Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Определение активности димеризации лиганд привязки домена Альфа рецептор эстрогена, используя Assay млекопитающих 2 гибрида

doi: 10.3791/58758 Published: December 19, 2018

Summary

Мы представляем метод для анализа 4-гидрокси тамоксифен зависимой эстроген рецептор альфа-лиганд привязки димеризации доменами с помощью млекопитающих assay 2 гибрида.

Abstract

Эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) является регулятором эстрогенных лиганд зависимых транскрипции. Среди видов высоко сохраняется последовательность ERα белка. Считалось, что функция человека и мыши ERαs идентичны. Мы продемонстрировать эффект дифференциальной 4-гидрокси тамоксифен (4OHT) на мышь и человека ERα лиганд привязки (ОДД) димеризации доменами с помощью млекопитающих assay (м2ч) 2 гибрида. М2ч assay может продемонстрировать эффективность деятельности LBD homodimerization в клетках млекопитающих, используя трансфекции двух плазмид выражение протеина (GAL4 ДНК-связывающих домена [DBD] Сплавливание LBD и VP16 transactivation домена [VP16AD] Сплавливание LBD) и GAL4-отзывчивым элемент (GAL4RE) снаряжен Люцифераза репортер плазмиды. Когда GAL4DBD fusion LBD и VP16AD фьюжн LBD димер в клетках, этот комплекс белков связывается с GAL4RE и, затем, активирует экспрессии генов Люцифераза через деятельность зависимых транскрипции VP16AD. Активация 4OHT-опосредованной Люцифераза выше в HepG2 клетки, которые были transfected с мыши ERα LBD синтеза белка выражение плазмид чем ERα LBD синтеза белка выражение плазмида transfected клеток человека. Этот результат свидетельствует о том, что эффективность 4OHT-зависимых мыши ERα LBD homodimerization активность выше, чем человеческий ERα LBD. В общем использование м2ч assay не подходит для оценки деятельности димеризации LBD ядерных рецепторов, потому что агонистических лигандов повысить базальный уровень активности LBD и что затрудняет обнаружение LBD димеризации активности. Мы обнаружили, что 4OHT не повысить ERα LBD базальную активность. Что является ключевым фактором для того определить и обнаружить 4OHT-зависимых LBD димеризации деятельность для успешно используя assay м2ч. На основе ERα LBD м2ч анализов могут применяться для изучения деятельности частичный агонист селективного эстроген модуляторов рецепторов (например, 4OHT) в различных типах клеток млекопитающих.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) является регулятором эстрогенных лиганд зависимых транскрипции. Амино кислоты sequenceof ERα высоко сохраняется среди видов. Из-за более высоких гомологии между человека и мыши ERα, функция этих рецепторов мыслится как идентичные и дифференциального активность эстрогенных веществ (например, тамоксифен) в этих видов вызвана Межвидовые различия в химические метаболизмом, а не структурных различий ERα. ERα хорошо сохранились доменных структур, которые являются общими среди ядерных рецепторов (NR) надсемейства, поручено A F доменов. E домена или лиганд связывающий домен (ОДД) включает в себя лиганд привязки карман и transcriptional активации функции 2, названный AF-2. F домен локализован непосредственно примыкает к области E и является наиболее переменной домен среди НСП. Даже между человека и мыши ERα, гомологии F домена значительно ниже, чем у других доменов1. Лиганд прыгните LBD ERα повышает homodimerization белка ERα, чтобы связать определенный элемент эстроген отзывчивым ДНК непосредственно для регулирования транскрипции гена лиганд зависимые (классическое действие ERα). Кристаллографическая исследования показали дифференциального позиционирования спираль 12 (AF-2 основной домен) с эстрадиола (Е2) - или 4-гидрокси тамоксифен (4OHT) - привязанное LBD димеров2,3. Домен ERα F (45 аминокислоты) Подключите спираль 12 непосредственно. Однако нет никакой информации относительно последствий этого расширения 45 аминокислот (F домен) от спирали 12 на ERα LBD димеризации. В этом исследовании мы продемонстрировать вклад F домена для вегетационных ERα LBD homodimerization 4OHT-зависимых, используя млекопитающих пробирного (м2ч) 2 гибрида.

Assay м2ч способ продемонстрировать белок белковых взаимодействий в mammalian клетках, представляя три различных плазмида ДНК: два белка выражение плазмиды, которые выражают GAL4 ДНК-связывающих доменов (DBD) фьюжн ERα LBD и VP16AD fusion ERα LBD, и GAL4RE-кварцевое Люцифераза выражение репортер плазмиды. Когда GAL4DBD fusion ERα LBD и VP16AD синтеза ERα LBD взаимодействуют (сделать димер) в клетках, этот комплекс белков привязывается к GAL4RE и, затем, активирует Люцифераза экспрессии генов через функцию transactivation VP16AD-зависимых. Уровень LBD homodimerization могут быть оценены Люцифераза деятельности.

Assay (Y2H) 2 гибрида дрождей-альтернативный метод, основанный на тот же принцип, который использует дрожжей в качестве хост-среды. Предыдущие доклады, с использованием системы Y2H продемонстрировал, что F-домен усечение человека ERα LBD увеличивает E2-зависимой coactivator набора, заключение, что домен F предотвращает E2-опосредованной транскрипции4. Этот результат является несовместимым с другими докладами, которые продемонстрировали аттенуированные транскрипционный анализ деятельности F-домен усечение человека ERα в mammalian клеток5,6. Недавно наше исследование, с использованием системы M2H, показали, что активность набора E2-зависимой coactivator человека ERα LBD уменьшается на F домена усечения в mammalian клетках и согласуется с транскрипции деятельность1. Эти наблюдения предполагают, что Физиологическая роль взаимодействия протеин протеина отличается в манере определенного типа клеток и контекст. М2ч assay может продемонстрировать деятельность взаимодействия протеин протеина в том же контексте сотовой, который используется для определения транскрипционный анализ активности. Это обеспечивает преимущество пробирного M2H, по сравнению с Y2H или других в vitro анализ взаимодействия протеин протеина.

Остаются вопросы относительно молекулярные механизмы активность частичный агонист модуляторы рецептора селективного эстрогена (SERM) (например, 4OHT) для регулирования ERα-опосредованной транскрипции. На основе ERα LBD м2ч анализов могут быть применены для изучения механизм частичного агониста деятельности SERM в различных типах клеток млекопитающих.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка плазмид млекопитающих Assay 2 гибрида

  1. Используйте следующие плазмидов: pG5-люк, pBIND-ERαEF и Пакт ERαEF.
    Примечание: Плазмиды доступны от авторов по запросу и отправляются на фильтровальной бумаге. pG5-Люк является репортером плазмида, содержащий пять повторяет GAL4 реагировать элементы сливается с блоком выражения Люцифераза (рис. 1A). pBIND-ERαEF является плазмида выражение протеина для GAL4DBD-кварцевое LBD ERα белков. pBIND-ERαEF содержит блок выражения Люцифераза Renilla для нормализации эффективность трансфекции (рис. 1Б). Пакт ERαEF является белок выражение плазмида VP16AD-плавленый ERα LBD белков (рис. 1C). Схема структуры выразили белков от плазмид показан на рисунке 2.
  2. Подготовьте плазмида ДНК.
    1. Вырезать из области плазмида загружен из бумаги с использованием чистого ножницы и положил его в 1,5 мл трубку. Надевайте перчатки и использовать чистые пинцет, чтобы забрать плазмида загружена бумага. Добавьте 100 мкл буфера Tris-ЭДТА (TE) (рН 8.0) и вихревой хорошо.
    2. 1 мкл раствора плазмида ДНК из шага 1.2.1 сведущее Escherichia coli клетки (см. Таблицу материалы) и держать трубку на льду за 15 мин.
    3. Теплового шока плазмида Добавлено сведущие клетки; инкубировать трубки в ванну воды 42 ° C за 30 s и, затем, держать их на льду на 2 мин.
    4. 250 мкл супер оптимального бульон с catabolite репрессий (SOC) среднего (комнатной температуры), трубки и культуру с тряску при 37 ° C за 30 мин.
    5. Пластина 100 мкл культивировали E. coli на подогретую тарелку Лурия бульон (LB) 100 мкг/мл ампициллин (10 см диаметр блюдо) и культуры при 37 ° C на ночь.
    6. Выбрать один из колонии от плиты и добавить его в 14 мл, содержащих 2 мл потрясающий бульон (ТБ) с 100 мкг/мл ампициллина. Культура с тряску при 37 ° C, до тех пор, пока средство слегка дымчатый.
    7. Добавьте 1 mL культурной среды из шага 1.2.6 для газобетона 250 мл стеклянную колбу, содержащие 50 мл с 100 мкг/мл ампициллин ТБ. Культура с тряску при 37 ° C для 20-24 ч.
    8. Передача культивировали E. coli к 50 мл Конические трубки и центрифуги на 3,450 x g при комнатной температуре за 30 мин, с использованием swing ведро ротора. Отказаться от среднего. Сохранить E. coli Пелле-80 ° c.
    9. Добавить 3 мл раствора ресуспендирования клеток (см. Таблицу материалы) для е. coli окатышей и приостановить его полностью. Добавить 3 мл раствора лизис клеток (см. Таблицу материалы), смесь трубка мягко, переворачивать его 10 x и держать его на льду в течение 5 мин (держать время пунктуальн). Добавить 6 мл нейтрализации раствора (см. Таблицу материалы), смешать трубка постоянно с выстукивать и затем, держать его на льду за 10 мин.
    10. Центрифуга трубку 3,450 x g при 4 ° c на 30 мин, с использованием swing ведро ротора. ДНК содержащие решение передать новой 50 мл Конические трубки и добавляют 10 мл ДНК очистки смолы (см. Таблицу материалы). Осторожно приостановите смолы.
    11. Центрифуга трубки на 625 x g за 1 мин, с использованием swing ведро ротора. Отменить решение и сохранить смолы на дне.
    12. Добавить 15 мл промывочного раствора столбца (ацетат калия 80 мм, 8,5 мм трис-HCl [pH 7.5], 40 мкм ЭДТА и 55% этиловом спирте) 50 мл конические пробки и встряхните его осторожно, чтобы приостановить смолы. Повторите шаг 1.2.11.
      Примечание: Промывочный раствор столбца должны подготавливаться с использованием диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-лечение воды или воды, свободной от нуклеиназы.
    13. Добавить 5 мл промывочного раствора столбец в 50 мл Конические трубки и приостановить смолы с 5 мл пипетки. Применить к столбцу смолы (см. Таблицу материалы), для которого задается на вакуумный коллектор. Вакуумные столбца до тех пор, пока сухие смолы. Добавьте 6 мл промывочного раствора столбец в столбец и вакуума.
    14. Как только смола сохнет визуально, отсоедините резервуар из столбца. Передать в нижней части столбца (смола) 1,5 мл. Центрифуга для столбца максимальная скорость за 2 мин, с использованием microcentrifuge полностью высохнуть смолы.
    15. В нижней части столбца (смола) передать новой 1,5 мл трубки. Добавить 300 мкл нуклеиназы свободной воды в столбце и подождать до тех пор, пока вся смола пропитанной.
    16. Центрифуга для столбца максимальная скорость за 1 мин для сбора плазмида ДНК содержащих решения (200-250 мкл).
    17. Лечить ДНК содержащие решение с фенол хлороформ (1:1), затем с метилхлороформа следующим образом.
      1. Добавьте такой же объем фенол хлороформ (1:1) в ДНК содержащие решение (200-250 мкл), взболтайте и центрифуги с максимальной скоростью за 2 мин, с использованием microcentrifuge. Собирать верхний слой (ДНК содержащих раствор) и добавить его к новой 1,5 мл трубки. Повторите этот шаг 1 x.
      2. Добавьте такой же объем хлороформ в ДНК содержащие решение (200-250 мкл), хорошо встряхнуть и центрифуги на максимальной скорости на 1 мин собирать верхний слой (ДНК содержащих раствор) и добавить его в 1,5 мл.
        Примечание: Эндотоксина (липополисахарида) индуцирует клеточных сигналов в некоторых клетках. Чтобы избежать такой неожиданный эффект, шаг 1.2.17 рекомендуется, который может уменьшить загрязнение эндотоксин.
    18. Осадок плазмидной ДНК с помощью метода осадков этанола следующим.
      1. Добавить 1/9 ДНК смесь объема ацетат натрия 3 M (рН 5,5) и 20 x 3M натрия ацетата объема 100% этанола в ДНК содержащие решение. К примеру добавьте 27.8 мкл ацетат натрия 3 M и 278 µL 100% этанола в 250 мкл раствора ДНК (окончательный объем является 555.8 мкл).
      2. По крайней мере сохранить решение на-80 ° C в течение 20 мин. Центрифуга для максимальной скоростью 20 мин на 4 градусов. Отменить решение и держать гранулы. Добавить 200 мкл 75% этанола и ополосните внутреннюю трубку. Центрифуга для 20 минут при температуре 4 ° C, отменить решение и держать гранулы. Сухие гранулы ДНК с помощью вакуумного концентратор.
      3. Добавьте 100-250 мкл буфера TE (рН 8.0) в трубку. Растворяют гранулы ДНК и проверьте концентрации ДНК, используя спектрофотометр на длине волны 260 Нм. Держите концентрации ДНК вокруг 0.5 мг/мл.

2. млекопитающих 2 гибрида Assay

  1. Сохранить клетки.
    1. Культура человека гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 клетки в 750 мл, флакон культуры ткани2 175 см с свободного фенола Красного минимальных основных СМИ (MEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС; инактивированная тепла), 2 мм L-глютамином и 1% пенициллин стрептомицином решение (антибиотики) для поддержания клеток.
    2. Культура клетки в 5% CO2-дополнениями, инкубатора 37 ° C до тех пор, пока клетки являются около 90% притока.
      Примечание: Для уменьшения эстрогенных фоновой активности, свободного фенола Красного среднего должно использоваться для всех м2ч экспериментов. Этот шаг должен выполняться внутри чистый скамейке/биологической безопасности кабинета. После общего mammalian клетки культуры протокола7следует сохранить клетки.
  2. Подготовьте для transfection клетки.
    Примечание: Следующие процедурные шаги должны выполняться внутри чистый скамейке/биологической безопасности кабинета. Клетки культивировали/инкубировали в 5% CO2-дополнениями, 37 ° C инкубатора в этот шаг каждый раз.
    1. Replate 90% вырожденная клетки 24-ну пластины; Промойте клетки 1 x с фосфат амортизированное saline (PBS).
    2. Добавить 7 мл 0,05% раствора трипсина ЭДТА в колбу культуры и замочить клетки для 1-2 мин при сохранении культуры колбу в лавочке чистой при комнатной температуре. Удалите часть решения трипсина ЭДТА и оставить 1-2 мл раствора в колбу культуры. Инкубируйте культуры колбу в инкубаторе для 1-2 мин.
    3. Привкус в нижней части Фляга для отсоединения клетки и проверить клетки под микроскопом.
      Примечание: Если клетки по-прежнему привязаны к колбе, инкубировать еще 1-2 мин и затем повторите шаг 2.2.3.
    4. Приостановить клетки в свободного фенола Красного MEM, дополнена 10% древесный уголь раздели FBS (тепло инактивированная), 2 мм L-глютамина и 1% раствора пенициллина и стрептомицина.
      Примечание: Уголь раздели FBS должны использоваться для уменьшения эффекта сыворотки производные эндогенных эстрогенов.
    5. Подсчитать ячейки и семян клетки в 24-ну пластины на плотности 1.2 x 105 клеток/хорошо. Назначьте трех скважин для каждой точки данных (в трех экземплярах).
    6. Культура клетки на ночь. Продолжать шаг 2.4.1.
  3. Подготовка смеси ДНК для transfection.
    Примечание: Следующие плазмида ДНК являются transfected в одной скважины: 100 нг pG5-Люк репортер плазмида, 50 нг выражение плазмид GAL4DBD синтез белков (pBIND) и 50 нг выражение плазмид VP16AD синтез белков (Пакт).
    1. Для анализа активности димеризации лиганд зависимой ERα LBD, подготовьте следующие комбинации (рис. 3). Комбинация (i): Пакт + Пакт и pG5-люк, pG5-Люк + pBIND-mERαEF + pBIND-hERαEF. Комбинация (ii): Пакт mERαEF + Пакт hERαEF и pG5-люк, Люк pG5 + pBIND-mERαEF + pBIND-hERαEF. Комбинация (iii): Пакт mERαEF + Пакт hERαEF и pG5-люк, Люк pG5 + pBIND + pBIND.
      Примечание: Комбинация (i) представляет собой базальной экспериментальной уровень человека ERα LBD и мыши ERα LBD, соответственно. Если результат показывает удивительно высокий уровень с лигандом только, этот метод является невозможным для использования с этой лиганда (например, диэтилстильбестрол [DES]). Комбинация (ii) представляет уровень димерной человека ERα LBD и димерной мыши ERα LBD, соответственно. Комбинация (iii) представляет собой негативный контроль; Используйте этот набор, только когда эксперимент проводится впервые оценить уровень фона системы.
    2. Перед смешиванием, вычислить сумму ДНК, необходимое на основании числа скважин для transfection. Для экспериментов, проведенных в triplicates и пяти данных точках, смесь следующих плазмида ДНК в две 1,5 мкл трубы для комбинации (i) и (ii): pG5-люк, 5 (точек) x 3 (скважин) x 100 ng = 1500 нг (15 мкл); pBIND-mERαEF, 5 (точек) x 3 (скважин) x 50 ng = 750 нг (7,5 мкл); Пакт (для комбинации i) или Пакт mERαEF (для комбинации ii), 5 (точек) x 3 (скважин) x 50 ng = 750 нг (7,5 мкл).
      Примечание: Концентрация каждого решения плазмида ДНК — 0,1 мкг/мкл.
    3. Осадок ДНК смесь с использованием метода осадков этанола. Добавить 1/9 ДНК смесь объема ацетат натрия 3 M (рН 5,5) и 20 x 3M натрия ацетата объема 100% этанола в ДНК смесь. Затем вихревой трубе.
      Примечание: К примеру, добавьте 3.4 мкл ацетат натрия 3 M и 34 µL 100% этанола 30 мкл плазмида ДНК смесь в шаге 2.3.2. Этот шаг помогает сохранить неизменной трансфекции условие и нет необходимости выполнять этот шаг в биологической безопасности кабинета.
    4. Хранить смесь на ночь при-20 ° C. Центрифуга с максимальной скоростью 20 мин при 4 ° C. Отменить решение (гранулы невидимым). 120 мкл 75% этанола на трубу; затем промойте внутри трубки. Центрифуги для 20 мин при 4 ° C. Отменить решение и сухие смеси ДНК, с помощью вакуума концентратор для 30 мин.
  4. Выполните transfection.
    Примечание: Следующие шаги должны выполняться в чистой скамейке или биологической безопасности кабинета.
    1. Следующее утро промойте клетки, посеяна в 24-ну пластины (от шага 2.2.6) 2 x 0.5 мл PBS (комнатной температуры).
    2. Добавьте, теплые (37 ° C) свежие свободного фенола Красного MEM дополнена 10% древесный уголь раздели FBS (тепло инактивированная) и 2 мм L-глютамин без антибиотиков для каждой скважины (0,5 мл средний/хорошо). Держите клетки в 5% CO2-дополнениями, 37 ° C инкубатора.
    3. Приостановите сушеные плазмида ДНК смесь (из шага 2.3.4) в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) (не сыворотки, фенола Красного бесплатно, без глютамина; 13 мкл/хорошо). Рассчитайте количество DMEM из числа скважин для transfection.
      Примечание: 15 скважин для комбинации (i) x 13 мкл = 195 мкл и 15 скважин для комбинации (ii) x 13 мкл = 195 мкл.
    4. Приостановить трансфекции реагента (смотрите Таблицу материалов; 1,5 мкл/хорошо) в среде DMEM (12,5 мкл/а) в другой 1,5 мл. Рассчитайте количество трансфекции реагента и DMEM из числа скважин для transfection.
      Примечание: 30 [15 скважин для комбинации] (i) и 15 скважин для комбинации (ii) x 1.5 мкл Реагента трансфекции + 30 x 12,5 мкл DMEM = 420 мкл.
    5. Добавьте равное количество трансфекции реагент средних (от шага 2.4.4) для каждой трубы (от шага 2.4.3). Инкубируйте трубы для 5-10 мин при комнатной температуре.
      Примечание: 200 мкл трансфекции реагент средний + 195 мкл комбинации (i) ДНК смесь = 395 мкл и 200 мкл трансфекции реагент средний + 195 мкл комбинации (ii) ДНК смесь = 395 мкл. Важно добавить равный объем трансфекции реагент средних трубы комбинации (i) и (ii). Нет необходимости использовать средство в этом шаге.
    6. Добавить комбинированного смесь (из шага 2.4.5) для каждой скважины (25 мкл/хорошо) 24-ну пластины (от шага 2.4.2) и инкубации клеток для 6 ч в 5% CO2-дополнениями, 37 ° C инкубатора.
    7. Удалите средство transfection с 24-ну пластины. Добавить, теплые (37 ° C) свежие свободного фенола Красного MEM дополнена 10% древесный уголь раздели FBS (тепло инактивированная), 2 мм L-глютамином, раствор 1% пенициллин стрептомицином и лигандом (приостановлено в этиловом спирте) (0,5 мл средний/хорошо). Культура клетки для 16-18 ч в 5% CO2-дополнениями, 37 ° C инкубатора.
  5. Сбор образцов.
    1. Промойте клетки с 1 мл раствора PBS и, затем, 100 мкл 1 x пассивной литического буфера (см. Таблицу материалы).
    2. Энергично встряхните 24-ну пластины с вихревой смеситель для отсоединения клетки.
    3. Заморозить пластины (lysates клетки) 1 x жидким азотом или сохранить их на-80 ° C до анализа. Непосредственно перед assay энергично встряхните пластины на шейкер до тех пор, пока они находятся при комнатной температуре.
      Примечание: Этот процесс предотвращает нерегулярно появление аномальных значений Люцифераза деятельности.
  6. Выполните двойной Люцифераза assay.
    1. Подготовка реагентов для двойной Люцифераза пробирного системы (см. Таблицу материалы).
      1. Для изготовления Люцифераза пробирного субстрата (ЛАГ) буфера, добавьте все Люцифераза аналитического буфера в субстрат пробирного Люцифераза, который находится в коричневый стеклянной бутылке. Сохранить буфер Лас-20 ° c.
        Примечание: Лас буфер должен быть разогрет к комнатной температуре перед использованием.
      2. Для изготовления Renilla Люцифераза субстрата (RLS) буфер, смесь Renilla Люцифераза субстрата и Renilla Люцифераза буфер в пропорции 1:50. Сделать свежий RLS буфер для каждого пробирного и использовать черная труба или труба тени фольги. Рассчитайте количество RLS буфера, делая свежий буфера.
        Примечание: RLS буфер должен быть разогрет до комнатной температуры перед использованием.
    2. Набор реагентов в Считыватель микропланшетов.
      1. Мыть инъекции линии 2 x с 70% этиловом спирте; затем вымойте линии 2 x с водой.
        Примечание: Это имеет важное значение для предотвращения тревожные результаты анализа.
      2. Лас буфера P-инжектор линии (первая инъекция) и установить RLS буфера линии M-инжектор (второй инъекции). Не следует смешивать эти буферы. RLS буфера подавляет активность Люцифераза.
    3. Примените 10 мкл собранных образцов (от шага 2.5.3) 96-луночных Белые пластиковые пластины.
    4. Задайте следующие параметры в Считыватель микропланшетов. Для P-инжектор, используйте объем 50 мкл, задержка 2 s и скорость 50 мкл/сек. Для M-инжектор, используйте объем 50 мкл, задержка 2 s и скорость 50 мкл/s. задать время интеграции 15 s. набора при температуре до 25 ° C.
    5. Запустите Считыватель микропланшетов.
    6. Запись значения Люцифераза деятельности (IPValue) и значения деятельности Люцифераза Renilla (IMValue), с помощью программы сбора данных (см. Таблицу материалы).
    7. Мыть топливопроводы после сбора данных (см. шаг 2.6.2.1).
  7. Выполните анализ данных.
    1. Используйте нормализованные значения (IPValue/IMValue) для анализа данных.
    2. Установите уровень нормализованное значение (i) [pG5-Люк + pBIND-ERαEF Пакт] комбинации с транспортного средства (0 Нм лигандом) как 1 для расчета базального уровня и homodimerized ERα LBD. Уровни представлены как «Относительная активность».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рисунок 3 показывает схема возможных ответов в сочетании (i) и (ii) плазмида transfected клеток комбинации. Экспериментальные результаты показаны на рисунке 4. Деятельность комбинации (i) (pG5-Люк + pBIND-mERαEF пакт) показывает стимуляции на 10 Нм E2 (рис. 4A), потому что ERα LBD содержит лиганд зависимой transactivation функционального домена, AF-2. Агонист (например, E2), которая связывает ERα LBD новобранцев транскрипции coactivator(s) AF-2 домен. Это событие вызывает transcriptional активации без взаимодействия с VP16AD fusion LBD и делает ее трудно оценить активность homodimerization LBD вследствие неспецифических фона (рис. 3C). Деятельность комбинации (ii) (pG5-Люк + pBIND-mERαEF Пакт mERαEF) был замечен с 1 Нм и 10 Нм E2 лечения (рис. 4A). Можно было бы определить активность homodimerization ERα LBD агонист зависимой, если соответствующий лиганд концентрации для обнаружения деятельности комбинации (ii) без активации комбинации (i) можно найти (например, условие 1 Нм E2 в Рисунок 4A). Таким образом трудно обнаружить агонист опосредованной ERα LBD homodimerization активности с помощью м2ч assay. С другой стороны, деятельность комбинации (i) с 4OHT был так же, как элемент управления транспортного средства (0 Нм) уровень (Рисунок 4B). Эти результаты показывают, что 4OHT не активируется функция AF-2 ERα. Таким образом, пробирного м2ч является практически осуществимым вариантом для анализа homodimerization активность ERα LBD с 4OHT (Рисунок 3B, 3E).

Деятельность от комбинации мыши ERα LBD выражение плазмид (pBIND-mERαEF + Пакт mERαEF) с 4OHT была значительно выше, чем сочетание человеческого плазмид ERα LBD выражение (pBIND-hERαEF + Пакт hERαEF) (рис. 5A, 5B). Этот результат указывает, что 4OHT-зависимой homodimerization активности мыши ERα LBD является более мощным, чем человеческий ERα LBD. Кроме того мы проанализировали 4OHT-зависимых LBD homodimerization активности с помощью F-домен сменил ERα LBD человека мыши выражение плазмиды, mERαEhF (мышь ERα E домена с доменом человека F) и hERαEmF (человеческого ERα E домена с доменом мыши F). Homodimerization активность mERαEhF был значительно ниже, чем у mERαEF. В противоположность этому homodimerization активность hERαEmF была значительно выше, чем hERαEF (рис. 5C). Таким образом оно кажется как F домен имеет влияние на вегетационных 4OHT-зависимой ERα LBD homodimerization деятельности.

Эти результаты показывают, что деятельность димеризации ERα LBD 4OHT-как лигандов, например SERM, могут быть обнаружены м2ч assay. Далее мы продемонстрировать возможный способ анализа деятельности homodimerization ERα LBD агонистических химических веществ. ERα LBD димеризации деятельности E2 и Диэтилстильбэстрол (ДЭС) могут быть обнаружены путем м2ч assay при использовании одного амино кислот мутировал LBD ERα (мыши ERα-I362D). Эта мутация нарушает деятельность набора coactivator E2-зависимой ERα LBD8. Комбинация (i) (pG5-Люк + pBIND-mERα-I362D пакт) не был активирован E2, ни DES в любой концентрации мы проанализировали (Рисунок 6B), которая отличается от WT ERα LBD(рис. 6). ERα-I362D LBD димеризации деятельность DES был более мощным, чем E2 (Рисунок 6B). Этот мутант может использоваться для сравнительного исследования агонист зависимой ERα LBD димеризации деятельности; Однако она требует дальнейшего анализа и характеристики биологических функций этот мутант ERα.

Figure 1
Рисунок 1 : Диаграмма используется для assay м2ч плазмид. (A) Эта группа показывает pG5-люк, репортер плазмида, содержащий элемент GAL4-отзывчивым (GAL4 RE) сливается с Люцифераза кодирование гена. (B) Эта группа показывает pBIND-mERαEF, плазмида выражение протеина для синтеза mERαEF GAL4DBD; Renilla Люцифераза работает для нормализации эффективность трансфекции. (C) Эта группа показывает Пакт mERαEF, плазмида выражение протеина для ядерной локализации сигнала (NLS)-плавленый VP16AD синтез mERαEF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Диаграмма ERα LBD плазмид выражение используется в этом эксперименте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Схема м2ч assay. Эта цифра показывает представитель transfected состояние клеток с комбинации (i) плазмид (слева) и transfected клеток с комбинации (ii) плазмид (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Лиганд зависимых димеризации активности мыши ERα LBD. (A) этой группы показывает, что transfected Люцифераза активность клеток с комбинации (i) плазмид (pG5-Люк + Пакт pBIND-mERαEF) или комбинации (ii) плазмид (pG5-Люк + Пакт mERαEF + pBIND-mERαEF) с или без E2. (B) Эта группа показывает Люцифераза активность клеток transfected с комбинации (i) плазмид или комбинации (ii) плазмид с или без 4OHT. Деятельность представлена как среднее ± стандартное отклонение (SD). Граф Группа A были воссозданы из ранее опубликованных данных11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Дифференциальные димеризации активности мыши и человека LBD ERα с 4OHT. (A) Эта панель показывает transfected Люцифераза активность клеток с сочетанием мыши ERα LBD выражение плазмид (Пакт mERαEF + pBIND-mERαEF) или сочетание человеческого ERα LBD выражение плазмид (Пакт hERαEF + pBIND-hERαEF) с или без 4OHT. (B) низкая активность спектр группа A усиливается, чтобы показать активность димеризации человеческого ERα LBD и экспериментальной базальных уровней (Пакт, Пакт + pBIND-mERαEF pBIND-hERαEF). (C) Эта группа показывает Люцифераза активность клеток transfected с мышью человека F-домен сменил LBD выражение плазмид. mERαEhF обозначает мыши ERα E домена сливается с человека F домена. hERαEmF обозначает человека ERα E домена сливается с мыши F домена. Деятельность представлена как среднее ± SD. Графики были воссозданы из ранее опубликованных данных1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Обнаружение агонист опосредованной ERα LBD димеризации активности с использованием AF-2 мутировал ERα LBD. (A) этой группы показывает, что transfected Люцифераза активность клеток с комбинации (i) плазмид (pG5-Люк + Пакт pBIND-mERαEF) или комбинации (ii) плазмид (pG5-Люк + Пакт mERαEF + pBIND-mERαEF) с или без лигандами; E2 (красный), DES (фиолетовый). (B) Эта группа показывает Люцифераза активность клеток transfected с комбинации (i) плазмид (pG5-Люк + Пакт pBIND-mERα-I362D) или комбинации (ii) плазмид (pG5-Люк + Пакт mERα-I362D pBIND-mERα-I362D) с или без лигандами; E2 (красный), DES (фиолетовый). Деятельность представлена как среднее ± SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Здесь мы описали протокол M2H assay, сосредоточив внимание на условиях анализа для обнаружения homodimerization деятельность ERα LBD качестве примера. В общем м2ч пробирного не популярен для оценки лиганд зависимой ERα LBD димеризации активности. Это объясняется ERα LBD, обладающие transcriptional активации функции; в некоторых случаях, деятельность которого нарушает результаты анализа м2ч. Однако как мы показываем здесь, м2ч assay может использоваться для анализа активности димеризации LBD определенных веществ, которые не активировать функцию AF-2 transactivation LBD (например, 4OHT, SERM). Чтобы уменьшить внутреннюю активность LBD (фоновой активности), мы выбрали низкие E2-содержащие уголь раздели FBS от производства много и используется тепло инактивированная уголь раздели FBS. Эти факторы важны для успеха м2ч анализа с использованием WT ERα LBD и обнаруживать деятельность слабого взаимодействия. Кроме того, мы показали ERα LBD димеризации активность агонистов (E2 и DES) с помощью mERα-I362D-мутант, который нарушает действие набора агонист зависимой coactivator AF-2. Эти результаты показывают, что м2ч assay может быть более полезным для оценки лиганд зависимой ERα LBD димеризации активности.

В области исследований NR м2ч assay был использован для оценки лиганд зависимой coactivator или набора corepressor NR LBDs9,10. Плазмида pBIND сливается с NR взаимодействующих региона кофактора используется для этого типа эксперимента вместо pBIND-ERαEF. Этот эксперимент использует элемент короткий белок, содержащий NR, взаимодействующих мотив (LxxLL) вместо больших структурных домен coactivator. Одной из возможностей является, что больше coactivator элемент может активировать транскрипции без набора VP16AD фьюжн LBD; Это может нарушить результаты от м2ч assay. Кроме того этот протокол может использоваться для анализа деятельности привязки различных веществ в ERα. Например клетки были transfected с pG5-люк, pBIND кварцевое NR взаимодействующих мотив и Пакт ERαEF плазмид и, затем, лечение с различными химическими веществами, например химических веществ эндокринные нарушения или потенциальных гормональной терапии. Если химическое вещество в этот assay увеличивается активность Люцифераза, то прогнозируется, что химическое вещество следует взаимодействовать с ERα LBD набирать NR взаимодействующих мотив8.

Assay м2ч демонстрирует белок белковых взаимодействий в mammalian клетках. Как упоминалось во введении, Физиологическая роль белок белковых взаимодействий может отличаться в контексте конкретного типа ячейки. М2ч анализов может предоставить результаты деятельности взаимодействия протеин протеина в том же контексте сотовой, которая используется для других экспериментов, например анализ транскрипционный анализ деятельности. Кроме того он может анализировать эффект клетки сигнализации модуляторы (например, ингибиторы или активаторов киназ) с белок белковых взаимодействий в клетках. Это преимущество пробирного M2H, по сравнению с другими в vitro исследования взаимодействия протеин протеина.

Однако его необходимо рассматривать что белок белковых взаимодействий обнаруженные через м2ч assay может не представлять прямое взаимодействие между двумя белками. Другими словами существует возможность, что сотовой factor(s) существуют, разрешается подключение между двумя белками. Если возникает такое рассмотрение, оценка в vitro исследования взаимодействия протеин протеина следует требовать, например пулдаун assay протеина GST-фьюжн. Кроме того это лучше проверить уровень экспрессии pBIND и Пакт плазмида производных белков в клетках для оценки производительности системы анализа. Особенно, когда действие взаимодействия не может быть обнаружен, информацию об уровнях выражения протеина помогает определить причину результата. Анти-Gal4DBD антител и антитела анти VP16AD может использоваться для Западный анализ помаркой.

Если Лаборатория экспериментальной установки для Люцифераза репортер анализов, которые могут быть использованы для анализа деятельности транскрипции нормативных элементов или регулирующих факторов, это довольно просто, для выполнения м2ч assay. Assay м2ч это выгодно добавка метод регуляцию исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего объявить.

Acknowledgments

Авторы благодарят Drs. отдела и Ван на Национальный институт окружающей среды медицинских наук (NIEHS) за их критического чтения рукописи и Таннер Джефферсон для выполнения процедуры на видео. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения грант 1ZIAES070065 (для K.S.K.) из отдела интрамуральных исследования NIEHS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293, (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389, (6652), 753-758 (1997).
  3. Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95, (7), 927-937 (1998).
  4. Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295, (1-2), 94-100 (2008).
  5. Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9, (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).
  6. Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21, (4), 829-842 (2011).
  7. Mitry, R. R., Hughes, R. D. Human Cell Culture Protocols. Humana Press. (2011).
  8. Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290, (28), 17611-17627 (2015).
  9. Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16, (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).
  10. Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19, (12), 8226-8239 (1999).
  11. Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288, (29), 21105-21116 (2013).
Определение активности димеризации лиганд привязки домена Альфа рецептор эстрогена, используя Assay млекопитающих 2 гибрида
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).More

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter