-α ef, pact + pbind-pbind-er-erαef) 的二聚化活性。(c) 该面板显示了用鼠尾流-域交换的 lbd 表达质粒转染的细胞的荧光素酶活性。erαehf 表示与人 f 域融合的小鼠 erαe 域。erα emf 表示与小鼠 f 域融合的人 erαe 域。该活动表示为平均值± sd。这些图形是根据以前发布的数据1重新创建的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 使用 af-2 突变 erα lbd 检测激动介导的 erα lbd 二聚体活性。(a) 该面板显示了与组合 (i) 质粒 (pg5-luc + pG5 + pbind-merer) 转染的细胞的荧光素酶活性α ef) 或组合 (ii) 有或不具有配体的质粒 (pg5-luc + pact-melαef + 双苯双色谱 e);e2 (红色), des (紫色)。(b) 该面板显示了与组合 (i) 质粒 (pg5-luc + pact + pcidd-er-er-erα-i362d) 转染的细胞的荧光素酶活性) 或组合 (ii) 有或不具有配体的质粒 (pg5-luc + pact-merα-i362d + pbind-meld-erα-i362d);e2 (红色), des (紫色)。活动表示为平均值± sd. 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在此, 我们描述了 m2h 检测的方案, 重点介绍了检测 erα lbd 共读活性的检测条件。一般来说, m2h 检测是不受欢迎的评估配体依赖 erα lbd 二聚化活性。这是由于 erα lbd 具有转录激活功能;在某些情况下, 其活性会干扰 m2h 测定的结果。然而, 正如我们在这里所证明的, m2h 分析可用于分析某些不激活 lbd af-2 转化功能的物质 (例如, 4oht, serm) 的 lbd 二聚体活性。为了减少 lbd (背景活动) 的内在活性, 我们从生产场中选择了含有 e2 的含氧带煤 fbs 的最低部分, 并采用了热灭活带木炭 fbs。这些因素对于使用 wt erα lbd 进行的 m2h 检测的成功和检测弱相互作用活性的研究都很重要。此外, 我们还显示了激动剂 (e2 和 des) 的 erα lbd 二聚化活性, 它使用 merα-i362d 突变体, 它破坏了 af-2 的激动剂依赖共激活剂的招募活动。这些结果表明, m2h 检测可为评价配体依赖性 erα lbd 二聚化活性提供更多的参考。
在 nr 研究领域, m2h 检测已被用于评估 nr lbd 9,10的配体相关共激活剂或协征分子招募活性。pbind 的质粒与辅因子的 nr 相互作用区域融合在一起, 用于此类实验, 而不是使用 pbind-erαef。本实验使用含有 nr 相互作用母题 (lxxll) 的短蛋白质元素, 而不是协同剂的一个较大的结构域。一种可能是较大的协同剂元素可以激活转录, 而无需招募 vp16ad 融合 lbd;可能会干扰 m2h 检测的结果或者, 该协议可用于分析各种物质与 erα的结合活性。例如, 这些细胞是用 pg5-luc、pbind 熔融 nr 相互作用的主题和 apst-erα质粒转染的, 然后用各种化学物质进行治疗, 如干扰内分泌的化学品或潜在的激素疗法。如果在本试验中, 荧光素酶活性增加, 则可以预测该化学物质应与 erα lbd 相互作用, 以招募 nr 相互作用的主题8。
m2h 检测显示了哺乳动物细胞中蛋白质与蛋白质的相互作用。正如我们在导言中提到的, 在细胞类型特定的上下文中, 蛋白质-蛋白质相互作用的生理作用可能不同。m2h 检测可以提供蛋白质-蛋白质相互作用的结果, 在相同的细胞环境中用于其他实验, 如转录活性的分析。此外, 它还可以分析细胞信号调节器 (如激酶抑制剂或激活剂) 与细胞中蛋白质-蛋白质相互作用有关的效果。与其他体外蛋白-蛋白质相互作用研究相比, 这是 m2h 检测的优势。
然而, 需要考虑的是, 通过 m2h 检测到的蛋白质-蛋白质相互作用可能并不代表两种蛋白质之间的直接相互作用。换句话说, 有一种可能性是细胞因子的存在, 它允许两种蛋白质之间的联系。如果出现这种考虑, 则需要对体外蛋白-蛋白质相互作用研究进行评估, 例如 gst 融合蛋白下拉试验。此外, 最好检查 pbind-pact-质粒蛋白在细胞中的表达水平, 以评估检测系统的性能。特别是当无法检测到相互作用活动时, 蛋白质表达水平的信息有助于确定结果的原因。抗 gal4dbd 抗体和抗 vp16ad 抗体可用于西方印迹分析。
如果实验室有荧光素酶检测的实验设置, 可用于分析调节因子或调节因子的转录活性, 那么进行 m2h 检测是相当简单的。m2h 检测是转录调控研究的一种有利的添加剂方法。
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Disclosures
提交人没有什么可申报的。
Acknowledgments
作者感谢国家环境卫生科学研究所 (niehs) 的 sueyoshi 博士和 wang 博士对手稿的批判性解读, 并感谢坦纳·杰斐逊在视频中执行的程序。这项工作得到了 niehs 内部研究司的国家卫生研究所 1zaaes070065 (至 k. s. k.) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
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