Påvisning af Ligand-bindende domæne Dimerization aktivitet af østrogen Receptor Alpha ved hjælp af de pattedyr to-Hybrid Assay
Summary
Vi præsenterer en metode til analyse af 4-hydroxy-tamoxifen-afhængige østrogen receptor alpha ligand-bindende domæne dimerization aktivitet ved hjælp af de pattedyr to-hybrid assay.
Abstract
Østrogen receptor alpha (ERα) er en østrogene ligand-afhængig transkription regulator. Sekvensen af ERα protein er meget bevaret blandt arter. Det har været tænkt, at den funktion af menneskelige og mus ERαs er identiske. Vi demonstrere differential 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) virkning på musen og menneskelige ERα ligand-bindende domæne (LBD) dimerization aktivitet ved hjælp af pattedyr to-hybrid (M2H) analysen. M2H analysen kan demonstrere effektiviteten af LBD homodimerization aktivitet i pattedyrceller, udnytte Transfektion af to protein udtryk plasmider (GAL4 DNA-bindende domæne [Bel] fusion LBD og VP16 transactivation domæne [VP16AD] fusion LBD) og en GAL4-responderende element (GAL4RE) smeltet luciferase reporter plasmid. Når GAL4DBD fusion LBD og VP16AD fusion LBD laver en dimer i cellerne, dette protein kompleks binder sig til GAL4RE og derefter aktiverer en luciferase genekspression gennem VP16AD afhængige transskription aktivitet. En 4OHT-medieret luciferase aktivering er højere i de HepG2 celler, der blev transfekteret med mus ERα LBD fusion protein udtryk plasmider end i de menneskelige ERα LBD fusion protein udtryk plasmidet transfekteret celler. Dette resultat tyder på, at effekten af 4OHT-afhængige mus ERα LBD homodimerization aktivitet er højere end menneskelige ERα LBD. I almindelighed, er udnyttelse af M2H analyse ikke ideelt til evalueringen af nukleare receptor LBD dimerization aktivitet, fordi agonistisk ligander forbedre det basale niveau af LBD aktivitet og der hindrer paavisning af LBD dimerization aktivitet. Vi fandt, at 4OHT ikke øge ERα LBD basal aktivitet. Det er en afgørende faktor for at kunne bestemme og afsløre 4OHT-afhængige LBD dimerization aktivitet for succes ved hjælp M2H assay. ERα LBD-baserede M2H assays kan anvendes til at studere den delvise agonist aktivitet af selektiv østrogen receptor modulatorer (fx, 4OHT) i forskellige pattedyr celletyper.
Introduction
Østrogen receptor alpha (ERα) er en østrogene ligand-afhængig transkription regulator. Aminosyre sequenceof ERα er meget bevaret blandt arter. På grund af den højere homologi mellem mennesker og mus ERα, funktionen af disse receptorer er opfattes som identiske, og differential aktiviteten af østrogene stoffer (fx, tamoxifen) i arter, der er forårsaget af artens forskelle i kemiske stofskifte og ikke af de strukturelle forskelle i ERα. ERα er meget bevaret domæne strukturer, der er udbredt blandt den nukleare receptor (NN) superfamilien, udpeget A til F domæner. E domæne eller ligand-bindende domæne (LBD) omfatter ligand-bindende lomme og transcriptional aktivering funktion 2, navngivet AF-2. Domænet F er lokaliseret umiddelbart støder op til E-domænet og er det mest variable domæne blandt NRs. Selv mellem mennesker og mus ERα, homologi af domænet F er væsentligt lavere end de andre domæner1. Ligand-bundet LBD ERα forbedrer homodimerization af ERα proteinet til at binde den særlige østrogen-responderende DNA element direkte til regulering af ligand-afhængige gen transskription (klassisk handling af ERα). Krystallografiske undersøgelser har afsløret den differentierede placering af helix 12 (AF-2 core domæne) med estradiol (E2)- eller 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) – bundet LBD dimerer2,3. Domænet ERα F (45 aminosyrer) Tilslut helix 12 direkte. Der er imidlertid ingen oplysninger om effekten af denne udvidelse af 45 aminosyrer (F domæne) fra helix 12 ERα LBD dimerization. I denne undersøgelse vise vi bidrag af domænet F til den artsspecifikke 4OHT-afhængige ERα LBD homodimerization ved hjælp af et pattedyr to-hybrid (M2H) assay.
M2H-analysen er en metode til at påvise protein-protein interaktioner i pattedyrceller at indføre de tre forskellige plasmid DNAs: to protein udtryk plasmider, som udtryk for GAL4 DNA-bindende domæne (Bel) fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD, og en GAL4RE-smeltet luciferase udtryk reporter plasmid. Hvornår GAL4DBD fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD interagere (gøre en dimer) i celler, denne proteinkompleks binder sig til GAL4RE og derefter aktiverer luciferase genekspression gennem funktionen VP16AD-afhængige transactivation. Niveau af LBD homodimerization kan vurderes af luciferase aktiviteten.
Gær to-hybrid (Y2H) assay er en alternativ metode baseret på samme princip, der bruger gær som værtsmiljøet. Tidligere rapporter ved hjælp af Y2H-systemet viste, at F-domæne-afkortet menneskelige ERα LBD øger E2-afhængige coactivator rekruttering, konkludere, at domænet F forhindrer E2-medieret transskription4. Dette resultat er i modstrid med andre rapporter, som har påvist den svækkede transcriptional aktivitet af F-domæne-afkortet menneskelige ERα i pattedyrceller5,6. For nylig, viste vores undersøgelse, ved hjælp af M2H systemet, at E2-afhængige coactivator rekruttering aktiviteten af menneskelige ERα LBD er faldet med F domæne trunkering i pattedyrsceller og er i overensstemmelse med transskription aktivitet1. Disse observationer tyder på, at den fysiologiske rolle af protein-protein interaktion adskiller sig i en celle type-specifikke måde og sammenhæng. M2H analysen kan påvise protein-protein interaktion aktivitet i den trådløse forbindelse, der bruges til at bestemme den transcriptional aktivitet. Dette giver en fordel af M2H analysen i forhold til Y2H eller andre in vitro- protein-protein interaktion analyser.
Der er stadig spørgsmål om de molekylære mekanismer for den delvise agonist aktivitet af selektiv østrogen receptor modulatorer (SERM) (f.eks., 4OHT) til at regulere ERα-medieret transskription. ERα LBD-baserede M2H assays kan anvendes til at studere mekanismen af delvis agonist aktivitet af SERM i forskellige pattedyr celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri, beskrevet vi protokol for M2H analysen, fokusere på assay betingelser til påvisning af homodimerization aktivitet af ERα LBD som et eksempel. Generelt er er M2H-analysen ikke populær for vurdering af ligand-afhængige ERα LBD dimerization aktivitet. Dette skyldes ERα LBD besidder en transcriptional aktivering funktion; aktivitet som forstyrrer i nogle tilfælde resultaterne af M2H assay. Som vi viser her, kan M2H analysen bruges til at analysere LBD dimerization aktivitet af visse stoffer, der ikke aktiverer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Drs. Sueyoshi og Wang på National Institute of miljømæssige sundhed Sciences (NIEHS) for deres kritiske læsning af manuskript og Tanner Jefferson til at udføre procedurer på video. Dette arbejde blev støttet af den nationale institutter af sundhed Grant 1ZIAES070065 (til K.S.K.) fra NIEHS afdeling af murene forskning.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
- Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
- Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
- Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
- Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
- Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
- Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
- Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
- Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
- Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).
