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Cancer Research

Detectar la actividad de dimerización de dominio Ligand-obligatorio del Receptor de estrógenos alfa usando el análisis de dos híbridos mamífero

doi: 10.3791/58758 Published: December 19, 2018

Summary

Se presenta un método para el análisis de la 4-hidroxi-tamoxifeno-dependiente de estrógeno actividad del receptor alfa-ligando dominio dimerización usando el ensayo de híbridos de dos mamífero.

Abstract

Receptor de estrógenos alfa (ERα) es un regulador de transcripción ligando-dependiente estrogénica. La secuencia de la proteína ERα es altamente conservada entre especies. Se ha pensado que la función del ser humano y el ratón ERαs es idéntico. Demostramos el efecto diferencial 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) en ratón y ERα ligand-atar dominio (LBD) dimerización actividad humana usando el análisis de (M2H) híbrido de dos mamífero. El ensayo de M2H puede demostrar la eficacia de la actividad de T329N LBD en células de mamíferos, mediante la transfección de plásmidos de expresión de dos proteínas (ADN GAL4 dominio [DBD] fusión LBD y VP16 transactivation dominio [VP16AD] fusión LBD) y un Elemento GAL4-sensible (GAL4RE) fusionados con el plásmido reportero de luciferasa. Cuando la fusión de GAL4DBD LBD y la fusión de VP16AD DLB un dimer en las células, este complejo de la proteína se une a la GAL4RE y, luego, activa una expresión de gen de luciferasa a través de la actividad de transcripción dependiente de VP16AD. La activación mediada por 4OHT luciferase es mayor en las células HepG2 fueron transfectadas con el ratón ERα LBD fusión proteína expresión plásmidos que el ERα LBD fusión proteína expresión plásmido transfectada las células humanas. Este resultado sugiere que la eficacia del ratón 4OHT-dependiente de la actividad de T329N ERα LBD es superior a la humana ERα LBD. En general, la utilización del ensayo M2H no es ideal para la evaluación de la actividad de dimerización de receptores nucleares LBD, porque ligandos agonistas realzar el nivel basal de la actividad LBD e impide la detección de actividad de dimerización de LBD. Se encontró que 4OHT no mejorar la actividad basal de ERα LBD. Es un factor clave para poder determinar y detectar la actividad de dimerización de LBD dependiente de la 4OHT para usar con éxito el ensayo de M2H. M2H ensayos de ERα LBD pueden aplicarse para estudiar la actividad de agonista parcial de moduladores selectivos de estrógeno receptor (e.g., 4OHT) en varios tipos de células de mamífero.

Introduction

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Receptor de estrógenos alfa (ERα) es un regulador de transcripción ligando-dependiente estrogénica. El aminoácido sequenceof ERα es altamente conservada entre especies. Debido a la mayor homología entre humanos y ratón ERα, la función de estos receptores es considerada como idéntico, y la actividad diferencial de sustancias estrogénicas (p. ej., tamoxifeno) en las especies es causada por las diferencias de las especies de metabolismos químicos en lugar de por las diferencias estructurales de ERα. ERα altamente ha conservado las estructuras de dominio que son comunes entre la superfamilia de receptores nucleares (NR), señalada A que dominios de F. El dominio E o dominio de unión a ligando (LBD) incluye el bolsillo del atascamiento del ligand y la función de activación transcripcional 2, llamado AF-2. El dominio de F se localiza inmediatamente adyacente al dominio E y es el dominio más variable entre lo NRs. Incluso entre humanos y ratón ERα, la homología del dominio de F es menor que el de los otros dominios1. El LBD ligando enlazado de ERα mejora T329N de la proteína ERα para enlazar el elemento específico de la DNA estrógeno-sensibles directamente para la regulación de la transcripción de genes dependientes de ligando (acción clásica de ERα). Estudios Cristalográficos han revelado el posicionamiento diferencial de la hélice 12 (dominio de base de AF-2) con estradiol (E2) o 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) - límite LBD dímeros2,3. El dominio de F ERα (45 aminoácidos) Conecte hélice 12 directamente. Sin embargo, no hay información sobre el efecto de esta extensión de 45 aminoácidos (dominio de F) de la hélice 12 en la dimerización de ERα LBD. En este estudio, se demuestra la contribución del dominio de F para lo específicos dependientes de la 4OHT LBD ERα T329N usando un mamífero dos hybrid (M2H) análisis.

El ensayo de M2H es un método para demostrar las interacciones de la proteína-proteína en células de mamíferos introducción los DNAs de distintos plásmidos tres: dos plásmidos de expresión de la proteína, que expresan la fusión de dominio (DBD) de ADN de GAL4 LBD de ERα y VP16AD fusión ERα LBD, y un Plásmido de reportero de luciferasa fusionados con GAL4RE expresión. Cuando la fusión de GAL4DBD LBD ERα y la fusión de VP16AD LBD ERα interactuan (hacer un dimer) en las células, este complejo de la proteína se une a la GAL4RE y, luego, activa la expresión de genes de la luciferasa a través de la función de transactivación dependiente de la VP16AD. El nivel de LBD T329N puede evaluarse por la actividad de luciferasa.

La levadura dos híbridos (Y2H) es un método alternativo basado en el mismo principio que utiliza la levadura como el entorno de host. Informes anteriores mediante el sistema de Y2H demostraron que F-dominio-truncado humano ERα LBD aumenta reclutamiento de E2 dependiente del coactivator, concluyendo que el dominio de F previene la transcripción mediada por E24. Este resultado es coherente con otros informes que han demostrado la actividad transcripcional atenuada de ERα humano F-dominio-truncado en células de mamíferos5,6. Recientemente, nuestro estudio, utilizando el sistema M2H, demostró que la actividad de contratación del coactivator de E2 dependiente de humano ERα LBD disminuye por truncamiento del dominio de F en células de mamífero y es consistente con transcripción actividad1. Estas observaciones sugieren que el papel fisiológico de la interacción proteína-proteína es diferente en un contexto y forma de tipo específico de célula. El ensayo de M2H puede demostrar actividad de interacción de proteínas en el mismo contexto celular que se utiliza para la determinación de la actividad transcripcional. Esto proporciona una ventaja del ensayo M2H comparado con el Y2H u otros análisis de interacción en vitro proteínas.

Quedan preguntas con respecto a los mecanismos moleculares de la actividad de agonista parcial de moduladores de receptores de estrógeno selectivo (SERM) (e.g., 4OHT) para regular la transcripción mediada por el ERα. M2H ensayos de ERα LBD pueden ser aplicados para estudiar el mecanismo de la actividad de agonista parcial de los SERM en varios tipos de células de mamífero.

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Protocol

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1. preparación de plásmidos para el ensayo de híbridos de dos mamífero

  1. Utilice el siguiente plásmidos: pG5-Luc, pBIND-ERαEF y ERαEF Pacto.
    Nota: La plásmidos son de los autores a petición y se envían en papel de filtro. pG5-Luc es el plásmido reportero que contiene cinco repeticiones de GAL4 sensibles elementos fusionados con la unidad de expresión de luciferasa (figura 1A). pBIND-ERαEF es el plásmido de expresión de proteína las proteínas fusionados con GAL4DBD ERα LBD. pBIND ERαEF contiene una unidad de expresión de luciferasa Renilla para normalizar la eficiencia de transfección (figura 1B). Pacto de ERαEF es el plásmido de expresión de proteínas para las proteínas fusionados con VP16AD ERα LBD (figura 1C). El diagrama de la estructura de la proteína expresada de la plásmidos se muestra en la figura 2.
  2. Preparar el plásmido DNAs.
    1. Cortar el área cargada de plásmido de papel con unas tijeras limpias y colocarlo en un tubo de 1,5 mL. Utilice guantes y use pinzas limpias para recoger el papel cargado de plásmido. Añadir 100 μl de tampón Tris-EDTA (TE) (pH 8.0) y agitar bien.
    2. Añadir 1 μl de la solución de ADN de plásmido de paso 1.2.1 competente Escherichia coli las células (véase Tabla de materiales) y mantenga el tubo en hielo por 15 min.
    3. Células competentes del choque del calor el plásmido añadido; incubar los tubos en baño de agua de 42 ° C durante 30 s y, luego, mantenerse en hielo durante 2 minutos.
    4. Añadir 250 μl de caldo super óptimo medio de represión (SOC) de catabolito (temperatura ambiente) a los tubos y la cultura con agitación a 37 ° C durante 30 minutos.
    5. Placa de 100 μl de la culta E. coli en un plato de caldo (LB) precalentado de Luria con 100 μg/mL ampicilina (plato de 10 cm de diámetro) y cultivo a 37 ° C durante la noche.
    6. Elegir una colonia de la placa y añadir en un tubo de 14 mL que contiene 2 mL de caldo buenísimo (TB) con 100 ampicilina μg/mL. Cultivo con agitación a 37 ° C hasta que el medio es ligeramente nublado.
    7. Añadir 1 mL del medio de cultivo de paso 1.2.6 a un frasco de vidrio esterilizado 250 mL que contenga 50 mL de TB con 100 ampicilina μg/mL. Cultivo con agitación a 37 ° C durante 20-24 h.
    8. Transferencia de la culta e. coli en un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 3.450 x g a temperatura ambiente durante 30 min usando el rotor de columpio-cubo. Descartar el medio. Guardar el sedimento de e. coli a-80 ° C.
    9. Añadir 3 mL de solución de resuspensión celular (véase Tabla de materiales) a la e. coli de pellets y suspenderlo completamente. Añadir 3 mL de solución de lisis celular (véase Tabla de materiales), mezcle suavemente invirtiendo el tubo de 10 x y mantenerlo en hielo durante 5 minutos (mantener el tiempo puntualmente). Añadir 6 mL de solución de neutralización (véase Tabla de materiales), el tubo se mezclan constantemente con golpear ligeramente y luego, mantenerlo en hielo durante 10 minutos.
    10. Centrifugar el tubo a 3.450 x g a 4 ° c por 30 min usando el rotor de columpio-cubo. La solución que contiene ADN de transferencia a un nuevo tubo cónico de 50 mL y añadir 10 mL de resina de purificación de ADN (véase Tabla de materiales). Suspender la resina con cuidado.
    11. Centrifugar el tubo a 625 x g durante 1 min, utilizando el rotor swing-cubo. Deseche la solución y mantener la resina en la parte inferior.
    12. Añadir 15 mL de solución de lavado de columna (acetato de potasio 80 mM, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7.5], 40 μm EDTA y el 55% de etanol) a los 50 mL cónico del tubo y agite suavemente para suspender la resina. Repita el paso 1.2.11.
      Nota: La solución de lavado de columna debe ser preparada con dietil pirocarbonato (DEPC)-tratamiento de agua o agua libre de nucleasa.
    13. Añadir 5 mL de solución de lavado de columna en el tubo cónico de 50 mL y la resina con una pipeta 5 mL de suspensión. Aplique la resina en la columna (véase Tabla de materiales) que se encuentra en el múltiple de vacío. La columna de vacío hasta que la resina seque. Añadir 6 mL de solución de lavado de columna a la columna y el vacío.
    14. Una vez que la resina se seca visualmente, separe el depósito de la columna. Transferencia de la parte inferior de la columna (resina) a un tubo de 1,5 mL. Centrifugar la columna de a velocidad máxima durante 2 min con una microcentrífuga para secar la resina completamente.
    15. Transferencia de la parte inferior de la columna (resina) a un nuevo tubo de 1,5 mL. Añadir 300 μL de agua libre de nucleasa a la columna y espere hasta que la resina entera se haya empapado.
    16. Centrifugar la columna de a velocidad máxima durante 1 minuto recoger el plásmido que contiene el ADN solución (200-250 μL).
    17. Tratamiento de la solución que contiene ADN con fenol-cloroformo (1:1), luego con cloroformo como sigue.
      1. Añadir el mismo volumen de fenol-cloroformo (1:1) a la solución que contiene el DNA (200-250 μL), agite bien y centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos usando una microcentrífuga. Recoger la capa superior (solución que contiene el ADN) y añadir a un nuevo tubo de 1,5 mL. Repita este paso 1 x.
      2. Añadir el mismo volumen de cloroformo a la solución que contiene el DNA (200-250 μL), agitar bien y centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto recogen la capa superior (solución que contiene el ADN) y agregue a un tubo de 1,5 mL.
        Nota: Endotoxina (lipopolisacárido) induce señalización celular en algunas células. Para evitar tal efecto imprevisto, se recomienda paso 1.2.17, que puede reducir la contaminación de la endotoxina.
    18. Precipitar el plásmido de ADN mediante la técnica de precipitación del etanol como sigue.
      1. Añadir 1/9 del volumen de mezcla de ADN de 3 M acetato de sodio (pH 5.5) y 20 x de volumen de acetato de sodio de 3 M de etanol 100% a la solución que contiene ADN. Por ejemplo, añadir 27,8 μl de acetato de sodio de 3 M y 278 μl de etanol al 100% a 250 μl de la solución de ADN (el volumen final es 555.8 μL).
      2. Mantener la solución a-80 ° C por 20 min al menos. Centrifugar a velocidad máxima durante 20 min a 4 ° c. Deseche la solución y mantener el pellet. Añadir 200 μL de etanol 75% y enjuague el interior del tubo. Centrifugar 20 min a 4 ° C, deseche la solución y mantener el pellet. Secar el pellet de ADN utilizando un concentrador de vacío.
      3. Añadir 100-250 μl de tampón TE (pH 8.0) al tubo. Disolver el precipitado de ADN y comprobar la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm. Mantener la concentración de ADN alrededor de 0,5 mg/mL.

2. mamífero dos hybrid ensayo

  1. Mantener las células.
    1. Cultura hepatocelular humano células HepG2 de 750 mL, matraz de cultivo de tejidos2 de 175 cm con los medios sin rojo de fenol mínimos esenciales (MEM) suplementados con suero bovino fetal 10% (FBS; inactivado con calor), 2 mM L-glutamina, 1% solución de penicilina-estreptomicina (antibióticos) para el mantenimiento de las células.
    2. Las células en un 5% de CO2de la cultura-suplido, incubadora de 37 ° C hasta que las células son aproximadamente 90% confluente.
      Nota: Para disminuir la actividad estrogénica de fondo, medio sin rojo de fenol puede usarse para todos los experimentos M2H. Este paso debe realizarse dentro de un gabinete de seguridad biológico de banco limpio. Las células deben ser mantenidas tras las células de mamífero general cultura protocolo7.
  2. Preparar las células para la transfección.
    Nota: El siguiente procedimiento debe realizarse dentro del gabinete de seguridad biológico de banco limpio. Las células son cultivadas/incubados en un 5% CO2-suplido, incubadora de 37 ° C en este paso cada vez.
    1. Replate las células confluentes de 90% a las placas de 24 pocillos; enjuague las células 1 x con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    2. Añadir 7 mL de solución al 0.05% tripsina-EDTA al matraz de cultivo y remoje las células durante 1-2 min., manteniendo el frasco de cultura en un banco limpio a temperatura ambiente. Quitar una parte de la solución de tripsina-EDTA y dejar 1-2 mL de la solución en el matraz de la cultura. Incube el frasco de cultivo en el incubador durante 1-2 minutos.
    3. Golpear el fondo del matraz para separar las células y para comprobar las células bajo el microscopio.
      Nota: Si las células todavía se unen al matraz, incubar durante otro 1-2 min y, después, repita el paso 2.2.3.
    4. Suspender las células en el rojo de fenol libre MEM suplementado con 10% FBS despojado de carbón (inactivado con calor), 2 mM L-glutamina y 1% solución de penicilina-estreptomicina.
      Nota: FBS despojado de carbón debe utilizarse para reducir el efecto de los estrógenos endógenos derivados del suero.
    5. Contar el número de celular y las células en una placa de 24 pozos a una densidad de 1.2 x 105 células/pocillo de la semilla. Asignar tres pozos para cada punto de datos (por triplicado).
    6. La cultura las células durante la noche. Siga al paso 2.4.1.
  3. Preparar una mezcla de ADN para la transfección.
    Nota: Lo siguiente plásmido DNAs son transfectados en un pozo: 100 ng de plásmido reportero de pG5-Luc, 50 ng de plásmidos de expresión de proteínas de fusión GAL4DBD (pBIND) y 50 ng de plásmidos de expresión de proteínas de fusión VP16AD (Pacto).
    1. Para analizar la actividad de dimerización ligand-dependiente ERα LBD, preparar las siguientes combinaciones (figura 3). Combinación (i): pG5-Luc pBIND hERαEF Pacto y pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Pacto. Combinación (ii): pG5-Luc pBIND hERαEF Pacto-hERαEF y pG5-Luc + pBIND-mERαEF + mERαEF Pacto. Combinación (iii): pG5-Luc pBIND Pacto-hERαEF y pG5-Luc + pBIND + Pacto de mERαEF.
      Nota: Combinación (i) representa el nivel basal experimental humano ERα LBD y el ratón ERα LBD, respectivamente. Si el resultado muestra un nivel notable alto con ligando solo, este método es inviable para el uso con eso ligando (por ejemplo, dietilestilbestrol [DES]). Combinación (ii) representa los niveles de LBD de ERα humano dimerized y ratón dimerized ERα LBD, respectivamente. Combinación (iii) representa controles negativos; utilizar este sistema sólo cuando el experimento se realiza por primera vez evaluar el nivel de fondo del sistema.
    2. Antes de mezclar, calcular el total de cantidad de ADN necesaria basándose en el número de pozos para la transfección. Para experimentos en triplicado y en cinco puntos, mezcle lo siguiente plásmido DNAs en los tubos dos 1.5 μL para combinaciones (i) y (ii): pG5-Luc, 5 (puntos de datos) x 3 (pozos) x 100 ng = 1.500 ng (15 μl); pBIND-mERαEF, 5 (puntos de datos) x 3 (pozos) x 50 ng = 750 ng (7.5 μl); Pacto (combinación i) o pacto-mERαEF (para combinación ii), 5 (puntos de datos) x 3 (pozos) x 50 ng = 750 ng (7.5 μl).
      Nota: La concentración de cada solución de DNA plasmídico es 0,1 μg/μl.
    3. Precipitar la mezcla de ADN mediante la técnica de precipitación del etanol. Añadir 1/9 del volumen de mezcla de ADN de 3 M acetato de sodio (pH 5.5) y 20 x de volumen de acetato de sodio de 3 M de 100% de etanol a la mezcla de ADN. Entonces, vórtice del tubo.
      Nota: por ejemplo, añadir 3.4 μL de acetato de sodio de 3 M y 34 μl de etanol al 100% a los 30 μl de mezcla de ADN de plásmido en paso 2.3.2. Este paso ayuda a mantener un estado invariable de la transfección, y no es necesario realizar este paso en un gabinete de seguridad biológica.
    4. Mantener la mezcla durante la noche a-20 ° C. Centrifugar a velocidad máxima durante 20 min a 4 ° C. Deseche la solución (el perdigón es invisible). Añadir 120 μl de etanol al 75% en el tubo; Luego, enjuague el interior del tubo. Centrifugar 20 min a 4 ° C. Deseche la solución y seque la mezcla de ADN utilizando un concentrador de vacío durante 30 minutos.
  4. Realizar la transfección.
    Nota: Los pasos siguientes deben realizarse en un banco limpio o en un gabinete de seguridad biológica.
    1. A la mañana siguiente, enjuagar las células sembradas en una placa de 24 pocillos (de paso 2.2.6) 2 x 0,5 ml de PBS (temperatura ambiente).
    2. Añadir tibia (37 ° C) fresco sin rojo de fenol MEM suplementado con 10% FBS (inactivado con calor) y 2 mM L-glutamina sin antibióticos para cada bien (medio de 0,5 mL/pocillo) despojado de carbón. Mantener las células en un 5% CO2-suplido, incubadora de 37 ° C.
    3. Suspender la mezcla de ADN de plásmido secos (de paso 2.3.4) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (no suero, libre de rojo de fenol, sin glutamina; 13 μL/pocillo). Calcular las cantidades de DMEM del número de pozos para la transfección.
      Nota: 15 pozos para la combinación (i) x 13 μl = μl 195 y 15 pozos para la combinación (ii) x 13 μl = μl 195.
    4. Suspender el reactivo de transfección (véase Tabla de materiales; 1,5 μL/pocillo) en DMEM (12.5 μL/pocillo) en otro tubo de 1,5 mL. Calcular las cantidades de reactivo de transfección y DMEM del número de pozos para la transfección.
      Nota: 30 [15 pozos para combinación] (i) y 15 pozos de combinación (ii) x 1,5 μl de reactivo de transfección + 30 x 12.5 μl de DMEM = 420 μl.
    5. Añadir una cantidad igual del medio de reactivo de transfección (del paso 2.4.4) a cada tubo (de paso 2.4.3). Incubar los tubos durante 5-10 min a temperatura ambiente.
      Nota: 200 μL de medio de reactivo de transfección + 195 μl de combinación mezcla (i) ADN = 395 μl y 200 μL de medio de reactivo de transfección + 195 μl de combinación de mezcla de ADN (ii) = 395 μl. Es importante añadir un volumen igual de medio de reactivo de transfección en los tubos de combinación (i) y (ii). No es necesario usar el medio de en este paso.
    6. Añadir la mezcla combinada (de paso 2.4.5) en cada pocillo (25 μL/pocillo) de la placa de 24 pozos (de paso 2.4.2) e incubar las células durante 6 h en el 5% CO2-suplido, incubadora de 37 ° C.
    7. Retire el medio de transfección de la placa de 24 pocillos. Añadir tibia (37 ° C) fresco sin rojo de fenol MEM suplementado con 10% FBS (inactivado con calor), 2 mM L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina solución y ligando (suspendido en etanol) despojado de carbón (medio de 0,5 mL/pocillo). Cultura de las células 16-18 h en el 5% CO2-suplido, incubadora de 37 ° C.
  5. Las muestras de la cosecha.
    1. Lavar las células con 1 mL de PBS y, a continuación, añada 100 μl de 1 x de tampón de lisis pasiva (véase Tabla de materiales).
    2. Agite vigorosamente las placas de 24 pocillos con un mezclador de tipo vórtex para separar las células.
    3. Congelar las placas (lysates de la célula) 1 x salvarlos o nitrógeno líquido a-80 ° C antes del análisis. Inmediatamente antes del ensayo, agite vigorosamente las placas en un agitador hasta que estén a temperatura ambiente.
      Nota: Este proceso evita la forma irregular que aparecen valores anómalos de la actividad de luciferasa.
  6. Realizar un ensayo de doble-luciferasa.
    1. Preparar los reactivos para el sistema de ensayo de luciferasa doble (véase Tabla de materiales).
      1. Para hacer el tampón de sustrato (LAS) ensayo de luciferasa, añadir tampón de ensayo de luciferasa todo el sustrato de ensayo de luciferasa en un frasco de vidrio marrón. Guardar el buffer de LAS a-20 ° C.
        Nota: El buffer de LAS debe ser calentado a la temperatura ambiente antes de usar.
      2. Para hacer el tampón de sustrato (RLS) de luciferasa Renilla, mezclar Renilla luciferasa sustrato y buffer de luciferasa Renilla en una proporción de 1:50. Hacer frescos RLS de búfer para cada ensayo y use un tubo negro o un tubo bajo la sombra de papel de estaño. Calcular la cantidad de buffer RLS haciendo un almacenador intermediario fresco.
        Nota: El buffer RLS debe ser calentado a la temperatura ambiente antes de usar.
    2. Ajustar los reactivos en el lector de microplacas.
      1. Líneas de lavado la inyección 2 x con etanol al 70%; Luego, lavar las líneas 2 x con agua.
        Nota: Esto es importante para evitar molestar a los resultados del ensayo.
      2. LAS del almacenador intermediario al P-inyector de línea (primera inyección) y establezca el búfer RLS en la línea M-inyector (segunda inyección). No mezcle estos búferes. Buffer RLS inhibe la actividad de luciferasa.
    3. Se aplican 10 μl de las muestras cosechadas (del paso 2.5.3) a la placa de plástico blanca de 96 pocillos.
    4. Aplicar los siguientes ajustes para el lector de microplacas. Para el P-inyector, utilizar un volumen de 50 μL, un retraso de 2 s y una velocidad de 50 μl/s. Para el M-inyector, utilizar un volumen de 50 μL, un retraso de 2 s y una velocidad de 50 μl/s. establecer un tiempo de integración de conjunto s. 15 la temperatura a 25 ° C.
    5. Ejecutar el lector de microplacas.
    6. Anotar los valores de la actividad de luciferasa (IPValue) y los valores de la actividad de la luciferasa de la Renilla (IMValue) utilizando el programa de adquisición de datos (véase Tabla de materiales).
    7. Lavar las líneas de inyección después de la recolección de datos (ver paso 2.6.2.1).
  7. Realizar análisis de datos.
    1. Utilice los valores normalizados (IPValue/IMValue) para análisis de datos.
    2. Establezca el valor normalizado de la combinación (i) [pG5-Luc + pBIND ERαEF Pacto] con vehículo (ligando de nM 0) como 1 para el cálculo del nivel basal y el homodimerized ERα LBD nivel. Los niveles se representan como "Actividad relativa".

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Representative Results

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Figura 3 muestra el esquema de posibles respuestas en la combinación (i) y combinación (ii) plásmido transfected células. Los resultados experimentales se muestran en la figura 4. La actividad de combinación (i) (pG5-Luc + pBIND mERαEF Pacto) muestra estímulo de 10 nM E2 (figura 4A), porque el ERα LBD contiene el dominio funcional del transactivation dependiente de ligando, AF-2. Agonista (por ejemplo, E2) que se une a la LBD ERα recluta coactivator(s) transcripción el dominio AF-2. Este evento causa la activación transcripcional sin interacción con la fusión de VP16AD LBD y hace difícil evaluar la actividad de T329N LBD debido al fondo no específico (figura 3C). La actividad de combinación (ii) (pG5-Luc + pBIND mERαEF Pacto-mERαEF) se observó con 1 nM y 10 nM E2 tratamiento (figura 4A). Sería posible determinar la actividad de T329N ERα LBD de agonista-dependiente si se encuentra la concentración de ligando apropiado para detectar la actividad de combinación (ii) sin la activación de combinación (i) (por ejemplo, la condición de 1 nM E2 en la figura 4A). Por lo tanto, es difícil detectar la actividad de T329N de ERα LBD mediado por agonistas usando el ensayo M2H. Por otro lado, la actividad de combinación (i) con 4OHT era el mismo que el control del vehículo (0 nM) nivel (figura 4B). Estos resultados sugieren que la función AF-2 de ERα no es activada por 4OHT. Así, el ensayo M2H es una opción viable para el análisis de la actividad de T329N de ERα LBD con 4OHT (figura 3B, 3E).

La actividad de la combinación de ratón ERα LBD expresión plásmidos (pBIND-mERαEF + Pacto-mERαEF) con 4OHT fue significativamente mayor que la combinación de humanos plásmidos de expresión ERα LBD (pBIND-hERαEF + Pacto-hERαEF) (figura 5A, 5B). Este resultado indica que la actividad de T329N 4OHT-dependiente del ratón ERα LBD es más potente que la humana ERα LBD. Además, se analizaron actividad de T329N LBD 4OHT-dependiente con la plásmidos expresión ratón humanos intercambio de dominio F ERα LBD, mERαEhF (ratón de dominio E ERα con humano dominio de F) y hERαEmF (dominio de ERα E humano con dominio del ratón F). La actividad de T329N de mERαEhF fue significativamente menor que la de mERαEF. Por el contrario, la actividad de T329N de hERαEmF fue significativamente mayor que el hERαEF (figura 5C). Así, parece que el dominio de F tiene una influencia sobre la actividad de T329N de ERα LBD de 4OHT dependientes específicos.

Estos resultados sugieren que la actividad de la dimerización de ERα LBD de 4OHT como ligandos, como SERM, puede detectarse por el ensayo de M2H. A continuación, se demuestra una posible forma de analizar la actividad de T329N ERα LBD de productos agonísticos químicos. Actividades de dimerización de ERα LBD de E2 y dietilestilbestrol (DES) pueden detectarse mediante el ensayo de M2H cuando se utiliza un solo-amino-ácido-transformado ERα LBD (ratón ERα-I362D). Esta mutación altera la actividad de contratación del coactivator de E2 dependiente de ERα LBD8. Combinación (i) (pG5-Luc + pBIND-mERα-I362D + Pacto) no se activó por E2 ni DES a cualquier concentración hemos analizado (figura 6B), que era diferente de WT ERα LBD (figura 6A). La actividad de la dimerización de ERα I362D LBD de DES fue más potente que la E2 (figura 6B). Este mutante puede ser utilizado para un estudio comparativo de la actividad de dimerización de ERα LBD agonista-dependiente; sin embargo, requiere más análisis y la caracterización de la funcionalidad biológica de esta mutante ERα.

Figure 1
Figura 1 : Diagrama de plásmidos utilizados para el ensayo de M2H. (A) este panel muestra pG5-Luc, el plásmido reportero que contiene un elemento GAL4-sensible (RE GAL4) fusionado con un codificación gen de luciferasa. (B) este panel muestra pBIND-mERαEF, el plásmido de expresión de la proteína para GAL4DBD fusión mERαEF; Renilla LUCIFERASA trabaja para normalizar la eficiencia de transfección. (C) este panel muestra el Pacto-mERαEF, el plásmido de expresión de la proteína para la señal de localización nuclear (NLS)-fusionado VP16AD fusión mERαEF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Diagrama de plásmidos de expresión ERα LBD utilizado en este experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Esquema del ensayo M2H. Esta figura muestra al representante estado de las células transfectadas con combinación (i) plásmidos (izquierdas) y las células transfected con combinación (ii) plásmidos (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Actividad de dimerización ligand-dependiente del ratón ERα LBD. (A) este panel muestra que la actividad de luciferasa de las células transfectada con combinación (i) plásmidos (pG5-Luc + Pacto pBIND-mERαEF) o combinación (ii) plásmidos (pG5-Luc + Pacto-mERαEF + mERαEF pBIND) con o sin E2. (B) este panel muestra la actividad de luciferasa de las células transfectadas con combinación (i) plásmidos o combinación (ii) plásmidos con o sin 4OHT. La actividad está representada como la media ± la desviación estándar (SD). El gráfico de grupo A ha sido recreado de datos previamente publicados11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Actividad diferencial dimerización de ratón y humanas ERα LBD con 4OHT. (A) este panel muestra la actividad de luciferasa de las células transfectada con la combinación de ratón plásmidos de expresión ERα LBD (Pacto-mERαEF + mERαEF pBIND) o la combinación de humanos plásmidos de expresión ERα LBD (Pacto-hERαEF + hERαEF pBIND) con o sin 4OHT. (B) el bajo rango de actividad del panel A se amplía para mostrar la actividad de la dimerización de LBD de ERα humana y experimentales niveles basales (Pacto mERαEF pBIND, pacto + pBIND-hERαEF). (C) este panel muestra la actividad de luciferasa de las células transfectadas con los plásmidos de expresión ratón humanos intercambio de dominio F LBD. mERαEhF denota ratón ERα E dominio fusionado con humano dominio de F. hERαEmF denota dominio de ERα E humano fusionado con ratón dominio de F. La actividad se representa como la media ± la SD. Los gráficos se han recreado de datos previamente publicados1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Detección de agonista-mediada ERα LBD dimerización actividad utilizando un AF-2 mutado ERα LBD. (A) este panel muestra que la actividad de luciferasa de las células transfectada con combinación (i) plásmidos (pG5-Luc + Pacto pBIND-mERαEF) o combinación (ii) plásmidos (pG5-Luc + Pacto-mERαEF + mERαEF pBIND) con o sin ligandos; E2 (rojo), DES (púrpura). (B) este panel muestra la actividad de luciferasa de las células transfectadas con combinación (i) plásmidos (pG5-Luc + Pacto pBIND-mERα-I362D) o combinación (ii) plásmidos (pG5-Luc + Pacto-mERα-I362D + pBIND-mERα-I362D) con o sin ligandos; E2 (rojo), DES (púrpura). La actividad se representa como la media ± el SD. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Adjunto, describimos el protocolo para el ensayo de M2H, centrándose en las condiciones de ensayo para la detección de la actividad de T329N de ERα LBD como ejemplo. En general, el ensayo M2H no es popular para la evaluación de la actividad de dimerización ligand-dependiente ERα LBD. Esto es debido a la LBD ERα poseen una función de activación transcripcional; la actividad que molesta, en algunos casos, los resultados del ensayo M2H. Sin embargo, como se demuestra aquí, el ensayo M2H puede ser usado para el análisis de la actividad de la dimerización de LBD de ciertas sustancias que no active la función de transactivación AF-2 del LBD (p. ej., 4OHT, SERM). Para reducir la actividad intrínseca de LBD (actividad de fondo), seleccionamos la más baja que contengan E2 despojado de carbón FBS de los lotes de producción y utilizan inactivadas por calor FBS despojado de carbón. Estos factores son importantes para el éxito del ensayo M2H con el LBD de ERα WT y detectar la actividad de interacción débil. Además, nos mostró el LBD ERα dimerización actividad de agonistas (E2 y DES) utilizando el mERα-I362D mutante, que interrumpe la actividad de reclutamiento de agonista-dependiente del coactivator AF-2. Estos resultados sugieren que el ensayo M2H podría ser más útil para la evaluación de la actividad de dimerización ligand-dependiente ERα LBD.

En el campo de la investigación NR, el ensayo M2H se ha utilizado para la evaluación de ligand-dependiente del coactivator o correpresor contratación actividad de LBDs NR9,10. El plásmido de pBIND fusionado con la región de interacción de NR del cofactor se utiliza para este tipo de experimento en lugar de utilizar el pBIND-ERαEF. Este experimento utiliza el elemento de corta de la proteína que contiene el NR interactuando adorno (LxxLL) en lugar de un dominio estructural mayor del del coactivator. Una posibilidad es que el mayor elemento del coactivator puede activar la transcripción sin la contratación de la fusión de VP16AD LBD; podría alterar los resultados de lo análisis M2H. Por otra parte, este protocolo podría utilizarse para el análisis de la actividad de una variedad de sustancias para el ERα. Por ejemplo, las células fueron transfectadas con pG5-Luc, fusionados con pBIND NR motivo en interacción y plásmidos de Pacto-ERαEF y, entonces, tratadas con productos químicos diversos, tales como productos químicos de interrupción endocrina o posibles terapias hormonales. Si la actividad de luciferasa es aumentada en un producto químico en este ensayo, se prevé que el producto químico se debe interactuar con el LBD ERα reclutar el motivo de interacción NR8.

El ensayo de M2H muestra las interacciones de la proteína-proteína en células de mamíferos. Como mencionamos en la Introducción, el papel fisiológico de las interacciones proteína-proteína puede ser diferente en un contexto de específica de tipo celular. M2h ensayos pueden proporcionar los resultados de la actividad de interacción de proteínas en el mismo contexto celular que se utiliza para otros experimentos, como el análisis de la actividad transcripcional. Además, puede analizar el efecto de señalización celular moduladores (p. ej., inhibidores o activadores de las quinasas) involucrados en las interacciones de proteínas en las células. Esto es una ventaja del ensayo M2H comparado con otros estudios en vitro proteína-proteína interacción.

Sin embargo, debe considerarse que las interacciones proteína-proteína detectaron vía el M2H ensayo no pudo representar una interacción directa entre dos proteínas. En otras palabras, existe la posibilidad de que existan factores celulares que permiten que una conexión entre dos proteínas. Si se presenta un examen, la evaluación de en vitro estudios de interacción de proteínas debe ser requerida, tales como el ensayo de telecine de proteína de GST-fusión. Además, es mejor comprobar el nivel de expresión de proteínas derivadas pBIND y con pacto-plásmido en las células para evaluar el desempeño del sistema de ensayo. Especialmente cuando no se puede detectar la actividad de interacción, la información de los niveles de expresión de la proteína ayuda a determinar la causa del resultado. Anti-VP16AD y el anticuerpo anti-Gal4DBD pueden utilizarse para un análisis de western blot.

Si el laboratorio cuenta con el montaje experimental para ensayos reportero de luciferasa, que puede utilizarse para el análisis de la actividad de transcripción de elementos reguladores o regulación de factores, es bastante sencillo realizar el ensayo de M2H. El ensayo de M2H es un ventajoso método aditivo para estudios de regulación transcripcional.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que declarar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a los Drs. Sueyoshi y Wang en el nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) para su lectura crítica del manuscrito y Jefferson de Tanner para realizar procedimientos en el video. Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud beca 1ZIAES070065 (a K.S.K.) de la división de investigación intramuros de la NIEHS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

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References

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Detectar la actividad de dimerización de dominio Ligand-obligatorio del Receptor de estrógenos alfa usando el análisis de dos híbridos mamífero
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Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).More

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

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