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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi

Published: December 19, 2018 doi: 10.3791/58758
Automatic Translation
1, 1
1Reproductive Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIH)

Summary

Presentiamo un metodo per analizzare la 4-idrossi-tamoxifen-dipendente dell'estrogeno recettore alfa ligand-legantesi dominio dimerizzazione attività usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi.

Abstract

Recettore degli estrogeni (ERα) è un regolatore della trascrizione di ligando-dipendenti estrogenici. La sequenza della proteina ERα è altamente conservata tra le specie. Si è pensato che la funzione dell'essere umano e il mouse ERαs è identico. Dimostriamo l'effetto differenziale 4-idrossi-tamoxifen (4OHT) il mouse e attività dimerizzazione del dominio (LBD) del ligand-legantesi ERα umana usando l'analisi di (M2H) due-ibrido dei mammiferi. Il dosaggio di M2H in grado di dimostrare l'efficienza delle attività di omodimerizzazione LBD in cellule di mammifero, che utilizzano la transfezione di due plasmidi di espressione della proteina (GAL4 DNA-binding dominio [DBD] fusione LBD e VP16 transactivation dominio [VP16AD] fusione LBD) e un Elemento Gal4-sensible a reagire (GAL4RE) fuso plasmide del reporter di luciferase. Quando la fusione GAL4DBD LBD e la fusione di VP16AD LBD fanno un dimero nelle cellule, questo complesso della proteina si lega per il GAL4RE e, quindi, attiva un'espressione di gene della luciferasi attraverso l'attività di trascrizione dipendente VP16AD. L'attivazione di 4OHT-mediata luciferasi è maggiore nelle cellule HepG2 che sono state trasfettate con i plasmidi della espressione di proteina fusione ERα LBD di mouse rispetto nelle cellule del plasmide transfettata espressione umane del proteina fusione ERα LBD. Questo risultato suggerisce che l'efficacia del mouse 4OHT-dipendente attività omodimerizzazione ERα LBD è superiore umano ERα LBD. In generale, l'utilizzo del dosaggio M2H non è ideale per la valutazione dell'attività di dimerizzazione LBD recettore nucleare, perché agonistiche ligandi che permettono di migliorare il livello basale dell'attività LBD e che impedisce la rilevazione di attività di dimerizzazione LBD. Abbiamo trovato che 4OHT non migliora l'attività basale ERα LBD. Che è un fattore chiave per essere in grado di determinare e rilevare l'attività di dimerizzazione di LBD 4OHT-dipendente per con successo usando l'analisi M2H. Analisi di M2H ERα LBD-based possono essere applicate per studiare l'attività agonista parziale dei modulatori del recettore estrogeno selettivo (ad esempio, 4OHT) in vari tipi di cellule di mammifero.

Introduction

Recettore degli estrogeni (ERα) è un regolatore della trascrizione di ligando-dipendenti estrogenici. La sequenza dell'amminoacido ERα è altamente conservata tra le specie. A causa di più alta omologia tra umani ed ERα il mouse, la funzione di questi recettori è pensata come identici, e l'attività differenziale di sostanze estrogeniche (ad es., tamoxifene) in quelle specie è causato da differenze della specie in metabolismi chimici piuttosto che dalle differenze strutturali di ERα. ERα è altamente conservata strutture di dominio che sono comuni tra la superfamiglia dei recettori nucleari (NR), designato ai domini di F. E dominio o dominio di legame al ligando (LBD) include la tasca di ligand-legantesi e la funzione di attivazione trascrizionale 2, denominata AF-2. Il dominio di F è localizzato immediatamente adiacente al dominio E ed è il dominio più variabile tra la NRs. Anche tra umani e mouse ERα, omologia del dominio di F è notevolmente inferiore a quello di altri domini1. Il LBD-ligando di ERα migliora la dimerizzazione della proteina ERα per associare l'elemento specifico di DNA estrogeno-rispondente direttamente per regolare la trascrizione genica di ligando-dipendenti (classica azione di ERα). Studi cristallografici hanno rivelato il posizionamento differenziale dell'elica 12 (AF-2 core domain) con estradiolo (E2) - o 4-idrossi-tamoxifen (4OHT) - associato LBD dimeri2,3. Il dominio di ERα F (45 aminoacidi) collegare elica 12 direttamente. Tuttavia, non c'è nessuna informazione per quanto riguarda l'effetto di questa estensione di 45 aminoacidi (dominio F) dall'elica 12 sulla dimerizzazione di ERα LBD. In questo studio, dimostriamo il contributo del dominio F per la specie-4OHT-dipendente ERα LBD omodimerizzazione usando un'analisi di (M2H) due-ibrido dei mammiferi.

Il dosaggio di M2H è un metodo per dimostrare le interazioni proteina-proteina in cellule di mammifero introducendo le tre differenti plasmide DNAs: due plasmidi di espressione della proteina, che esprimono la fusione di dominio (DBD) GAL4 DNA-legantesi ERα LBD e VP16AD fusione ERα LBD, e un GAL4RE-fuse luciferasi espressione del reporter del. Quando la fusione GAL4DBD ERα LBD e la fusione di VP16AD ERα LBD interagire (fare un dimero) nelle cellule, questo complesso della proteina si lega per il GAL4RE e, quindi, attiva l'espressione di gene di luciferase attraverso la funzione di transattivazione di VP16AD-dipendente. Il livello di LBD omodimerizzazione può essere valutato con l'attività luciferasica.

Il dosaggio di lievito due-ibrido (Y2H) è un metodo alternativo basato sullo stesso principio che utilizza lievito come l'ambiente host. Utilizzando il sistema di Y2H i rapporti precedenti hanno dimostrato che F-dominio-troncato umano ERα LBD aumenta reclutamento di coactivator di E2-dependent, concludendo che il dominio di F previene E2-mediata trascrizione4. Questo risultato è coerente con altri rapporti che hanno dimostrato l'attività trascrizionale attenuato di F-dominio-troncato ERα umano in cellule di mammiferi5,6. Recentemente, il nostro studio, utilizzando il sistema M2H, ha dimostrato che l'attività di reclutamento di coactivator E2-dipendente di umano ERα LBD è diminuito del troncamento del dominio di F in cellule di mammiferi ed è coerenza con la trascrizione attività1. Queste osservazioni suggeriscono che il ruolo fisiologico di interazione proteina-proteina differisce in un modo specifico del tipo di cella e contesto. Il dosaggio di M2H può dimostrare attività di interazione proteina-proteina nello stesso contesto cellulare che viene utilizzato per determinare l'attività trascrizionale. Ciò fornisce un vantaggio del dosaggio M2H rispetto alla Y2H o altre analisi di interazione proteina-proteina in vitro .

Ci rimangono domande per quanto riguarda i meccanismi molecolari dell'attività agonista parziale di modulatori dei recettori selettivi dell'estrogeno (SERMs)(ad esempio, 4OHT) per regolare la trascrizione ERα-mediata. Analisi di M2H ERα LBD-based possono essere applicate per studiare il meccanismo dell'attività agonista parziale di SERMs in vari tipi di cellule di mammifero.

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Protocol

1. preparazione di plasmidi per il dosaggio di due-ibrido dei mammiferi

  1. Utilizzare i plasmidi seguenti: pG5-Luc, pBIND-ERαEF e patto-ERαEF.
    Nota: I plasmidi sono disponibili da parte degli autori su richiesta e vengono inviati su carta da filtro. pG5-Luc è il plasmide di reporter che contiene cinque ripetizioni di GAL4 reattivi elementi fusi con l'unità di espressione di luciferase (Figura 1A). pBIND-ERαEF è il plasmide di espressione della proteina per le proteine GAL4DBD-fuse ERα LBD. pBIND-ERαEF contiene un'unità di espressione luciferasi Renilla per normalizzare l'efficienza di trasfezione (Figura 1B). Patto-ERαEF è il plasmide di espressione della proteina per le proteine VP16AD-fuse ERα LBD (Figura 1C). Il diagramma della struttura di proteina espressa da plasmidi è illustrato nella Figura 2.
  2. Preparare il plasmide DNAs.
    1. Ritagliare l'area di plasmide-caricato da carta utilizzando forbici pulite e metterlo in una provetta da 1,5 mL. Indossare guanti e utilizzare pinzette pulite per prendere il giornale plasmide-caricato. Aggiungere 100 µ l di tampone Tris-EDTA (TE) (pH 8.0) e agitare bene.
    2. Aggiungere 1 µ l della soluzione di DNA plasmidico dal passaggio 1.2.1 alla competente Escherichia coli cellule (Vedi Tabella materiali) e tenere il tubo sul ghiaccio per 15 min.
    3. Cellule competenti di scossa di calore aggiunto il plasmide; Incubare le provette in bagnomaria a 42 ° C per 30 s e, poi, tenerli in ghiaccio per 2 min.
    4. Aggiungere 250 µ l di brodo super ottima con il mezzo di repressione (SOC) dei cataboliti (temperatura ambiente) per il tubo (s) e la cultura con agitazione a 37 ° C per 30 min.
    5. Piastra di 100 µ l del colto E. coli su un piatto di brodo (LB) di Luria preriscaldato con 100 µ g/mL ampicillina (piatto di 10 cm di diametro) e coltura a 37 ° C durante la notte.
    6. Scegli una colonia dalla piastra e aggiungerla in una provetta di 14 mL contenente 2 mL di brodo formidabile (TB) con ampicillina di 100 µ g/mL. Cultura con agitazione a 37 ° C fino a quando il mezzo è vagamente offuscato.
    7. Aggiungere 1 mL di medium coltivato dal punto 1.2.6 un matraccio di vetro sterilizzati nell'autoclave 250 mL contenente 50 mL di TB con ampicillina di 100 µ g/mL. Cultura con agitazione a 37 ° C per 20-24 h.
    8. Trasferire la colta e. coli in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 3.450 x g e a temperatura ambiente per 30 min utilizzando il rotore swing-secchio. Eliminare il terreno. Salvare il pellet di e. coli a-80 ° C.
    9. Aggiungere 3 mL di soluzione di risospensione delle cellule (Vedi Tabella materiali) di e. coli a pellet e sospenderlo completamente. Aggiungere 3 mL di soluzione di lisi delle cellule (Vedi Tabella materiali), mix il tubo dolcemente capovolgendo 10x e tenerlo sul ghiaccio per 5 min (mantenere puntualmente il tempo). Aggiungere 6 mL di soluzione di neutralizzazione (Vedi Tabella materiali), mescolare costantemente il tubo con la spillatura e quindi, tenerlo in ghiaccio per 10 min.
    10. Centrifugare la provetta a 3.450 x g a 4 ° c per 30 min utilizzando il rotore swing-secchio. Trasferire la soluzione contenente DNA in una nuova provetta conica 50 mL e aggiungere 10 mL di resina purificazione DNA (Vedi Tabella materiali). Sospendere la resina delicatamente.
    11. Centrifugare la provetta a 625 x g per 1 min utilizzando il rotore swing-secchio. Scartare la soluzione e tenere la resina nella parte inferiore.
    12. Aggiungere 15 mL di soluzione di lavaggio colonna (acetato di potassio di 80 mM, 8.5 mM Tris-HCl [pH 7.5], 40 µM EDTA e 55% etanolo) nella provetta conica 50 mL e agitare delicatamente per sospendere la resina. Ripetere il passaggio 1.2.11.
      Nota: La soluzione di lavaggio di colonna deve essere redatto utilizzando pirocarbonato dietilico (DEPC)-acqua trattata o acqua priva di nucleasi.
    13. Aggiungere 5 mL di soluzione di lavaggio colonna la provetta conica da 50 mL e sospendere la resina con una pipetta da 5 mL. Applicare la resina nella colonna (Vedi Tabella materiali) che è impostata sul collettore di aspirazione. Vuoto, la colonna fino a quando la resina a secco. Aggiungere 6 mL di soluzione di lavaggio di colonna per la colonna e il vuoto.
    14. Una volta che la resina si asciuga visivamente, staccare il serbatoio dalla colonna. Trasferire la sezione inferiore della colonna (resina) in una provetta da 1,5 mL. Centrifugare la colonna alla massima velocità per 2 minuti con una microcentrifuga per asciugare la resina completamente.
    15. Trasferire la sezione inferiore della colonna (resina) ad un nuovo tubo di 1,5 mL. Aggiungere 300 µ l di acqua priva di nucleasi alla colonna e attendere che la resina intera è intrisa.
    16. Centrifugare la colonna alla massima velocità per 1 minuto raccogliere il plasmide DNA contenente soluzione (200-250 µ l).
    17. Trattare la soluzione contenente DNA con fenolo-cloroformio (1:1), poi con cloroformio come segue.
      1. Aggiungere lo stesso volume di fenolo-cloroformio (1:1) alla soluzione contenente DNA (200-250 µ l), agitare bene e centrifugare a massima velocità per 2 minuti utilizzando una microcentrifuga. Raccogliere lo strato superiore (soluzione contenente DNA) e aggiungerlo ad un nuovo tubo di 1,5 mL. Ripetere questo passaggio 1x.
      2. Aggiungere lo stesso volume di cloroformio per la soluzione di DNA contenenti (200-250 µ l), agitare bene e centrifugare a massima velocità per 1 minuto raccogliere lo strato superiore (soluzione contenente DNA) e aggiungerlo a una provetta da 1,5 mL.
        Nota: L'endotossina (lipopolysaccharide) induce la segnalazione cellulare in alcune cellule. Per evitare tale effetto imprevisto, passaggio 1.2.17 è consigliato, che può ridurre la contaminazione dell'endotossina.
    18. Precipitare il plasmide DNA usando la tecnica di precipitazione dell'etanolo come segue.
      1. Aggiungere 1/9 del volume di miscela di DNA di acetato di sodio 3 M (pH 5,5) e 20 x del volume di acetato di sodio 3M di etanolo al 100% alla soluzione contenente DNA. Ad esempio, aggiungere 27,8 µ l di acetato di sodio 3 M e 278 µ l di etanolo al 100% a 250 µ l della soluzione del DNA (il volume finale è 555,8 µ l).
      2. Mantenere la soluzione a-80 ° C per 20 min almeno. Centrifugare a massima velocità per 20 min a 4 ° c. Scartare la soluzione e mantenere il pellet. Aggiungere 200 µ l di etanolo al 75% e sciacquare l'interno del tubo. Centrifugare per 20 min a 4 ° C, gettare la soluzione e mantenere il pellet. Asciugare il pellet di DNA utilizzando un concentratore a vuoto.
      3. Aggiungere 100-250 µ l di tampone di TE (pH 8.0) al tubo. Dissolva la pallina del DNA e controllare la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 260 nm. Mantenere la concentrazione di DNA intorno a 0,5 mg/mL.

2. mammiferi Two-hybrid Assay

  1. Mantenere le cellule.
    1. Coltura di cellule di HepG2 carcinoma epatocellulare umano in un 750ml, matraccio di cultura del tessuto di2 di 175 cm con i media privo di rosso fenolo minimi essenziali (MEM), completati con 10% siero bovino fetale (FBS; inattivati), 2 mM L-Glutammina e 1% soluzione di penicillina-streptomicina (antibiotici) per mantenere le cellule.
    2. Coltura le cellule in un 5% CO2-completati, incubatore 37 ° C fino a quando le cellule sono circa 90% confluenti.
      Nota: Per ridurre l'attività estrogenica sfondo, privo di rosso fenolo mezzo dovrebbe essere usato per tutti gli esperimenti M2H. Questo passaggio deve essere eseguito all'interno di un armadietto di sicurezza pulito panca/biologico. Le cellule devono essere mantenute dopo la cellula di mammiferi generale cultura protocollo7.
  2. Preparare le celle per la transfezione.
    Nota: I seguenti passaggi procedurali dovrebbero essere eseguiti all'interno l'armadietto di sicurezza pulito panca/biologico. Le cellule sono coltivate/incubati in un 5% CO2-completati, incubatore 37 ° C in questo passaggio ogni volta.
    1. Replate le cellule confluenti del 90% per le piastre a 24 pozzetti; Sciacquare le cellule 1 x con tampone fosfato salino (PBS).
    2. Aggiungere 7 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per il matraccio di cultura e immergere le cellule per 1-2 min, mantenendo il matraccio di cultura in un banco pulito a temperatura ambiente. Rimuovere una parte della soluzione di tripsina-EDTA e lasciare 1-2 mL di soluzione in un matraccio di cultura. Incubare la beuta di cultura nell'incubatrice per 1-2 min.
    3. Smack il fondo del matraccio per staccare le cellule e controllare le cellule sotto il microscopio.
      Nota: Se le cellule sono ancora attaccate al pallone, incubare per un altro 1-2 min e, quindi, ripetere il passaggio 2.2.3.
    4. Sospendere le celle in rosso fenolo-free MEM supplementato con 10% FBS carbone-spogliato (inattivati), 2 mM L-Glutammina e soluzione di penicillina-streptomicina 1%.
      Nota: Carbone-spogliato FBS deve essere utilizzato per ridurre l'effetto di estrogeno endogeno derivato del siero.
    5. Contare il numero di cellulare e le cellule in una piastra a 24 pozzetti ad una densità di 1.2 x 105 cellule/pozzetto di semi. Assegnare tre pozzetti per ogni punto di dati (triplice copia).
    6. Le cellule della coltura durante la notte. Continua al passo 2.4.1.
  3. Preparare una miscela di DNA per la transfezione.
    Nota: Il seguente plasmide DNAs transfected in un pozzetto: 100 ng di plasmide del reporter di pG5-Luc, 50 ng di plasmidi di espressione di proteine di fusione di GAL4DBD (pBIND) e 50 ng di plasmidi di espressione di proteine di fusione VP16AD (patto).
    1. Per analizzare l'attività di dimerizzazione ERα LBD ligando-dipendente, preparare le seguenti combinazioni (Figura 3). Combinazione (i): pBIND-hERαEF, pG5-Luc + patto e pG5-Luc + pBIND-mERαEF + patto. Combinazione (ii): patto-hERαEF, + pBIND-mERαEF e pG5-Luc, pG5-Luc + pBIND-hERαEF + patto-mERαEF. (Iii) combinazione: patto-hERαEF, + pBIND e pG5-Luc, pG5-Luc + pBIND + patto-mERαEF.
      Nota: Combinazione (i) rappresenta il livello basale sperimentale di umano ERα LBD e mouse ERα LBD, rispettivamente. Se il risultato indica un livello straordinariamente elevato con il ligando da solo, questo metodo è irrealizzabile per l'utilizzo con tale ligando (ad es., dietilstilbestrolo [DES]). Combinazione (ii) rappresenta i livelli di dimerized umano ERα LBD e dimerizza mouse ERα LBD, rispettivamente. (Iii) combinazione rappresenta controlli negativi; utilizzare questo set solo quando l'esperimento è eseguito per la prima volta a valutare il livello di fondo del sistema.
    2. Prima della miscelazione, calcolare il totale importo del DNA richiesto in base il numero di pozzetti per la transfezione. Per gli esperimenti condotti in triplici copie e in punti cinque dati, mescolare il seguente plasmide DNAs in tubi di due 1.5 µ l per combinazioni (i) e (ii): pG5-Luc, 5 (punti dati) x 3 (pozzi) x 100 ng = 1.500 ng (15 µ l); pBIND-mERαEF, 5 (punti dati) x 3 (pozzi) x 50 ng = 750 ng (7,5 µ l); Patto (per combinazione i) o patto-mERαEF (per combinazione ii), 5 (punti dati) x 3 (pozzi) x 50 ng = 750 ng (7,5 µ l).
      Nota: La concentrazione di ogni soluzione di DNA del plasmide è 0,1 µ g / µ l.
    3. Precipitare la miscela di DNA usando la tecnica di precipitazione dell'etanolo. Aggiungere 1/9 del volume di miscela di DNA di acetato di sodio 3 M (pH 5,5) e 20 x del volume di acetato di sodio 3M di etanolo al 100% per la miscela di DNA. Quindi, il tubo di vortice.
      Nota: ad esempio, aggiungere 3,4 µ l di acetato di sodio 3 M e 34 µ l di etanolo al 100% per i 30 µ l di miscela di DNA plasmidico esemplificato al punto 2.3.2. Questo passaggio consente di mantenere una condizione di transfezione invariabile, e non è necessario eseguire questo passaggio in una cappa di sicurezza biologica.
    4. Mantenere la miscela durante la notte a-20 ° C. E centrifugare a massima velocità per 20 min a 4 ° C. Scartare la soluzione (il pellet è invisibile). Aggiungere 120 µ l di etanolo al 75% per il tubo; quindi, sciacquare l'interno del tubo. Centrifugare per 20 min a 4 ° C. Scartare la soluzione e asciugare la miscela di DNA utilizzando un concentratore a vuoto per 30 min.
  4. Eseguire la transfezione.
    Nota: La procedura seguente deve essere eseguita in un banco pulito o una cappa di sicurezza biologica.
    1. La mattina seguente, sciacquare le cellule seminate in una piastra a 24 pozzetti (dal punto 2.2.6) 2x con 0,5 mL di PBS (temperatura ambiente).
    2. Aggiungere a caldo (37 ° C) fresco privo di rosso fenolo MEM supplementato con 10% carbone-spogliato FBS (inattivati) e 2 mM L-glutammina senza antibiotici ad ogni pozzetto (medio di 0,5 mL/pozzetto). Mantenere le cellule in un 5% CO2-completati, incubatore a 37 ° C.
    3. Sospendere la miscela di DNA del plasmide secchi (dal punto 2.3.4) nel mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) (nessun siero, fenolo rosso-libero, senza glutamina; 13 µ l/pozzetto). Calcolare la quantità di DMEM dal numero di pozzetti per la transfezione.
      Nota: 15 pozzi per combinazione (i) x 13 µ l = 195 µ l e 15 pozzi per combinazione (ii) x 13 µ l = 195 µ l.
    4. Sospendere il reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali; 1,5 µ l/pozzetto) in DMEM (12,5 µ l/pozzetto) in un'altra provetta da 1,5 mL. Calcolare la quantità di reagente di transfezione e DMEM dal numero di pozzetti per la transfezione.
      Nota: 30 [15 pozzi per combinazione] (i) e 15 per combinazione (ii) x 1,5 µ l di reagente di transfezione + 30 x 12,5 µ l di DMEM = 420 µ l.
    5. Aggiungere una quantità uguale del mezzo di reagente di transfezione (dal punto 2.4.4) ad ogni provetta (dal punto 2.4.3). Incubare le provette per 5-10 min a temperatura ambiente.
      Nota: 200 µ l di transfezione reagente medium + 195 µ l di miscela (i) DNA di combinazione = 395 µ l e 200 µ l di terreno di reagente di transfezione + 195 µ l di miscela (ii) del DNA di combinazione = 395 µ l. È importante aggiungere un volume uguale di medie di reagente di transfezione di tubi di combinazione (i) e (ii). Non è necessario utilizzare il mezzo in questo passaggio.
    6. Aggiungere la miscela combinata (dal passaggio 2.4.5) in ciascun pozzetto (25 µ l/pozzetto) della piastra 24 pozzetti (dal punto 2.4.2) e incubare le cellule per 6 h al 5% CO2-completati, incubatore a 37 ° C.
    7. Rimuovere il mezzo di transfezione dalla piastra a 24 pozzetti. Aggiungere a caldo (37 ° C) fresco privo di rosso fenolo MEM supplementato con 10% carbone-spogliato FBS (inattivati), 2 mM L-Glutammina, soluzione di 1% di penicillina-streptomicina e ligando (sospesa a etanolo) (medio di 0,5 mL/pozzetto). Coltura delle cellule per 16-18 h in 5% CO2-completati, incubatore a 37 ° C.
  5. Raccogliere i campioni.
    1. Sciacquare le cellule con 1 mL di PBS e, quindi, aggiungere 100 µ l di tampone di lisi passiva: 1x (Vedi Tabella materiali).
    2. Agitare vigorosamente le piastre a 24 pozzetti con un miscelatore vortex per staccare le cellule.
    3. Congelare le piastre (lisati) 1x di azoto liquido o salvarli a-80 ° C prima dell'analisi. Immediatamente prima del saggio, agitando vigorosamente le piastre su un agitatore fino a quando sono a temperatura ambiente.
      Nota: Questo processo impedisce irregolare che appaiono valori anomali di attività luciferasica.
  6. Eseguire un'analisi di dual-luciferase.
    1. Preparare i reagenti per il sistema dual-luciferase assay (Vedi Tabella materiali).
      1. Per fare il tampone di substrato (LAS) del saggio di luciferasi, aggiungere tutti i tampone del saggio di luciferasi nel substrato luciferase assay che è in una bottiglia di vetro marrone. Salvare il buffer di LAS a-20 ° C.
        Nota: Il buffer di LAS dovrebbe essere riscaldato a temperatura ambiente prima dell'uso.
      2. Per fare il tampone del substrato (RLS) Renilla luciferasi, mescolare Renilla luciferasi substrato e buffer di luciferasi Renilla in un rapporto di 01:50. Fanno fresco RLS nel buffer per ogni dosaggio e utilizzare un tubo nero o un tubo all'ombra di carta stagnola. Calcolare la quantità di tampone RLS rendendo un buffer di fresco.
        Nota: Il buffer RLS dovrebbe essere riscaldato a temperatura ambiente prima dell'uso.
    2. Impostare i reagenti nel lettore di micropiastre.
      1. Lavare l'iniezione linee 2x con etanolo al 70%; quindi, lavare le 2 linee x con acqua.
        Nota: Questo è importante per evitare di disturbare i risultati del saggio.
      2. Set il LAS buffer al P-iniettore linea (prima iniezione) e impostare il buffer RLS alla linea M-iniettore (seconda iniezione). Non mescolare i buffer. Buffer di RLS inibisce l'attività luciferasica.
    3. Applicare 10 µ l di campioni raccolti (dal punto 2.5.3) per la piastra di plastica bianca 96 pozzetti.
    4. Applicare le seguenti impostazioni per il lettore di micropiastre. Per la P-iniettore, utilizzare un volume di 50 µ l, un ritardo di 2 s e una velocità di 50 µ l/s. Per il M-iniettore, utilizzare un volume di 50 µ l, un ritardo di 2 s e una velocità di 50 µ l/s. impostare un tempo d'integrazione di 15 Set s. la temperatura a 25 ° C.
    5. Eseguire il lettore di micropiastre.
    6. Registrare i valori dell'attività luciferasi (IPValue) e i valori dell'attività Renilla luciferasi (IMValue) utilizzando il programma di acquisizione dati (Vedi Tabella materiali).
    7. Lavare le linee di iniezione dopo la raccolta dei dati (Vedi punto 2.6.2.1).
  7. Eseguire analisi di dati.
    1. Utilizzare i valori normalizzati (IPValue/IMValue) per l'analisi dei dati.
    2. Impostare il valore normalizzato di combinazione (i) [patto pG5-Luc + di + pBIND-ERαEF] con il veicolo (ligando 0 nM) come 1 per il calcolo del livello basale e il homodimerized ERα LBD livello. I livelli sono rappresentati come "Attività relativa".

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Representative Results

Figura 3 Visualizza la combinazione di possibili risposte la combinazione (i) e combinazione (ii) plasmide-transfettati. I risultati sperimentali sono riportati nella Figura 4. L'attività della combinazione (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + patto) Mostra di stimolazione di 10 nM E2 (Figura 4A), perché la LBD ERα contiene il dominio di transattivazione ligando-dipendente funzionale, AF-2. Agonista (ad es., E2) che si lega al ERα LBD reclute trascrizione coactivator(s) al dominio AF-2. Questo evento causa l'attivazione trascrizionale senza interazione con la fusione di VP16AD LBD e rende difficile valutare l'attività di omodimerizzazione LBD sullo sfondo non specifico (Figura 3C). L'attività della combinazione (ii) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + patto-mERαEF) è stata osservata con 1 nM e 10 nM E2 trattamento (Figura 4A). Sarebbe possibile determinare l'attività di omodimerizzazione di ERα LBD agonista-dipendente se la concentrazione del ligando appropriato per rilevare l'attività di combinazione (ii) senza l'attivazione di combinazione (i) può essere trovata (ad esempio, la condizione di 1 nM E2 in Figura 4A). Così, è difficile rilevare l'agonista-mediata ERα LBD omodimerizzazione attività usando l'analisi M2H. D'altra parte, l'attività di combinazione (i) con 4OHT era lo stesso come il controllo del veicolo (0 nM) livello (Figura 4B). Questi risultati indicano che la funzione AF-2 di ERα non è attivata da 4OHT. Così, il dosaggio di M2H è un'opzione fattibile per analizzare l'attività di omodimerizzazione di ERα LBD con 4OHT (Figura 3B, 3E).

L'attività dalla combinazione di mouse ERα LBD plasmidi di espressione (pBIND-mERαEF + patto-mERαEF) con 4OHT era significativamente più alto rispetto alla combinazione di plasmidi di espressione umane ERα LBD (pBIND-hERαEF + patto-hERαEF) (Figura 5A, 5B). Questo risultato indica che l'attività di 4OHT-dipendente omodimerizzazione di mouse ERα LBD è più potente di umano ERα LBD. Inoltre, abbiamo analizzato le attività di omodimerizzazione LBD 4OHT-dipendente usando i plasmidi di espressione F-dominio-scambiato ERα LBD umani-mouse, mERαEhF (mouse dominio ERα E con dominio umano F) e hERαEmF (dominio ERα E umano con dominio del mouse F). L'attività di omodimerizzazione di mERαEhF era significativamente più bassa di quella di mERαEF. Al contrario, l'attività di omodimerizzazione di hERαEmF era significativamente superiore a hERαEF (Figura 5C). Così, sembra che il dominio di F ha un'influenza su attività omodimerizzazione di specie-4OHT-dipendente ERα LBD.

Questi risultati indicano che l'attività di dimerizzazione ERα LBD di ligandi 4OHT-come, ad esempio SERMs, può essere rilevata dall'analisi M2H. Successivamente, dimostriamo un possibile modo per analizzare l'attività di ERα LBD omodimerizzazione di sostanze chimiche agonistici. Attività di dimerizzazione ERα LBD di E2 e di dietilstilbestrolo (DES) possono essere rilevati dall'analisi M2H quando si utilizza un singolo-ammino-acido-mutato ERα LBD (mouse ERα-I362D). Questa mutazione interrompe l'attività di reclutamento di coactivator E2-dipendente di ERα LBD8. Combinazione (i) (Patto pG5-Luc + di + pBIND-mERα-I362D) non è stato attivato da E2 né DES a qualsiasi concentrazione abbiamo analizzato (Figura 6B), che era differente dal WT ERα LBD (Figura 6A). L'attività di dimerizzazione LBD ERα-I362D del DES era più potente di E2 (Figura 6B). Questo mutante può essere utilizzato per uno studio comparato delle attività di dimerizzazione ERα LBD agonista-dipendente; Tuttavia, esso richiede ulteriori analisi e la caratterizzazione della funzionalità biologica di questo mutante ERα.

Figure 1
Figura 1 : Diagramma dei plasmidi utilizzati per il dosaggio di M2H. (A) questo pannello spettacoli pG5-Luc, il plasmide del reporter che contiene un elemento GAL4-sensible a reagire (GAL4 RE) fuso con una codifica il gene di luciferase. (B), questo pannello mostra pBIND-mERαEF, il plasmide di espressione della proteina per GAL4DBD fusione mERαEF; Renilla luciferasi funziona per normalizzare l'efficienza di trasfezione. (C), questo pannello mostra patto-mERαEF, il plasmide di espressione della proteina per il segnale di localizzazione nucleare (NLS)-fuso VP16AD fusione mERαEF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Diagramma dei plasmidi di espressione ERα LBD utilizzati in questo esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Schema di analisi M2H. Questa figura mostra il rappresentante condizione delle cellule transfected con combinazione (i) plasmidi (a sinistra) e le cellule transfected con combinazione (ii) plasmidi (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Attività di dimerizzazione di ligando-dipendente del mouse ERα LBD. (A), questo pannello mostra che l'attività luciferasica delle cellule transfettate con i plasmidi di combinazione (i) (pG5-Luc + patto + pBIND-mERαEF) o combinazione (ii) plasmidi (pG5-Luc + patto-mERαEF + pBIND-mERαEF), con o senza E2. (B) questo pannello mostra l'attività luciferasica delle cellule transfettate con combinazione (i) plasmidi o combinazione (ii) plasmidi con o senza 4OHT. L'attività è rappresentata come la media ± la deviazione standard (SD). Il grafico del pannello A è stato ricreato da dati precedentemente pubblicati11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Attività di dimerizzazione differenziale di mouse e umano ERα LBD con 4OHT. (A), questo pannello mostra l'attività luciferasica delle cellule transfected con la combinazione di mouse plasmidi di espressione ERα LBD (Patto-mERαEF + pBIND-mERαEF) o la combinazione di plasmidi di espressione umane ERα LBD (Patto-hERαEF + pBIND-hERαEF) con o senza 4OHT. Gamma di attività (B), il basso del pannello A viene ingrandito per mostrare l'attività di dimerizzazione dell'umano ERα LBD e sperimentali livelli basali (patto, patto + pBIND-mERαEF, pBIND-hERαEF). (C) questo pannello mostra l'attività luciferasica delle cellule transfettate con i plasmidi di espressione F-dominio-scambiato LBD mouse-umani. mERαEhF denota mouse ERα E dominio fuso con dominio umano F. hERαEmF denota dominio umano ERα E fusa con mouse F dominio. L'attività è rappresentata come la media ± SD. I grafici sono stati ricreati da dati precedentemente pubblicati1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Rilevazione di agonista-mediata ERα LBD dimerizzazione attività usando un AF-2 mutato ERα LBD. (A), questo pannello mostra che l'attività luciferasica delle cellule transfettate con i plasmidi di combinazione (i) (pG5-Luc + patto + pBIND-mERαEF) o combinazione (ii) plasmidi (pG5-Luc + patto-mERαEF + pBIND-mERαEF), con o senza leganti; E2 (rosso), DES (viola). (B) questo pannello mostra l'attività luciferasica delle cellule transfettate con combinazione (i) plasmidi (pG5-Luc + patto + pBIND-mERα-I362D) o combinazione (ii) plasmidi (pG5-Luc + patto-mERα-I362D + pBIND-mERα-I362D) con o senza leganti; E2 (rosso), DES (viola). L'attività è rappresentata come la media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui, abbiamo descritto il protocollo per il dosaggio di M2H, concentrandosi sulle condizioni di test per rilevare l'attività di omodimerizzazione di ERα LBD come esempio. In generale, il dosaggio di M2H non è popolare per la valutazione delle attività di dimerizzazione ERα LBD ligando-dipendente. Ciò è dovuto il ERα LBD che possiede una funzione di attivazione trascrizionale; la cui attività si disturba, in alcuni casi, i risultati del dosaggio M2H. Tuttavia, come dimostriamo qui, l'analisi di M2H può essere usata per analizzare l'attività di dimerizzazione LBD di alcune sostanze che non attivano la funzione di transattivazione AF-2 di LBD (ad es., 4OHT, SERMs). Per ridurre l'attività intrinseca di LBD (attività di fondo), abbiamo selezionato i più basso E2-contenenti carbone-spogliato FB dai lotti di produzione e usati inattivati al calore carbone-spogliato FBS. Questi fattori sono importanti per il successo del dosaggio M2H utilizzando il WT ERα LBD e per rilevare attività di interazione debole. Inoltre, abbiamo mostrato ERα LBD attività di dimerizzazione di agonisti (E2 e DES) utilizzando il mutante di mERα-I362D, che interrompe l'attività di reclutamento di coactivator agonista-dipendente AF-2. Questi risultati suggeriscono che il dosaggio M2H potrebbe essere più utile per la valutazione delle attività di dimerizzazione ERα LBD ligando-dipendente.

Nel campo della ricerca NR, il dosaggio di M2H è stato utilizzato per la valutazione del coactivator ligando-dipendenti o attività di reclutamento corepressor di LBDs NR9,10. Il plasmide di pBIND fuso con la regione interagente NR del cofattore viene utilizzato per questo tipo di esperimento invece di utilizzare il pBIND-ERαEF. Questo esperimento utilizza l'elemento di breve proteina contenente il NR interagendo motif (LxxLL) piuttosto che un dominio strutturale più grande del coactivator. Una possibilità è che il più grande elemento di coactivator può attivare la trascrizione senza l'assunzione della fusione VP16AD LBD; che potrebbe disturbare i risultati del dosaggio M2H. In alternativa, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per analizzare l'attività di associazione di una varietà di sostanze per l'ERα. Per esempio, le cellule erano transfected con pG5-Luc, fusi con pBIND NR interagenti motif e plasmidi patto-ERαEF e, quindi, trattate con sostanze chimiche varie, quali prodotti chimici endocrino o potenziali terapie ormonali. Se l'attività luciferasica è aumentato da una sostanza chimica in questo test, quindi si prevede che il prodotto chimico dovrebbe essere interagendo con ERα LBD per reclutare il motivo interagenti NR8.

Il dosaggio di M2H dimostra interazioni proteina-proteina in cellule di mammifero. Come abbiamo accennato nell' Introduzione, il ruolo fisiologico delle interazioni proteina-proteina può essere diverso in un contesto di cellula-tipo-specifico. M2h saggi possono fornire i risultati delle attività di interazione proteina-proteina nello stesso contesto cellulare che viene utilizzato per altri esperimenti, come l'analisi dell'attività trascrizionale. Inoltre, è possibile analizzare l'effetto di cellula-segnalazione modulatori (ad esempio, inibitori o attivatori delle chinasi) coinvolti con interazioni proteina-proteina nelle cellule. Questo è un vantaggio del dosaggio M2H rispetto ad altri studi di interazione proteina-proteina in vitro .

Tuttavia, occorre considerare che le interazioni proteina-proteina rilevato tramite il M2H dosaggio potrebbe non rappresentare un'interazione diretta tra le due proteine. In altre parole, c'è la possibilità che esistano fattori cellulari che permettono una connessione tra due proteine. Se una tal considerazione si pone, allora la valutazione di studi di interazione della proteina-proteina in vitro dovrebbe essere necessaria, ad esempio l'analisi di pulldown della proteina di GST-fusione. Inoltre, è meglio controllare il livello di espressione delle proteine pBIND e patto-plasmide-derivate nelle cellule per valutare le prestazioni del sistema di dosaggio. Soprattutto quando non può essere rilevato l'attività di interazione, le informazioni dei livelli di espressione della proteina contribuiscono a determinare la causa del risultato. Anticorpo anti-Gal4DBD e dell'anticorpo anti-VP16AD può essere utilizzati per un'analisi di western blot.

Se il laboratorio ha il set-up sperimentale per i dosaggi di reporter luciferasi, che può essere utilizzato per analizzare l'attività di trascrizione di elementi regolatori o fattori di regolazione, è abbastanza semplice effettuare il dosaggio M2H. Il dosaggio di M2H è un metodo additivo vantaggiosa per gli studi di regolazione trascrizionale.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano la d. ssa Sueyoshi e Wang presso il National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS) per la loro lettura critica del manoscritto e Tanner Jefferson per l'esecuzione di procedure sul video. Questo lavoro è stato supportato dalla 1ZIAES070065 di istituti nazionali di salute Grant (a K.S.K.) dalla divisione di ricerca intramurale del NIEHS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

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References

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Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

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