Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Påvisning af Ligand-bindende domæne Dimerization aktivitet af østrogen Receptor Alpha ved hjælp af de pattedyr to-Hybrid Assay

doi: 10.3791/58758 Published: December 19, 2018

Summary

Vi præsenterer en metode til analyse af 4-hydroxy-tamoxifen-afhængige østrogen receptor alpha ligand-bindende domæne dimerization aktivitet ved hjælp af de pattedyr to-hybrid assay.

Abstract

Østrogen receptor alpha (ERα) er en østrogene ligand-afhængig transkription regulator. Sekvensen af ERα protein er meget bevaret blandt arter. Det har været tænkt, at den funktion af menneskelige og mus ERαs er identiske. Vi demonstrere differential 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) virkning på musen og menneskelige ERα ligand-bindende domæne (LBD) dimerization aktivitet ved hjælp af pattedyr to-hybrid (M2H) analysen. M2H analysen kan demonstrere effektiviteten af LBD homodimerization aktivitet i pattedyrceller, udnytte Transfektion af to protein udtryk plasmider (GAL4 DNA-bindende domæne [Bel] fusion LBD og VP16 transactivation domæne [VP16AD] fusion LBD) og en GAL4-responderende element (GAL4RE) smeltet luciferase reporter plasmid. Når GAL4DBD fusion LBD og VP16AD fusion LBD laver en dimer i cellerne, dette protein kompleks binder sig til GAL4RE og derefter aktiverer en luciferase genekspression gennem VP16AD afhængige transskription aktivitet. En 4OHT-medieret luciferase aktivering er højere i de HepG2 celler, der blev transfekteret med mus ERα LBD fusion protein udtryk plasmider end i de menneskelige ERα LBD fusion protein udtryk plasmidet transfekteret celler. Dette resultat tyder på, at effekten af 4OHT-afhængige mus ERα LBD homodimerization aktivitet er højere end menneskelige ERα LBD. I almindelighed, er udnyttelse af M2H analyse ikke ideelt til evalueringen af nukleare receptor LBD dimerization aktivitet, fordi agonistisk ligander forbedre det basale niveau af LBD aktivitet og der hindrer paavisning af LBD dimerization aktivitet. Vi fandt, at 4OHT ikke øge ERα LBD basal aktivitet. Det er en afgørende faktor for at kunne bestemme og afsløre 4OHT-afhængige LBD dimerization aktivitet for succes ved hjælp M2H assay. ERα LBD-baserede M2H assays kan anvendes til at studere den delvise agonist aktivitet af selektiv østrogen receptor modulatorer (fx, 4OHT) i forskellige pattedyr celletyper.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Østrogen receptor alpha (ERα) er en østrogene ligand-afhængig transkription regulator. Aminosyre sequenceof ERα er meget bevaret blandt arter. På grund af den højere homologi mellem mennesker og mus ERα, funktionen af disse receptorer er opfattes som identiske, og differential aktiviteten af østrogene stoffer (fx, tamoxifen) i arter, der er forårsaget af artens forskelle i kemiske stofskifte og ikke af de strukturelle forskelle i ERα. ERα er meget bevaret domæne strukturer, der er udbredt blandt den nukleare receptor (NN) superfamilien, udpeget A til F domæner. E domæne eller ligand-bindende domæne (LBD) omfatter ligand-bindende lomme og transcriptional aktivering funktion 2, navngivet AF-2. Domænet F er lokaliseret umiddelbart støder op til E-domænet og er det mest variable domæne blandt NRs. Selv mellem mennesker og mus ERα, homologi af domænet F er væsentligt lavere end de andre domæner1. Ligand-bundet LBD ERα forbedrer homodimerization af ERα proteinet til at binde den særlige østrogen-responderende DNA element direkte til regulering af ligand-afhængige gen transskription (klassisk handling af ERα). Krystallografiske undersøgelser har afsløret den differentierede placering af helix 12 (AF-2 core domæne) med estradiol (E2)- eller 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) - bundet LBD dimerer2,3. Domænet ERα F (45 aminosyrer) Tilslut helix 12 direkte. Der er imidlertid ingen oplysninger om effekten af denne udvidelse af 45 aminosyrer (F domæne) fra helix 12 ERα LBD dimerization. I denne undersøgelse vise vi bidrag af domænet F til den artsspecifikke 4OHT-afhængige ERα LBD homodimerization ved hjælp af et pattedyr to-hybrid (M2H) assay.

M2H-analysen er en metode til at påvise protein-protein interaktioner i pattedyrceller at indføre de tre forskellige plasmid DNAs: to protein udtryk plasmider, som udtryk for GAL4 DNA-bindende domæne (Bel) fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD, og en GAL4RE-smeltet luciferase udtryk reporter plasmid. Hvornår GAL4DBD fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD interagere (gøre en dimer) i celler, denne proteinkompleks binder sig til GAL4RE og derefter aktiverer luciferase genekspression gennem funktionen VP16AD-afhængige transactivation. Niveau af LBD homodimerization kan vurderes af luciferase aktiviteten.

Gær to-hybrid (Y2H) assay er en alternativ metode baseret på samme princip, der bruger gær som værtsmiljøet. Tidligere rapporter ved hjælp af Y2H-systemet viste, at F-domæne-afkortet menneskelige ERα LBD øger E2-afhængige coactivator rekruttering, konkludere, at domænet F forhindrer E2-medieret transskription4. Dette resultat er i modstrid med andre rapporter, som har påvist den svækkede transcriptional aktivitet af F-domæne-afkortet menneskelige ERα i pattedyrceller5,6. For nylig, viste vores undersøgelse, ved hjælp af M2H systemet, at E2-afhængige coactivator rekruttering aktiviteten af menneskelige ERα LBD er faldet med F domæne trunkering i pattedyrsceller og er i overensstemmelse med transskription aktivitet1. Disse observationer tyder på, at den fysiologiske rolle af protein-protein interaktion adskiller sig i en celle type-specifikke måde og sammenhæng. M2H analysen kan påvise protein-protein interaktion aktivitet i den trådløse forbindelse, der bruges til at bestemme den transcriptional aktivitet. Dette giver en fordel af M2H analysen i forhold til Y2H eller andre in vitro- protein-protein interaktion analyser.

Der er stadig spørgsmål om de molekylære mekanismer for den delvise agonist aktivitet af selektiv østrogen receptor modulatorer (SERM) (f.eks., 4OHT) til at regulere ERα-medieret transskription. ERα LBD-baserede M2H assays kan anvendes til at studere mekanismen af delvis agonist aktivitet af SERM i forskellige pattedyr celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse af plasmider for pattedyr to-hybrid Assay

  1. Brug de følgende plasmider: pG5-Luc, pBIND-ERαEF og pagten-ERαEF.
    Bemærk: Plasmider er ledige fra forfattere bestilles og sendes på filtrerpapir. pG5-Luc er reporter plasmid, der indeholder fem gentagelser af GAL4 lydhør elementer sammensmeltet med luciferase udtryk enhed (fig. 1A). pBIND-ERαEF er protein udtryk plasmid for GAL4DBD-smeltet ERα LBD proteiner. pBIND-ERαEF indeholder en Renilla luciferase udtryk enhed for normalisering Transfektion effektivitet (figur 1B). Pagten-ERαEF er protein udtryk plasmid for VP16AD-smeltet ERα LBD proteiner (figur 1C). Diagram over den udtrykte protein struktur fra plasmider er vist i figur 2.
  2. Forberede plasmid DNAs.
    1. Skåret ud området plasmid-loaded fra papiret ved hjælp af ren saks og sætte det ind i en 1,5 mL tube. Bære handsker og bruge ren pincet til at afhente den plasmid-loaded papir. Tilsæt 100 µL af Tris-EDTA (TE) buffer (pH 8,0) og vortex godt.
    2. Tilføj 1 µL plasmid DNA løsning fra trin 1.2.1 til kompetente Escherichia coli celler (Se Tabel af materialer) og holde røret på is i 15 min.
    3. Heat-shock plasmid-tilføjet kompetente celler; Inkuber røret i 42 ° C vandbad til 30 s og derefter holde dem på køl i 2 min.
    4. Tilsæt 250 µL af super optimal bouillon med catabolite undertrykkelse (SOC) medium (stuetemperatur) til røret og kultur under omrystning ved 37 ° C i 30 min.
    5. Plade 100 µL af den kulturperler E. coli på en prewarmed Luria bouillon (LB) plade med 100 µg/mL ampicillin (10 cm-diameter parabol) og kultur ved 37 ° C natten over.
    6. Vælge en koloni fra pladen og føje det ind i en 14 mL rør indeholdende 2 mL af fantastisk bouillon (TB) med 100 µg/mL ampicillin. Kultur med ryster ved 37 ° C, indtil mediet overskygges svagt.
    7. Der tilsættes 1 mL af den kulturperler medium fra trin 1.2.6 til en autoklaveres 250 mL glas kolbe indeholdende 50 mL af TB med 100 µg/mL ampicillin. Kultur med ryster ved 37 ° C i 20-24 h.
    8. Overføre den kulturperler E. coli til en 50 mL konisk rør og centrifugeres ved 3.450 x g ved stuetemperatur i 30 min. ved hjælp af swing-spand rotoren. Kassér mediet. Gemme E. coli pellet ved-80 ° C.
    9. Tilsættes 3 mL celle resuspension (Se Tabel af materialer) til E. coli pellet og suspendere det helt. Tilsættes 3 mL celle lysis (Se Tabel af materialer), mix rør forsigtigt ved at invertere den 10 x, og holde det i isbad i 5 min (holde tiden punktligt). Tilsættes 6 mL neutralisering (Se Tabel af materialer), bland røret støt med aflytning, og derefter holde det i isbad i 10 min.
    10. Der centrifugeres tube på 3.450 x g på 4 ˚C i 30 min. ved hjælp af swing-spand rotoren. De DNA-holdige opløsning overføres til en ny 50 mL konisk slange og der tilsættes 10 mL af DNA oprensning harpiks (Se Tabel af materialer). Suspendere harpiks forsigtigt.
    11. Der centrifugeres tube på 625 x g i 1 minut ved hjælp af swing-spand rotoren. Kassér løsningen og holde harpiks i bunden.
    12. Der tilsættes 15 mL kolonne vaskeopløsning (80 mM kalium acetat, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7,5], 40 µM EDTA, og 55% ethanol) til 50 mL konisk tube og ryst den forsigtigt for at suspendere harpiksen. Gentag trin 1.2.11.
      Bemærk: Vaskeopløsning kolonne skal forberedes ved hjælp af diethyletheren pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vand eller nukleasen-gratis vand.
    13. Der tilsættes 5 mL af kolonne vaskeopløsning til 50 mL konisk slange og suspendere harpiks med en 5 mL pipette. Anvende harpiks til kolonnen (Se Tabel af materialer), er indstillet på det vakuum manifold. Vakuum kolonnen, indtil harpiksen tørrer. Tilføje 6 mL kolonne vaskeopløsning til kolonne og vakuum.
    14. Når harpiksen tørrer visuelt, frigøre reservoir fra kolonnen. Overføre den nederste del af kolonnen (harpiks) til en 1,5 mL tube. Der centrifugeres kolonnen ved maksimal hastighed for 2 min ved hjælp af en microcentrifuge for at tørre helt, harpiks.
    15. Overføre den nederste del af kolonnen (harpiks) til en ny 1,5 mL tube. Tilsæt 300 µL nukleasen-gratis vand til kolonnen og vente, indtil det hele harpiks er gennemblødt.
    16. Der centrifugeres kolonnen ved maksimal hastighed i 1 minut at indsamle plasmid DNA-holdige løsning (200-250 µL).
    17. Behandle den DNA-holdige løsning med phenol-chloroform (1:1), derefter med chloroform som følger.
      1. Tilføje den samme mængde af phenol-chloroform (1:1) til DNA-holdige løsning (200-250 µL), ryst godt, og der centrifugeres ved maksimal hastighed for 2 min ved hjælp af en microcentrifuge. Indsamle de øvre lag (DNA-holdige løsning) og føje den til en ny 1,5 mL tube. Gentag dette trin 1 x.
      2. Tilføje den samme mængde af chloroform til den DNA-holdige løsning (200-250 µL), ryst godt, og der centrifugeres ved maksimal hastighed i 1 min. indsamle det øverste lag (DNA-holdige løsning) og føje den til en 1,5 mL tube.
        Bemærk: Endotoxin (LPS) inducerer cellulær signalering i nogle celler. For at undgå sådanne uforudsete virkning, anbefales trin 1.2.17, hvilket kan reducere endotoxin forurening.
    18. Bundfald plasmid DNA ved hjælp af ethanol nedbør teknik som følger.
      1. Tilføj 1/9 af DNA blanding bind 3 M natriumacetat (pH 5,5) og 20 x 3M natrium acetat volumen af 100% ethanol til DNA-holdige løsningen. For eksempel tilføje 27.8 µL 3 M natriumacetat og 278 µL af 100% ethanol til 250 µL af opløsningen DNA (endelige rumfang er 555.8 µL).
      2. Holde løsningen ved-80 ° C i 20 min. mindst. Der centrifugeres ved tophastighed i 20 min. på 4 ˚C. Kassér løsningen og holde pelleten. Tilføje 200 µL af 75% ethanol og skylle indersiden af røret. Centrifugeres i 20 min. ved 4 ° C, slette løsningen og holde pelleten. Tørre DNA pellet ved hjælp af et vakuum koncentrator.
      3. Tilføje 100-250 µL af TE buffer (pH 8,0) til røret. Opløse DNA pellet og kontroller DNA-koncentrationen ved hjælp af en spektrofotometeret ved en bølgelængde på 260 nm. Holde DNA koncentration omkring 0,5 mg/mL.

2. pattedyr to-hybrid Assay

  1. Opretholde cellerne.
    1. Kultur menneskelige hepatocellulært carcinom HepG2 celler i en 750 mL, 175 cm2 vævskultur kolbe med phenol rød-fri minimum essential medier (MEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS; varme-inaktiveret), 2 mM L-glutamin, og 1% penicillin-streptomycin løsning (antibiotika) for at opretholde cellerne.
    2. Kultur celler i en 5% CO2-suppleret, 37 ° C inkubator indtil cellerne er ca 90% sammenflydende.
      Bemærk: For at reducere østrogene baggrund aktivitet, phenol rød-frit medium bør anvendes for alle M2H eksperimenter. Dette trin skal udføres inde i en ren bænk/biologiske sikkerhed kabinet. Cellerne bør opretholdes efter almindelige pattedyr celle kultur protokol7.
  2. Forberede Transfektion af celler.
    Bemærk: De følgende processuelle handlinger bør udføres inde i ren bænk/biologiske sikkerhed kabinet. Cellerne er kulturperler/inkuberes i en 5% CO2-suppleret, 37 ° C inkubator i dette trin hver gang.
    1. Replate 90% sammenflydende celler til 24-godt plader; Skyl celler 1 x med fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    2. Kultur kolben tilsættes 7 mL 0,05% trypsin-EDTA-oploesning og suge celler i 1-2 min. samtidig kultur kolbe i en ren bænk ved stuetemperatur. Fjerne en del af trypsin-EDTA-oploesning og efterlade 1-2 mL af opløsningen i kultur kolben. Inkuber kultur kolben i inkubator for 1-2 min.
    3. Smack i bunden af kolben til at frigøre cellerne og se celler under mikroskop.
      Bemærk: Hvis cellerne er stadig knyttet til kolben, inkuberes i en anden 1-2 min., og Gentag derefter trin 2.2.3.
    4. Suspendere celler i phenol rød-fri MEM suppleret med 10% trækul-strippet FBS (varme-inaktiveret), 2 mM L-glutamin, og 1% penicillin-streptomycin løsning.
      Bemærk: Kul-strippet FBS skal bruges til at reducere effekten af serum-afledte endogene østrogen.
    5. Antal celle og frø celler i en 24-godt plade med en tæthed på 1.2 x 105 celler/brønd. Tildele tre brønde for hvert datapunkt (tredobbelt).
    6. Kultur cellerne om natten. Fortsæt til trin 2.4.1.
  3. Forberede Transfektion en DNA blanding.
    Bemærk: Den følgende plasmid udpegede nationale myndigheder er transfekteret i et godt: 100 ng af pG5-Luc reporter plasmid, 50 ng af udtryk plasmider for GAL4DBD fusion proteiner (pBIND) og 50 ng af udtryk plasmider for VP16AD fusion proteiner (pACT).
    1. For at analysere ligand-afhængige ERα LBD dimerization aktivitet, forberede de følgende kombinationer (figur 3). Kombination (i): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pagten, og pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pagten. Kombination (ii): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pACT-hERαEF, og pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT-mERαEF. Kombination (iii): pG5-Luc + pBIND + pACT-hERαEF, og pG5-Luc + pBIND + pACT-mERαEF.
      Bemærk: Kombination a repræsenterer den basale eksperimenterende niveau af menneskelige ERα LBD og mus ERα LBD, henholdsvis. Hvis resultatet viser et bemærkelsesværdigt højt med ligand alene, er denne metode uigennemførlige til brug med denne ligand (f.eks.diethylstilbestrol [DES]). Kombination (ii) repræsenterer niveauer af dimerized menneskelige ERα LBD og dimerized musen ERα LBD, henholdsvis. Kombination (iii) repræsenterer negative kontroller; Brug dette sæt kun når eksperimentet udføres for første gang at vurdere baggrundsniveauet i systemet.
    2. Før blanding, beregne samlet DNA beløb kræves baseret på antallet af brønde for Transfektion. For eksperimenter udført i tre og fem datapunkter, Bland de følgende plasmid DNAs i to 1,5 µL rør til kombinationer (i) og (ii): pG5-Luc, 5 (datapunkter) x 3 (brønde) x 100 ng = 1.500 ng (15 µL); pBIND-mERαEF, 5 (datapunkter) x 3 (brønde) x 50 ng = 750 ng (7,5 µL); Pagten (kombination i) eller pagt-mERαEF (for kombination ii), 5 (datapunkter) x 3 (brønde) x 50 ng = 750 ng (7,5 µL).
      Bemærk: Koncentrationen af hver plasmid DNA løsning er 0,1 µg/µL.
    3. Udfældes DNA blandingen ved hjælp af ethanol nedbør teknik. Tilføj 1/9 af DNA blanding bind 3 M natriumacetat (pH 5,5) og 20 x 3M natrium acetat volumen af 100% ethanol til DNA-blandingen. Derefter, vortex røret.
      Bemærk: For eksempel tilføje 3,4 µL 3 M natriumacetat og 34 µL af 100% ethanol til de 30 µL plasmid DNA blanding eksemplificeret i trin 2.3.2. Dette trin hjælper til at holde en uforanderlig Transfektion betingelse, og det er ikke nødvendigt at udføre dette trin i en biologisk sikkerhed kabinet.
    4. Holde blandingen natten over ved-20 ° C. Der centrifugeres det henne ved tophastighed i 20 min. ved 4 ° C. Kassér den løsning (pellet er usynligt). Tilføje 120 µL af 75% ethanol til røret; Skyl indersiden af røret. Der centrifugeres i 20 min. ved 4 ° C. Kassér løsningen og tørt DNA blandingen ved hjælp af et vakuum koncentrator i 30 min.
  4. Udføre Transfektion.
    Bemærk: Følgende trin skal udføres i en ren bænk eller et biologisk sikkerhed kabinet.
    1. Den følgende morgen, skyl cellerne seedede i en 24-godt plade (fra trin 2.2.6) 2 x med 0,5 mL PBS (stuetemperatur).
    2. Tilføje varm (37 ° C) friske phenol rød-fri MEM suppleret med 10% trækul-strippet FBS (varme-inaktiveret) og 2 mM L-glutamin uden antibiotika til hver brønd (0,5 mL medium/brønd). Holde cellerne i en 5% CO2-suppleret, 37 ° C inkubator.
    3. Suspendere tørrede plasmid DNA blanding (fra trin 2.3.4) i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) (intet serum, phenol rød-fri, uden glutamin; 13 µL/brønd). Beregning af beløb for DMEM fra antallet af brønde for Transfektion.
      Bemærk: 15 brønde for kombination a x 13 µL = 195 µL og 15 brønde for kombination (ii) x 13 µL = 195 µL.
    4. Suspendere Transfektion reagens (Se Tabel af materialer; 1,5 µL/brønd) i DMEM (12,5 µL/brønd) i en anden 1,5 mL tube. Beregning af beløb af Transfektion reagens og DMEM fra antallet af brønde for Transfektion.
      Bemærk: 30 [15 brønde for kombination] a og 15 brønde for kombination (ii) x 1,5 µL Transfektion reagens + 30 x 12,5 µL af DMEM = 420 µL.
    5. Tilføje en lige stor del af Transfektion reagens mellemlang (fra trin 2.4.4) til hver tube (fra trin 2.4.3). Inkuber rør for 5-10 min ved stuetemperatur.
      Bemærk: 200 µL af Transfektion reagens medium + 195 µL af kombination a DNA blanding = 395 µL, og 200 µL af Transfektion reagens medium + 195 µL af kombination (ii) DNA blanding = 395 µL. Det er vigtigt at tilføje et lige saa stort volumen af Transfektion reagens medium rør i kombination (i) og (ii). Det er ikke nødvendigt at bruge op medium i dette trin.
    6. Tilføj den kombinerede blanding (fra trin 2.4.5) til hver brønd (25 µL/brønd) af 24-godt plade (fra trin 2.4.2), og der inkuberes celler til 6 h i 5% CO2-suppleret, 37 ° C inkubator.
    7. Fjerne Transfektion medium fra 24-godt plade. Tilføje varm (37 ° C) friske phenol rød-fri MEM suppleret med 10% trækul-strippet FBS (varme-inaktiveret), 2 mM L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin løsning og ligand (suspenderet i ethanol) (0,5 mL medium/brønd). Kultur celler i 16-18 timer i 5% CO2-suppleret, 37 ° C inkubator.
  5. Høste prøverne.
    1. Skyl celler med 1 mL PBS og derefter tilsættes 100 µL 1 x passive lysisbuffer (Se Tabel af materialer).
    2. Ryst 24-godt plader med en vortex mixer Adskil celler.
    3. Fryse plader (cellelysater) 1 x af flydende nitrogen eller gemme dem på-80 ° C før analyse. Umiddelbart før analysen, ryst pladerne på en shaker indtil de er ved stuetemperatur.
      Bemærk: Denne proces forhindrer uregelmæssigt vises unormale værdier af luciferase aktivitet.
  6. Udføre en dual-luciferase assay.
    1. Udarbejde for reagenser dual-luciferase assay system (Se Tabel af materialer).
      1. For at gøre luciferase assay substratbuffer (LAS), skal du tilføje alle luciferase analysebuffer til luciferase assay underlaget, som er i en brun glasflaske. Gemme LAS buffer ved-20 ° C.
        Bemærk: LAS bufferen skal opvarmes til stuetemperatur før anvendelse.
      2. For at gøre Renilla luciferase substratbuffer (RLS), blandes Renilla luciferase substrat og Renilla luciferase buffer i forholdet 1:50. Gøre friske RLS buffer for hver analyse og bruge en sort tube eller en tube i skyggen af stanniol. Beregning af RLS buffer gør en frisk buffer.
        Bemærk: RLS bufferen skal opvarmes til stuetemperatur før anvendelse.
    2. Indstille reagenserne i mikrotiterplade læseren.
      1. Vask injektion linjer 2 x med 70% ethanol; derefter vask linjer 2 x med vand.
        Bemærk: Dette er vigtigt at undgå forstyrrende assay resultater.
      2. Sæt LAS buffer til P-injektor linje (første injektion) og indstille RLS buffer til linjen M-injektor (anden injektion). Bland ikke disse buffere. RLS buffer hæmmer luciferase aktivitet.
    3. Anvend 10 µL af høstede prøver (fra trin 2.5.3) til den 96-brønd hvid plastplade.
    4. Anvende følgende indstillinger til mikrotiterplade læseren. For P-injektor, bruge et volumen på 50 µL, en forsinkelse på 2 s og en hastighed på 50 µL/s. For M-injektor, bruge et volumen på 50 µL, en forsinkelse på 2 s og en hastighed på 50 µL/s. sat en integration tid af 15 s. sæt temperaturen til 25 ° C.
    5. Køre mikrotiterplade læseren.
    6. Optage de luciferase aktivitet (IPValue) og værdier af Renilla luciferase aktivitet (IMValue) ved hjælp af data erhvervelse program (Se Tabel af materialer).
    7. Vask injektion linjer efter indsamling af data (Se trin 2.6.2.1).
  7. Udføre dataanalyse.
    1. Brug de normaliserede værdier (IPValue/IMValue) til dataanalyse.
    2. Angiv den normaliserede værdi af kombination (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + pagten] med køretøjet (0 nM ligand) som 1 til beregning af det basale niveau og homodimerized ERα LBD niveau. Niveauerne er repræsenteret som "Relative aktivitet".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 3 viser ordningen af mulige løsninger i kombination (i) og kombination (ii) plasmid-transfekteret celler. De eksperimentelle resultater er vist i figur 4. Aktiviteten af kombination (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pagten) viser stimulation af 10 nM E2 (figur 4A), fordi ERα LBD indeholder ligand-afhængige transactivation funktionelle domæne, AF-2. Agonist (f.eks.E2), som binder til ERα LBD rekrutter transskription coactivator(s) AF-2-domæne. Denne begivenhed forårsager transcriptional aktivering uden interaktion med VP16AD fusion LBD og gør det vanskeligt at evaluere LBD homodimerization aktivitet på grund af de uspecifikke baggrund (figur 3C). Aktiviteten af kombination (ii) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT-mERαEF) blev observeret med 1 nM og 10 nM E2 behandling (figur 4A). Det ville være muligt at bestemme agonist-afhængige ERα LBD homodimerization aktivitet, hvis den passende ligand koncentration til påvisning af aktiviteten af kombination (ii) uden aktivering af kombination (i) kan findes (f.eks., at betingelse 1 nM E2 i figur 4A). Det er således vanskeligt at opdage den agonist-medieret ERα LBD homodimerization aktivitet ved hjælp af M2H assay. På den anden side aktiviteten af kombination a med 4OHT var den samme som kontrolelementet køretøj (0 nM) niveau (fig. 4B). Disse resultater tyder på, at funktionen AF-2 af ERα ikke er aktiveret af 4OHT. M2H analysen er således en mulighed til at analysere homodimerization aktiviteten af ERα LBD med 4OHT (fig. 3B, 3E).

Aktivitet fra en kombination af mus ERα LBD udtryk plasmider (pBIND-mERαEF + pACT-mERαEF) med 4OHT var betydeligt højere end kombinationen af menneskelige ERα LBD udtryk plasmider (pBIND-hERαEF + pACT-hERαEF) (figur 5A, 5B). Dette resultat angiver, at den 4OHT-afhængige homodimerization aktivitet i mus ERα LBD er mere potent end menneskelige ERα LBD. Endvidere analyserede vi 4OHT-afhængige LBD homodimerization aktivitet ved hjælp af menneske-musen F-domæne-byttet ERα LBD udtryk plasmider, mERαEhF (mus ERα E domæne med menneskelige F domæne) og hERαEmF (menneskelig ERα E domæne med musen F domæne). Homodimerization aktiviteten af mERαEhF var betydeligt lavere end for mERαEF. Derimod var homodimerization aktiviteten af hERαEmF betydeligt højere end hERαEF (figur 5C). Således, det virker som domænet F har en indflydelse på artsspecifik 4OHT-afhængige ERα LBD homodimerization aktivitet.

Disse resultater tyder på, at ERα LBD dimerization aktiviteten i 4OHT-lignende ligander, såsom SERM, kan påvises ved M2H assay. Næste, vi viser en mulig måde at analysere ERα LBD homodimerization aktivitet af agonistisk kemikalier. ERα LBD dimerization aktiviteter i E2 og diethylstilbestrol (DES) kan opdaget af M2H analyse, når du bruger en enkelt-amino-syre-muteret ERα LBD (mus ERα-I362D). Denne mutation forstyrrer E2-afhængige coactivator rekruttering aktivitet af ERα LBD8. Kombination (i) (pG5-Luc + pBIND-mERα-I362D + pagten) blev ikke aktiveret af E2 eller DES ved enhver koncentration vi analyseret (figur 6B), som var forskellig fra WT ERα LBD (fig. 6A). ERα-I362D LBD dimerization aktiviteten af DES var mere potent end E2 (fig. 6B). Denne mutant kan bruges til en sammenlignende undersøgelse af agonist-afhængige ERα LBD dimerization aktivitet; Det kræver imidlertid yderligere analyse og karakterisering af biologiske funktionaliteten af denne mutant ERα.

Figure 1
Figur 1 : Diagram over plasmider anvendes til M2H analysen. (A) dette panel viser pG5-Luc, reporter plasmidet, som indeholder en GAL4-responderende element (GAL4 RE) sammensmeltet med en luciferase kodning genet. (B) dette panel viser pBIND-mERαEF, protein udtryk plasmid for GAL4DBD fusion mERαEF; Renilla luciferase virker for normalisering Transfektion effektivitet. (C) dette panel viser pACT-mERαEF, protein udtryk plasmid for nukleare lokalisering signal (NLS)-smeltet VP16AD fusion mERαEF. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Diagram over ERα LBD udtryk plasmider anvendes i dette eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Ordningen af M2H analysen. Denne figur viser repræsentant tilstand af celler transfekteret med kombination a plasmider (venstre) og cellerne transfekteret med kombination (ii) plasmider (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Ligand-afhængige dimerization aktivitet af mus ERα LBD. (A) dette panel viser luciferase aktiviteten af cellerne transfekteret med kombination (i) plasmider (pG5-Luc + pagten + pBIND-mERαEF) eller kombination (ii) plasmider (pG5-Luc + pACT-mERαEF + pBIND-mERαEF), med eller uden E2. (B) dette panel viser luciferase aktiviteten af de celler, der transfekteret med kombination a plasmider eller kombination (ii) plasmider med eller uden 4OHT. Aktiviteten er repræsenteret som gennemsnittet ± standardafvigelse (SD). Grafen for panel A har været genskabt fra tidligere udgivne data11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Differentierede dimerization aktivitet af mus og menneskelige ERα LBD med 4OHT. (A) dette panel viser luciferase aktiviteten af cellerne transfekteret med kombinationen af mus ERα LBD udtryk plasmider (pACT-mERαEF + pBIND-mERαEF) eller en kombination af menneskelige ERα LBD udtryk plasmider (pACT-hERαEF + pBIND-hERαEF) med eller uden 4OHT. (B) lave aktivitet række panel A er forstørret til at vise dimerization aktiviteten af menneskelige ERα LBD og eksperimenterende basal niveauer (pagten + pBIND-mERαEF, pagten + pBIND-hERαEF). (C) dette panel viser luciferase aktiviteten af de celler, der transfekteret med musen-menneskelige F-domæne-byttet LBD udtryk plasmider. mERαEhF betegner mus ERα E domæne sammensmeltet med menneskelige F domæne. hERαEmF angiver den menneskelige ERα E domæne sammensmeltet med musen F domæne. Aktiviteten er repræsenteret som den gennemsnit ± SD. Graferne er blevet genskabt fra tidligere udgivne data1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Påvisning af agonist-medieret ERα LBD dimerization aktivitet ved hjælp af en AF-2 muteret ERα LBD. (A) dette panel viser luciferase aktiviteten af cellerne transfekteret med kombination (i) plasmider (pG5-Luc + pagten + pBIND-mERαEF) eller kombination (ii) plasmider (pG5-Luc + pACT-mERαEF + pBIND-mERαEF), med eller uden ligander; E2 (rød), DES (lilla). (B) dette panel viser luciferase aktiviteten af de celler, der transfekteret med kombination a plasmider (pG5-Luc + pagten + pBIND-mERα-I362D) eller kombination (ii) plasmider (pG5-Luc + pACT-mERα-I362D + pBIND-mERα-I362D), med eller uden ligander; E2 (rød), DES (lilla). Aktiviteten er repræsenteret som den gennemsnit ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Heri, beskrevet vi protokol for M2H analysen, fokusere på assay betingelser til påvisning af homodimerization aktivitet af ERα LBD som et eksempel. Generelt er er M2H-analysen ikke populær for vurdering af ligand-afhængige ERα LBD dimerization aktivitet. Dette skyldes ERα LBD besidder en transcriptional aktivering funktion; aktivitet som forstyrrer i nogle tilfælde resultaterne af M2H assay. Som vi viser her, kan M2H analysen bruges til at analysere LBD dimerization aktivitet af visse stoffer, der ikke aktiverer funktionen AF-2 transactivation af LBD (fx, 4OHT, SERM). For at reducere den iboende aktivitet af LBD (baggrund aktivitet), vi valgt laveste E2-holdige trækul-strippet FBS fra produktion masser og anvendes varme-inaktiverede trækul-strippet FBS. Disse faktorer er vigtige for succes af den M2H analyse ved hjælp af WT ERα LBD og afsløre svage interaktion aktivitet. Desuden, vi viste ERα LBD dimerization aktivitet af agonister (E2 og DES) ved hjælp af mERα-I362D-mutant, der forstyrrer agonist-afhængige coactivator rekruttering aktivitet at AF-2. Disse resultater tyder på, at M2H analysen kunne være mere nyttige til vurdering af ligand-afhængige ERα LBD dimerization aktivitet.

På forskningsområdet NR har M2H analysen været anvendt til vurderingen af ligand-afhængige coactivator eller corepressor rekruttering aktivitet NR LBDs9,10. PBIND sammenvokset med NN interagerende regionen cofaktoren plasmid bruges til denne type af eksperiment i stedet for ved hjælp af pBIND-ERαEF. Dette eksperiment anvender elementet kort protein som indeholder NR interagere motiv (LxxLL) i stedet for en større strukturel domæne af coactivator. En mulighed er, at den større coactivator element kan aktivere transskription uden ansættelse af VP16AD fusion LBD; der kunne forstyrre resultater fra M2H assay. Alternativt kunne denne protokol bruges til at analysere den bindende aktivitet af en lang række stoffer til ERα. For eksempel, blev cellerne transfekteret med pG5-Luc, pBIND-smeltet NR interagerende motiv og pagten-ERαEF plasmider og, derefter, behandlet med forskellige kemikalier, såsom hormonforstyrrende kemikalier eller potentielle hormonelle therapeutics. Hvis luciferase aktiviteten forøges af et kemikalie i denne analyse, derefter forudses det, at kemikaliet skal interagere med ERα LBD at rekruttere NR interagerende motiv8.

M2H analysen viser protein-protein interaktioner i pattedyrsceller. Som vi nævnte i indledningen, kan den fysiologiske rolle af protein-protein interaktioner være anderledes i en celle-type-specifikke kontekst. M2H assays kan forelægge resultaterne af protein-protein interaktion aktivitet i den trådløse forbindelse, der bruges til andre eksperimenter, som analysen af transcriptional aktivitet. Derudover kan det analyserer effekten af celle signalering modulatorer (fx, hæmmere eller aktivatorer af kinaser) involveret i protein-protein interaktioner i cellerne. Det er en fordel af M2H analysen i forhold til andre in vitro- protein-protein interaktion undersøgelser.

Det skal imidlertid overvejes at protein-protein interaktioner registreret via M2H analyse ikke kan repræsentere en direkte interaktion mellem to proteiner. Med andre ord er der muligheden at cellulære faktorer findes der tillader en forbindelse mellem to proteiner. Hvis sådan en overvejelse opstår, så evaluering af in vitro- protein-protein interaktion undersøgelser bør det kræves, såsom GST-fusion protein pulldown assay. Desuden er det bedre at kontrollere udtryk niveau af pBIND - og vækstpagten-plasmid-afledt proteiner i cellerne til at evaluere assay systemets ydeevne. Især når interaktion aktivitet ikke kan påvises, oplysninger om udtryk Proteinniveau hjælper med at fastslå årsagen til resultatet. Anti-Gal4DBD antistof, og anti-VP16AD antistoffer kan anvendes til en western blot analyse.

Hvis laboratoriet har de eksperimenterende set-up for luciferase reporter assays, som kan bruges til at analysere transskription aktivitet af regulerende elementer eller regulere faktorer, det er ganske enkelt at udføre M2H assay. M2H analyse er en fordelagtig tilsætningsstof metode for transkriptionel regulering undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at erklære.

Acknowledgments

Forfatterne takke Drs. Sueyoshi og Wang på National Institute of miljømæssige sundhed Sciences (NIEHS) for deres kritiske læsning af manuskript og Tanner Jefferson til at udføre procedurer på video. Dette arbejde blev støttet af den nationale institutter af sundhed Grant 1ZIAES070065 (til K.S.K.) fra NIEHS afdeling af murene forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293, (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389, (6652), 753-758 (1997).
  3. Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95, (7), 927-937 (1998).
  4. Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295, (1-2), 94-100 (2008).
  5. Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9, (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).
  6. Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21, (4), 829-842 (2011).
  7. Mitry, R. R., Hughes, R. D. Human Cell Culture Protocols. Humana Press. (2011).
  8. Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290, (28), 17611-17627 (2015).
  9. Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16, (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).
  10. Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19, (12), 8226-8239 (1999).
  11. Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288, (29), 21105-21116 (2013).
Påvisning af Ligand-bindende domæne Dimerization aktivitet af østrogen Receptor Alpha ved hjælp af de pattedyr to-Hybrid Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).More

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter