Détection de l’activité de dimérisation du domaine ligands de œstrogènes Alpha du récepteur à l’aide de l’essai de deux-hybride chez les mammifères
Summary
Nous présentons une méthode pour analyser la 4-hydroxy-tamoxifène-dépendants oestrogène receptor ligands domaine dimérisation activité alpha utilisant l’analyse de deux-hybride chez les mammifères.
Abstract
Œstrogènes alpha du récepteur (ERα) est un régulateur oestrogéniques ligand-dépendants de transcription. La séquence de la protéine ERα est hautement conservée entre les espèces. On a pensé que la fonction de l’homme et la souris ERαs est identique. Nous démontrons l’effet différentiel 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) souris et ERα ligands domaine (LBD) dimérisation activités humaines utilisant le mammifère-hybride (M2H) test. Le dosage M2H peut démontrer l’efficacité de l’activité de homodimérisation LBD dans les cellules de mammifères, utilisant la transfection des plasmides d’expression de deux protéines (GAL4 DNA-binding domain [DBD] fusion LBD et VP16 transactivation domaine [VP16AD] fusion LBD) et un GAL4-responsive element (GAL4RE) fondue plasmide rapporteur luciférase. Lors de la fusion de GAL4DBD LBD et la fusion de VP16AD LBD font un dimère dans les cellules, ce complexe protéique se lie à la GAL4RE et, ensuite, active l’expression des gènes par le biais de l’activité de transcription dépendant de VP16AD une luciférase. L’activation de la luciférase induite par le 4OHT est plus élevée dans les cellules HepG2 qui ont été transfectées avec les plasmides souris ERα LBD fusion protein expression que dans les ERα LBD fusion protein expression plasmide transfecté des cellules humaines. Ce résultat suggère que l’efficacité de la souris 4OHT-dépendante de l’activité homodimérisation ERα LBD est plus élevée que l’humain ERα LBD. En général, l’utilisation du dosage M2H n’est pas idéale pour l’évaluation de l’activité de dimérisation du récepteur nucléaire LBD, car des ligands agonistes améliorent le niveau de base de l’activité LBD et gêner la détection de l’activité de dimérisation LBD. Nous avons trouvé que 4OHT n’améliore pas l’activité basale ERα LBD. C’est un facteur clé pour être capable de déterminer et de détecter l’activité de dimérisation de LBD 4OHT-dépendant pour l’utilisation avec succès le test M2H. LBD ERα M2H analyses peuvent être appliquées pour étudier l’activité agoniste partielle des modulateurs des récepteurs œstrogènes (p. ex., 4OHT) dans divers types de cellules de mammifères.
Introduction
Œstrogènes alpha du récepteur (ERα) est un régulateur oestrogéniques ligand-dépendants de transcription. L’acides aminés sequenceof ERα est hautement conservée entre les espèces. En raison de l’homologie supérieur entre l’homme et souris ERα, la fonction de ces récepteurs est considérée comme identique, et l’activité différentielle des substances oestrogéniques (par exemple, le tamoxifène) chez ces espèces est causée par des différences dans l’espèce métabolismes chimiques plutôt que par des différences structurelles de ERα. ERα a hautement conservée les structures de domaine qui sont fréquents chez la superfamille des récepteurs nucléaires (NR), désignée A pour domaines de F. E domaine ou domaine de liaison du ligand (LBD) comprend la poche de liaison du ligand et la fonction d’activation transcriptionnelle 2, nommée AF-2. Le domaine de F est localisé juste à côté du domaine E et le domaine plus variable chez le NRs. Même entre l’homme et la souris ERα, l’homologie du domaine F est sensiblement inférieur à celui des autres domaines1. Le LBD ligand lié de ERα améliore l’homodimérisation de la protéine ERα pour lier l’élément spécifique de l’ADN sensibles aux oestrogènes directement pour la régulation de la transcription du gène de ligand-dépendants (action classique de ERα). Des études cristallographiques ont révélé le positionnement différentiel d’hélice 12 (noyau de la AF-2) avec l’estradiol (E2) – ou 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) – lié LBD dimères2,3. Le domaine ERα F (45 acides aminés) Connectez hélice 12 directement. Cependant, il n’y a aucune information concernant l’effet de cette extension de 45 acides aminés (domaine de F) de l’hélice 12 sur la dimérisation ERα LBD. Dans cette étude, nous démontrons la contribution du domaine F l’homodimérisation de ERα LBD 4OHT-dépendante spécifique à l’espèce à un mammifère-hybride (M2H) dosage.
L’essai de M2H est une méthode pour montrer les interactions protéine-protéine dans les cellules de mammifères présentant les trois différents plasmide DNAs : deux plasmides d’expression protéique, qui exprime la fusion de GAL4 DNA-binding domain (DBD) la fusion ERα LBD LBD ERα et VP16AD, et un Plasmide de journaliste d’expression luciférase fusionnés avec le GAL4RE. Lorsque la fusion GAL4DBD ERα LBD et la fusion de VP16AD ERα LBD interagissent (faire un dimère) dans les cellules, ce complexe protéique se lie à la GAL4RE et, ensuite, active l’expression de gène de luciférase grâce à la fonction de transactivation VP16AD-dépendante. Le niveau de LBD homodimérisation peut être évalué par l’activité de la luciférase.
L’essai de (Y2H) de deux-hybride de levure est une méthode alternative basée sur le même principe qui utilise la levure comme l’environnement hôte. Les rapports précédents, en utilisant le système Y2H démontré que F-domaine-tronqué humains ERα LBD augmente recrutement de coactivateur E2-dépendante, concluant que le domaine F empêche la transcription induite par l’E24. Ce résultat est incompatible avec d’autres rapports qui ont démontré l’activité transcriptionnelle atténuée de F-domaine-tronqué humain ERα dans les cellules de mammifères5,6. Récemment, notre étude, en utilisant le système M2H, a démontré que l’activité de recrutement de coactivateur E2-dépendante des humains ERα LBD est diminuée par troncature domaine F en cellules mammifères et est compatible avec l’activité de transcription1. Ces observations suggèrent que le rôle physiologique de l’interaction protéine-protéine est différente dans un contexte et de manière spécifique au type de cellule. Le dosage M2H peut démontrer l’activité interaction protéine-protéine dans le même contexte cellulaire qui est utilisé pour la détermination de l’activité transcriptionnelle. Cela procure un avantage du dosage M2H comparé à la Y2H ou autres analyses d’interaction de protéine-protéine in vitro .
Il reste des questions concernant les mécanismes moléculaires de l’activité agoniste partielle des modulateurs des récepteurs œstrogènes (SERMs) (p. ex., 4OHT) à réglementer ERα-mediated transcription. LBD ERα M2H analyses peuvent être appliquées pour étudier le mécanisme de l’activité agoniste partielle des SERMs dans divers types de cellules de mammifères.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les présentes, nous décrit le protocole de l’essai M2H, mettant l’accent sur les conditions de test pour la détection de l’activité de l’homodimérisation de ERα LBD à titre d’exemple. En règle générale, l’essai de M2H n’est pas populaire pour l’évaluation de l’activité de dimérisation ERα LBD ligand-dépendants. Cela est dû à la ERα LBD possédant une fonction d’activation de la transcription ; dont l’activité perturbe, dans certains cas, les résultats du dosage M2H. Toutefo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les Drs Sueyoshi et Wang à l’Institut National de Environmental Health Sciences (NIEHS) pour leur lecture critique du manuscrit et Jefferson Tanner pour effectuer des interventions sur la vidéo. Ce travail a été soutenu par le 1ZIAES070065 d’instituts nationaux de santé Grant (au KSK) de la Division de la recherche intra-muros du NIEHS.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
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