Oppdage Ligand-bindende domene Dimerization aktiviteten til østrogen reseptor alfa bruker pattedyr to-Hybrid analysen
Summary
Vi presenterer en metode for å analysere 4-hydroxy-tamoxifen-avhengige østrogen reseptor alfa ligand-bindende domene dimerization aktiviteten bruker pattedyr to-hybrid analysen.
Abstract
Østrogen reseptor alfa (ERα) er en estrogenic ligand-avhengige transkripsjon regulator. Sekvensen av ERα protein er svært bevart blant arter. Det har blitt antatt at funksjonen av menneskelige og mus ERαs er identiske. Vi demonstrere differensial 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) på mus og menneskelig ERα ligand-bindende domene (LBD) dimerization aktivitet ved hjelp av pattedyr to-hybrid (M2H) analysen. M2H analysen kan demonstrere effektiviteten av LBD homodimerization aktivitet i pattedyrceller, utnytte transfection av to protein uttrykk plasmider (GAL4 DNA-bindende domene [DBD] fusion LBD og VP16 transactivation [VP16AD]-domene fusjon LBD) og GAL4 svarer element (GAL4RE) smeltet luciferase reporter plasmider. Når GAL4DBD fusion LBD og den VP16AD fusion LBD gjør således en dimer i cellene, dette proteinet binder seg til GAL4RE og deretter aktiverer en luciferase genuttrykk gjennom VP16AD avhengige transkripsjon aktiviteten. 4OHT-mediert luciferase aktivisering er høyere i HepG2 cellene som var transfekterte med musen ERα LBD fusion protein uttrykk plasmider enn i de menneskelige ERα LBD fusion protein uttrykk plasmider transfekterte cellene. Dette resultatet antyder at effekten av 4OHT-avhengige musen ERα LBD homodimerization aktivitet er høyere enn menneskelig ERα LBD. Generelt, er utnyttelse av M2H analysen ikke ideelt for vurdering av kjernefysiske reseptoren LBD dimerization aktivitet, fordi agonistic ligander forbedrer basale nivået av LBD aktivitet, og som hindrer oppdagelsen av LBD dimerization aktivitet. Vi fant at 4OHT ikke styrkes ERα LBD basale aktiviteten. Det er en nøkkelfaktor for å bestemme og oppdage 4OHT-avhengige LBD dimerization aktivitet for å kunne bruke M2H analysen. ERα LBD-baserte M2H analyser kan brukes for å studere delvis Agonistiske aktiviteten til selektiv østrogen reseptor modulatorer (f.eks, 4OHT) i ulike pattedyr celletyper.
Introduction
Østrogen reseptor alfa (ERα) er en estrogenic ligand-avhengige transkripsjon regulator. Aminosyren sequenceof ERα er svært bevart blant arter. På grunn av den høyere homologi mellom menneske og mus ERα funksjonen til disse reseptorene er tenkt som identiske og differensial aktiviteten til estrogenic stoffer (f.eks, tamoxifen) i disse arter er forårsaket av arten forskjeller i kjemisk metabolisms i stedet for de strukturelle forskjellene i ERα. ERα har svært bevart domene strukturer som er vanlig blant kjernefysiske reseptor (NR) gruppe, utpekt A til F domener. E-domenet eller ligand-bindende domene (LBD) inneholder ligand-bindende lommen og transcriptional aktiveringsforespørselen 2, kalt AF-2. F domenet er lokalisert umiddelbart tilstøtende E domenet og mest variabel domenet blant NRs. Selv mellom menneske og musa ERα, homologi F domenet er betydelig lavere enn i andre domener1. Det ligand binding LBD ERα forbedrer homodimerization av ERα protein binde det spesifikke østrogen-responsive DNA elementet direkte for å regulere ligand-avhengige genet transkripsjon (klassisk handling av ERα). Krystallografisk undersøkelser avdekket differensial plasseringen av Spiralen 12 (AF-2 kjernen domene) med østradiol (E2)- eller 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) – bundet LBD dimers2,3. ERα F domenet (45 aminosyrer) koble helix 12 direkte. Men er det ingen informasjon om effekten av denne utvidelsen av 45 aminosyrer (F domene) fra helix 12 om ERα LBD dimerization. I denne studien viser vi bidrag av F domenet artsspesifikke 4OHT-avhengige ERα LBD homodimerization med en pattedyr to-hybrid (M2H) analysen.
M2H analysen er en metode for å demonstrere protein-protein interaksjoner i pattedyrceller introdusere de tre forskjellige plasmider DNAs: to protein uttrykk plasmider, som uttrykker GAL4 DNA-bindende domene (DBD) fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD, og GAL4RE-smeltet luciferase uttrykk reporter plasmider. Når GAL4DBD fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD samhandler (gjør således en dimer) i cellene, dette proteinet binder seg til GAL4RE, og deretter aktiverer luciferase genuttrykk gjennom funksjonen VP16AD-avhengige transactivation. Nivået på LBD homodimerization kan evalueres av den luciferase aktiviteten.
Gjær to-hybrid (Y2H) analysen er en alternativ metode basert på samme prinsipp som bruker gjær som vertsmiljøet. Tidligere rapporter ved hjelp av Y2H systemet vist at F-domene-avkuttet menneskelig ERα LBD øker E2-avhengige coactivator rekruttering, konkluderte med at F domenet hindrer E2-mediert transkripsjon4. Dette resultatet er inkonsekvent med andre rapporter som har vist dempes transcriptional aktiviteten til F-domene-avkuttet menneskelige ERα i pattedyrceller5,6. Nylig vist vår studie, bruker M2H systemet, at E2-avhengige coactivator rekruttering aktiviteten til menneskelig ERα LBD er redusert med F domene trunkering i pattedyrceller og samsvarer med transkripsjon aktivitet1. Disse observasjonene foreslår at rollen fysiologiske protein-protein interaksjon er forskjellig i en celle type-spesifikk måte og sammenheng. M2H analysen kan vise protein-protein samhandling aktivitet i samme mobilnettet kontekst som brukes for å bestemme transcriptional aktiviteten. Dette gir en fordel til M2H analysen sammenlignet Y2H eller andre i vitro protein-protein samhandling-analyser.
Det gjenstår spørsmål om molekylære mekanismer for delvis Agonistiske aktiviteten til selektiv østrogen reseptor modulatorer (SERM) (f.eks, 4OHT) å regulere ERα-mediert transkripsjon. ERα LBD-baserte M2H analyser kan brukes for å studere mekanismen for delvis Agonistiske aktiviteten SERM i ulike pattedyr celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskrev vi protokollen for M2H analysen, med fokus på analysen betingelsene for å oppdage homodimerization aktiviteten til ERα LBD som et eksempel. Generelt er M2H analysen ikke populær for vurdering av ligand-avhengige ERα LBD dimerization aktivitet. Dette skyldes ERα LBD har en transcriptional aktivering funksjon; aktiviteten som forstyrrer, i noen tilfeller resultatene av M2H analysen. Som vi viser her, kan imidlertid M2H analysen brukes for å analysere LBD dimerization aktiviteten visse stoffer som ikke a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Sueyoshi og Wang på National Institute of Environmental helse Sciences (NIEHS) for deres kritisk lesing av manuskriptet og Tanner Jefferson til å utføre prosedyrer på videoen. Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale institutter for helse Grant 1ZIAES070065 (til K.S.K.) fra delingen av Intramural forskning av NIEHS.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
- Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
- Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
- Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
- Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
- Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
- Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
- Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
- Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
- Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).
