Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

doi: 10.3791/58758 Published: December 19, 2018

Summary

Biz memeli iki-hibrid tahlil kullanarak 4-hidroksi-tamoxifen-bağımlı östrojen reseptör Alfa ligand bağlayıcı etki alanı dimerization etkinliğini analiz etmek için bir yöntem mevcut.

Abstract

Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. ERα protein dizi türleri arasında son derece korunmuş. İnsan işlevinin ve fare ERαs aynı olduğunu düşündüm. Fare ve insan ERα ligand bağlayıcı etki (yakın) dimerization etkinliği memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak fark 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) etkisi göstermektedir. M2H tahlil kullanan iki protein ifade plazmid (GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı [DBD] füzyon yakın ve VP16 transactivation etki alanı [VP16AD] füzyon yakın) transfection yakın homodimerization aktivite memeli hücrelerinde verimliliğini kanıtlamanın ve bir GAL4 duyarlı öğesi (GAL4RE) luciferase muhabir plazmid erimiş. GAL4DBD fusion yakın ve VP16AD füzyon yakın bir dimer hücrelerde yaptığınızda, bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve sonra bir luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağımlı transkripsiyonu faaliyetleri ile hiçbir devreye giriyor. 4OHT-aracılı luciferase harekete geçirmek fare ERα yakın füzyon protein ifade plazmid insan hücrelerinde ERα yakın füzyon protein ifade transfected plazmid ile transfected HepG2 hücreleri yüksektir. Bu sonuç 4OHT bağımlı fare ERα yakın homodimerization faaliyet etkinliği insan ERα yakın yüksek olduğunu göstermektedir. Genel olarak, M2H tahlil kullanımı agonistik ligandlar yakın etkinlik bazal düzeyini arttırmak ve bu yakın dimerization aktivite tespiti engellemektedir Çünkü nükleer reseptör yakın dimerization etkinlik, değerlendirme için ideal değildir. Bulduğumuz o 4OHT ERα yakın bazal etkinlik geliştirmez. Bu belirlemek ve M2H tahlil başarıyla kullanmak için 4OHT bağlı yakın dimerization aktivite tespit edememek için önemli bir faktördür. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist etkinliği seçici östrojen reseptör modülatörleri (Örneğin, 4OHT) ile çalışmaya çeşitli memeli hücre tiplerinde uygulanabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. Amino asit sequenceof ERα türler arasında son derece korunmuş. İnsan arasında daha yüksek Homoloji nedeniyle ve ERα fare, bu reseptörleri işlevini, aynı düşünce ve östrojenik maddeler (Örneğin, Tamoksifen) bu türlerin farklı etkinlik türün farklılıkları nedeniyle oluşur kimyasal metabolizmaları ERα yapısal farklılıklar tarafından değil. ERα son derece A F etki alanlarına belirlenmiş nükleer reseptör (NR) üst aile arasında yaygın etki alanı yapılarına korunmuş. E veya ligand bağlayıcı etki alanı (yakın)-ligand taşıması cep ve transkripsiyon aktivasyon fonksiyonu 2, içerir AF-2 adlı. F etki alanı hemen E etki alanına bitişik yerelleştirilmiştir ve NRs arasında en değişken etki alanıdır. Hatta insan arasında ve ERα fare, Homoloji F etki alanının önemli ölçüde diğer etki alanları1daha düşüktür. ERα ligand bağlı yakın (ERα klasik eylem) ligand-bağımlı Gen transkripsiyonu düzenleyen için doğrudan belirli östrojen duyarlı DNA öğeyi bağlamak için ERα protein homodimerization artırır. Helix 12 (AF-2 çekirdek etki alanı) ile estradiol (E2) - ya da 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) - Diferansiyel konumlandırma bağlı yakın dimer2,3Crystallographic çalışmalar ortaya koymuştur. ERα F etki alanı (45 amino asitler) helix 12 doğrudan bağlayın. Ancak, ERα yakın dimerization bu eklentinin helix 12 üzerinden 45 amino asitlerin (F etki alanı) etkisi ile ilgili hiçbir bilgi yoktur. Bu çalışmada, bir memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak species-specific 4OHT bağlı ERα yakın homodimerization F etki alanına katkısını göstermek.

M2H tahlil üç farklı plazmid DNA'lar tanıtımı memeli hücrelerinde protein-protein etkileşimlerini göstermek için bir yöntemdir: GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı (DBD) füzyon ERα yakın ve VP16AD füzyon ERα yakın hızlı, iki protein ifade plazmid ve bir GAL4RE erimiş luciferase ifade muhabir plazmid. Ne zaman GAL4DBD füzyon ERα yakın ve VP16AD füzyon ERα yakın etkileşim (yapmak bir dimer) hücrelerde bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve, sonra luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağlı transactivation işlevi aracılığıyla etkinleştirir. YAKIN homodimerization düzeyini luciferase aktivite değerlendirilebilir.

Maya iki-hibrid (Y2H) tahlil Maya ana bilgisayar ortamı olarak kullanır aynı ilkeye göre alternatif bir yöntemdir. Y2H sistemi kullanarak önceki raporları F-etki alanı-kesme insan ERα yakın E2 bağımlı coactivator işe alım, F etki alanı E2-aracılı transkripsiyon4engeller sonuç artar gösterdi. Bu sonuç hangi insan ERα memeli hücreleri5,6F-etki alanı-kesme zayıflatılmış transkripsiyon faaliyet gösterdiği diğer Özet Tablo raporları ile tutarsız. Son zamanlarda, bizim çalışma M2H sistemiyle, insan ERα yakın E2 bağımlı coactivator işe alım etkinliği tarafından F etki alanı kesme memeli hücrelerinde azalma ve transkripsiyon etkinlik1ile tutarlıdır gösterdi. Bu gözlemler protein-protein etkileşim fizyolojik rolü bir hücre türüne özgü şekilde ve içeriği farklıdır öneririm. M2H tahlil protein-protein etkileşim Etkinlik transkripsiyon etkinliğini belirlemek için kullanılan aynı hücresel bağlamında kanıtlamanın. Bu Y2H ya da diğer vitro protein-protein etkileşim analizleri ile karşılaştırıldığında M2H testin bir avantaj sağlar.

Seçici östrojen reseptör modülatörleri (SERMs) (Örneğin, 4OHT) ERα-aracılı transkripsiyonu düzenleyen kısmi agonist etkinliğinin moleküler mekanizmaları ile ilgili sorular kalır. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist aktivitesinde SERMs çeşitli memeli hücre türleri mekanizması çalışmaya uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. hazırlanması plazmid memeli iki-hibrid tahlil için

  1. Aşağıdaki plazmid kullanın: pG5-Luc, pBIND-ERαEF ve Paktı-ERαEF.
    Not: Plazmid yazarlardan istek üzerine mevcuttur ve filtre kağıdı gönderilir. pG5-Luc duyarlı öğeleri luciferase ifade birimi (Şekil 1A) ile erimiş GAL4 beş tekrarlar içeren muhabir plazmid var. pBIND-ERαEF protein ifade plazmid ERα yakın GAL4DBD erimiş proteinler için var. pBIND-ERαEF bir Renilla luciferase ifade transfection verim (Şekil 1B) normalleştirme için içerir. Paktı-ERαEF protein ifade plazmid ERα yakın VP16AD erimiş proteinler (Şekil 1C) için olduğunu. Plazmid ifade protein yapısından diyagramı Şekil 2' de gösterilmiştir.
  2. Plazmid DNA'lar hazırlayın.
    1. Temiz makas kullanarak kağıt plazmid yüklü alanından dışarı ve 1,5 mL tüp içine koydu. Eldiven giymek ve temiz cımbız plazmid yüklü gazeteyi almak için kullanın. 100 µL Tris-EDTA (TE) arabelleği (pH 8.0) ve girdap de ekleyin.
    2. 1 µL eklemek plazmid DNA çözüm adım yetkili Escherichia coli 1.2.1 hücreleri ( Tablo malzemelerigörmek) ve tüp buz 15 dakika tutun.
    3. Isı şok plazmid eklendi yetkili hücreleri; tüpler için 30 42 ° C su banyosunda kuluçkaya s ve sonra buz 2 min için saklayın.
    4. Tüpler ve kültür için 30 dk 37 ° C'de sallayarak ile 250 µL catabolite baskı (SOC) Orta (Oda sıcaklığında) ile süper en iyi suyu ekleyin.
    5. Kültürlü E. coli prewarmed Luria suyu (LB) plaka üzerine 100 µL gecede 100 µg/mL ampisilin (10 cm çapında çanak) ve 37 ° C'de kültürü ile plaka.
    6. Bir koloni plaka almak ve müthiş suyu (TB) 100 µg/mL ampisilin ile 2 mL içeren bir 14 mL tüp içine ekleyin. Orta hafif bulutlu 's kadar 37 ° C'de sallayarak ile kültür.
    7. Kültürlü orta 1 mL 1.2.6 adımından TB 50 mL 100 µg/mL ampisilin ile içeren bir autoclaved 250 mL Cam şişe ekleyin. 20-24 h 37 ° C'de sallayarak ile kültür.
    8. Kültürlü E. coli 50 mL konik tüp ve 30 dk salıncak-kova rotor kullanarak 3.450 x g oda sıcaklığında, santrifüj aktarın. Orta atın. E. coli Pelet-80 ° C'de kaydetmek
    9. Hücre resuspension çözümü 3 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) E. coli için cips ve tamamen askıya alma. Hücre lizis çözümü 3 mL ekleyin (bakınız Tablo malzemeler), karışımı yavaşça bu ters çevirme tarafından tüp 10 x ve 5 min için buz tutmak (zamanında almak belgili tanımlık zaman). Nötralizasyon çözüm 6 mL ekleyin (bkz. Tablo reçetesi) tüp giderek dokunarak ile karıştırın ve daha sonra 10 min için buz üzerinde tutmak.
    10. 30 dk salıncak-kova rotor kullanarak için 4 ˚C'de 3.450 x g , tüp santrifüj kapasitesi. DNA içeren çözüm yeni bir 50 mL konik tüp aktarmak ve DNA arıtma reçine 10 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Reçine yavaşça askıya alma.
    11. 625 x g 1dk salıncak-kova rotor kullanarak için de tüp santrifüj kapasitesi. Çözüm atın ve reçine altındaki koruyun.
    12. 15 mL sütun yıkama çözeltisi ekleyin (80 mM potasyum asetat, 8.5 mM Tris-HCl [pH 7,5], 40 µM EDTA ve % 55 etanol) 50 mL konik tüp ve yavaşça reçine askıya almak için salla. 1.2.11 arasındaki adımları yineleyin.
      Not: Sütun yıkama çözüm dietil pyrocarbonate (DEPC) kullanılarak hazırlanması gerekir-tedavi su veya su nükleaz ücretsiz.
    13. 5 mL sütun yıkama çözeltisi 50 mL konik tüp ekleyin ve reçine ile 5 mL damlalıklı askıya alma. Reçine sütununa uygulamak vakum manifold üzerinde ayarlanmış ( Tablo malzemelerigörmek) bu. Reçine kuru kadar sütun vakum. 6 mL sütun yıkama çözeltisi sütun ve vakum için ekleyin.
    14. Görsel olarak reçine kurur sonra havzanın sütundan ayırmak. Sütun (reçine) alt bölümünde 1,5 mL tüp aktarın. Sütun 2 min bir microcentrifuge reçine kurumasını kullanmak için maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
    15. Sütun (reçine) alt bölümünde yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. Nükleaz ücretsiz su 300 µL sütununu ekleyin ve bütün reçine sırılsıklam olana kadar bekleyin.
    16. Plazmid DNA içeren çözüm (200-250 µL) toplamak 1 dk için maksimum hızda sütun santrifüj kapasitesi.
    17. Fenol-kloroform (1:1), sonra kloroform ile DNA içeren çözümle aşağıdaki gibi davran.
      1. Iyice çalkalayınız ve 2 min bir microcentrifuge kullanarak için maksimum hızda santrifüj kapasitesi fenol kloroform (1:1) aynı hacmi DNA içeren çözüm (200-250 µL) ekleyin. Üst katmanı (DNA içeren çözüm) toplamak ve yeni bir 1,5 mL tüp ekleyin. 1 x bu adımı yineleyin.
      2. Kloroform aynı hacmi DNA içeren (200-250 µL) ekleyin, sallamak iyi ve 1 dk. maksimum hızda santrifüj üst katmanı (DNA içeren çözüm) toplamak ve bir 1,5 mL tüp ekleyin.
        Not: Bazı hücreler hücresel sinyal endotoksin (lipopolysaccharide) neden olmaktadır. Böyle gizemli bir etkisi önlemek için adım 1.2.17, hangi-ebilmek azaltmak endotoksin kirlenme önerilir.
    18. Plazmid DNA gibi etanol yağış tekniği kullanarak çökelti.
      1. 1/9 3 M sodyum asetat (pH 5.5) DNA karışımı hacminin ekleyin ve 20 x 3M sodyum asetat hacminin % 100 etanol DNA içeren çözüm için. Örneğin, 3 M sodyum asetat 27,8 µL ve 278 µL % 100 etanol (son 555.8 µL birimdir) DNA çözüm 250 µL için ekleyin.
      2. Çözüm için 20 dk-80 ° C'de en az tutun. 20 dk 4 ˚C az için maksimum hızda santrifüj kapasitesi. Çözüm atın ve Pelet koruyun. 200 µL % 75 etanol ekleyin ve tüp içine durulayın. 4 ° C'de 20 dk santrifüj kapasitesi, çözüm atın ve Pelet koruyun. Vakum yoğunlaştırıcı kullanarak DNA Pelet kuru.
      3. 100-250 µL TE arabelleği (pH 8.0) tüp ekleyin. DNA Pelet dağıtılması ve dalga boyu 260 bir spektrofotometre kullanarak DNA toplama kontrol nm. DNA konsantrasyonu 0.5 mg/mL etrafında tutmak.

2. memeli iki-hibrid tahlil

  1. Hücreleri korumak.
    1. İnsan hepatosellüler karsinom HepG2 hücrelerde 750 mL, 175 cm2 doku kültürü şişesi ile fenol red ücretsiz minimum temel medya (MEM) % 10 fetal Sığır serum ile desteklenmiş Kültür (FBS; ısı inaktive), 2 mM L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin çözüm (antibiyotik) hücreleri korumak için.
    2. %5 CO2hücrelerinde kültür-hücreleri yaklaşık % 90 birleşmesi olana desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.
      Not: östrojenik arka plan etkinliğini azaltmak için orta fenol red-ücretsiz tüm M2H deneyler için kullanılmalıdır. Bu adım bir temiz tezgah/biyolojik güvenlik kabin içinde gerçekleştirilmelidir. Hücreleri genel memeli hücre kültür protokol7takip sağlanmalıdır.
  2. Hücreleri transfection için hazır olun.
    Not: Aşağıdaki yordam adımları kabine temiz tezgah/biyolojik güvenlik içinde gerçekleştirilmelidir. Hücreler kültürlü/inkübe bir % 5 CO2'-Bu adımda her zaman desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.
    1. 24-şey plakaları % 90 konfluent hücrelere replate; hücreleri 1 durulama x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile.
    2. Kültür şişeye 7 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 1-2 min için hücreleri kültür balonun içinde temiz bir Bank oda sıcaklığında tutarken ıslatın. Tripsin-EDTA çözümünün bir parçası kaldırmak ve 1-2 mL çözüm kültür şişeye bırakın. 1-2 min için kuluçka kültür şişeye kuluçkaya.
    3. Hücreleri ayırmak ve mikroskop altında hücreleri denetleyin şişeye alt şaplak at.
      Not: hücreleri için şişesi hala iliştirilmişse, başka bir 1-2 min için kuluçkaya ve, sonra 2.2.3 arasındaki adımları yineleyin.
    4. % 10 ile desteklenmiş fenol red ücretsiz MEM hücrelerde askıya alma (ısı-inaktive) kömür elimden FBS, 2 mM L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin çözüm.
      Not: Kömür elimden FBS serum kaynaklı endojen östrojen etkisini azaltmak için kullanılmalıdır.
    5. Hücre sayısı ve yoğunluğu 1.2 x 105 hücreleri/iyi bir 24-şey plaka hücrelerde tohum. Üç kuyular (onaylatılacak) her veri noktası için atayın.
    6. Hücreleri gecede kültür. 2.4.1 adıma devam edin.
  3. Bir DNA karışımı transfection için hazır olun.
    Not: Aşağıdaki plazmid DNA'lar transfected bir kuyuda: 100 pG5-Luc muhabir plazmid, 50 ng ng GAL4DBD füzyon protein (pBIND) için ifade plazmid ve 50 ifade plazmid VP16AD füzyon protein (anlaşma) için ng.
    1. Ligand-bağımlı ERα yakın dimerization etkinliğini çözümlemeye, aşağıdaki kombinasyonları (Şekil 3) hazırlayın. Kombinasyon (ı): pG5-Luc pBIND-hERαEF + Paktı ve pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Paktı. Kombinasyon (II): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + Paktı-hERαEF ve pG5-Luc + Paktı-mERαEF pBIND-mERαEF. Kombinasyon (III): pG5-Luc + pBIND + Paktı-hERαEF ve pG5-Luc + pBIND + Paktı-mERαEF.
      Not: Kombinasyon (i) insan ERα yakın ve fare ERα yakın, bazal deneysel düzeyde sırasıyla temsil eder. Sonuç ligand ile son derece yüksek bir düzeyde yalnız gösteriyorsa, bu olanaksız bu ligand (Örneğin, dietilstilbestrol [DES]) ile kullanmak için bir yöntemdir. Kombinasyon (II) dimerized insan ERα yakın ve dimerized fare ERα yakın, düzeyleri sırasıyla temsil eder. Kombinasyon (III) negatif denetimlerinizi temsil eden; sadece deneme sistemi arka plan düzeyini değerlendirmek ilk kez gerçekleştirildiğinde bu seti kullanın.
    2. Karıştırma önce toplam hesaplamak transfection için kuyu sayısı dayalı gerekli DNA miktarı. Triplicates ve beş veri noktalarında yapılan deneylerde, iki 1,5 µL tüpler kombinasyonları (i) ve (II) için aşağıdaki plazmid DNA'lar karıştırmak: pG5-Luc, 5 (veri noktaları) 3 (kuyu) x 100 ng x 1500 = ng (15 µL); pBIND-mERαEF, 5 (veri noktaları) 3 (kuyu) x 50 ng x 750 = ng (7,5 µL); Paktı (kombinasyon i) veya Paktı-mERαEF (için kombinasyon II), 5 (veri noktaları) 3 (kuyu) x 50 ng x 750 = ng (7,5 µL).
      Not: Her plazmid DNA çözüm 0.1 µg/µL bölgedir.
    3. Etanol yağış tekniği kullanarak DNA karışımı çökelti. 1/9 3 M sodyum asetat (pH 5.5) DNA karışımı hacminin ekleyin ve 20 x 3M sodyum asetat hacminin % 100 etanol DNA karışımı için. O zaman, girdap tüp.
      Not: Örneğin, 3 M sodyum asetat 3.4 µL ve 34 µL % 100 etanol 30 µL adım 2.3.2 örneği plazmid DNA karışımı ekleyin. Bu adım bir değişmez transfection durumu tutmaya yardımcı olur ve biyolojik emanet dolabı bu adımı gerçekleştirmek gerekli değildir.
    4. Karışımı bir gecede-20 ° C'de tutmak 4 ° C'de 20 dk için maksimum hızda santrifüj kapasitesi (Pelet görünmez) çözüm atın. 120 µL % 75 etanol tüp ekleyin; o zaman, tüp içine durulayın. 4 ° C'de 20 dk santrifüj Çözüm atmak ve vakum yoğunlaştırıcı için 30 dk kullanarak DNA karışımı kurumasını bekleyin.
  4. Transfection gerçekleştirin.
    Not: Aşağıdaki adımları temiz bir Bank ya da biyolojik Emanet kabine içinde gerçekleştirilmelidir.
    1. Ertesi sabah, bir 24-şey plaka (Kimden adım 2.2.6) numaralı seribaşı hücreleri durulama 2 x 0.5 mL PBS (Oda sıcaklığında) ile.
    2. Taze fenol red ücretsiz MEM % 10 ile desteklenmiş sıcak (37 ° C) kömür-(ısı-inaktive) FBS ve her şey (0.5 mL orta/de) antibiyotiklere olmadan 2 mM L-glutamin elimden ekleyin. Hücreleri bir % 5 CO2' deki tutmak-desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.
    3. Kurutulmuş plazmid DNA karışımı (Kimden adım 2.3.4) Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) (hiçbir serum, fenol red içermeyen, glutamin; 13 µL/iyi) askıya alma. DMEM kuyu transfection için dizi tutarlarını hesaplamak.
      Not: 15 wells (i) x 13 µL birleşimi için 195 µL ve (ii) x 13 µL birleşimi için 15 wells = 195 µL =.
    4. Transfection reaktif askıya alma ( Tablo reçetesi; görmek 1,5 µL/iyi) DMEM içinde (12.5 µL/de) başka bir 1,5 mL tüp içinde. Transfection reaktif ve kuyular için transfection dizi DMEM miktarlarını hesaplamak.
      Not: 30 [kombinasyon için 15 wells] (i) ve 15 kuyular için kombinasyon (II) transfection reaktif 1,5 µL + 30 x 12.5 µL DMEM, x 420 µL =.
    5. Her tüp (Kimden adım 2.4.3) transfection reaktif ortamına (Kimden adım 2.4.4) eşit miktarda ekleyin. Tüpler, oda sıcaklığında 5-10 dk için kuluçkaya.
      Not: 200 µL transfection reaktif orta + 195 µL birleşimi (i) DNA karışımı 395 µL ve 200 µL transfection reaktif orta + 195 µL birleşimi (II) DNA karışımı = 395 µL =. Bu kombinasyon (i) ve (ii) tüpler transfection reaktif orta eşit bir birim eklemek önemlidir. Bu adımda orta kullanmak gerekli değildir.
    6. Her kuyudan (25 µL/de) 24-şey plaka (adım 2.4.2) kombine karışıma (Kimden adım 2.4.5) ekleyin ve %5 CO26 h için hücreleri kuluçkaya-desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.
    7. Transfection orta 24-şey plaka kaldırın. Taze fenol red ücretsiz MEM takıma % 10 ile sıcak (37 ° C) kömür-mahrum (ısı-inaktive) FBS, 2 mM L-glutamin, % 1 penisilin-streptomisin çözüm ve ligand (etanol askıya) ekleyin (0.5 mL orta/de). 16-18 h % 5 CO2için hücreleri kültür-desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.
  5. Örnekleri hasat.
    1. PBS 1 mL hücrelerle durulama ve daha sonra 1 pasif lizis arabellek x 100 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).
    2. Şiddetle 24-şey plakaları hücreleri ayırmak için bir girdap mikser ile çalkalanır.
    3. Tabak (hücre lysates) dondurma analiz önce-80 ° C'de 1 x sıvı azot veya kaydedin. Oda sıcaklığında onlar kadar tahlil hemen önce tabakları bir shaker şiddetle çalkalanır.
      Not: Bu işlem düzensiz luciferase aktivitesinin anormal değerler görünmesini engeller.
  6. Bir çift-luciferase tahlil gerçekleştirin.
    1. Reaktifler çift-luciferase tahlil sistemi için hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek).
      1. Luciferase tahlil substrat (LAS) tampon yapmak için tüm luciferase tahlil arabellek cam kahverengi şişede olan luciferase tahlil substrat içine ekleyin. -20 ° C'de LAS arabelleğe kaydetme
        Not: Kullanmadan önce oda sıcaklığına LAS arabellek ısınma.
      2. Renilla luciferase substrat (RLS) tampon yapmak için Renilla luciferase substrat ve 1:50 oranında Renilla luciferase arabellek karıştırın. Taze HBS her tahlil için tampon ve siyah bir tüp veya folyo tarafından gölgeli bir tüp kullanmak olun. Taze bir arabellek yapma HBS arabellek miktarını hesaplamak.
        Not: HBS arabellek için oda sıcaklığında kullanmadan önce ısınma.
    2. Reaktifleri Mikroplaka Okuyucu ayarlayın.
      1. Yıkama enjeksiyon % 70 etanol ile 2 x hatlarını; sonra yıkama hatları 2 x su ile.
        Not: Bu tahlil sonuçları rahatsız edici önlemek önemlidir.
      2. LAS P-enjektör için arabellek kümesi satır (ilk enjeksiyon) ve HBS arabellek M-Enjektör hattı (ikinci enjeksiyon). Bu arabellekleri birlikte kullanmayın. HBS arabellek luciferase etkinliği engeller.
    3. 96-şey beyaz plastik levha (Kimden adım 2.5.3) hasat örnekleri 10 µL uygulanır.
    4. Aşağıdaki ayarları Mikroplaka Okuyucu için geçerlidir. P-enjektör için 50 µL, bir gecikme 2 hacmi kullanın s ve 50 µL/s hızında. M-enjektör için 50 µL, bir gecikme 2 hacmi kullanın s ve 50 µL/s hızında 15 s. kümesinin bir entegrasyon zaman sıcaklık 25 ° C'ye ayarla.
    5. Mikroplaka Okuyucu çalıştırın.
    6. Luciferase aktivitesi (IPValue) değerleri ve veri satın alma programı kullanarak Renilla luciferase etkinliğini (IMValue) değerlerini kaydedin (bkz. Tablo malzeme).
    7. Veri toplama sonra enjeksiyon hatları yıkama (bkz. Adım 2.6.2.1).
  7. Veri çözümlemesi gerçekleştirin.
    1. Normalleştirilmiş değerleri (IPValue/IMValue) veri analizi için kullanın.
    2. Araç (0 nM ligand) ile birlikte (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + Paktı] normalleştirilmiş değerini düzeyi bazal düzeyi ve ERα yakın homodimerized hesaplanması için 1 olarak ayarlayın. Düzeyleri "Göreceli etkinlik" olarak gösterilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 3 olası yanıtları düzeni kombinasyonu (i) ve kombinasyon (II) plazmid transfected hücreleri görüntüler. Deneysel sonuçları Şekil 4' te gösterilmiştir. Kombinasyon (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Paktı) faaliyet stimülasyon 10 tarafından gösteren nM E2 (Şekil 4A), ERα yakın ligand-bağımlı transactivation işlev etki alanı, AF-2 içerdiğinden. ERα yakın bağlar (Örneğin, E2) agonist transkripsiyon coactivator(s) AF-2 etki alanı için acemi. Bu olay VP16AD füzyon yakın ile etkileşimi olmadan transkripsiyon harekete geçirmek neden olur ve spesifik olmayan arka plan (Şekil 3C) nedeniyle yakın homodimerization etkinliğini değerlendirmek zordur. Kombinasyon (II) (pBIND-mERαEF + Paktı-mERαEF pG5-Luc) aktivite 1 ile gözlenmiştir nM ve 10 nM E2 tedavi (Şekil 4A). Bu kombinasyon (II) faaliyet birleşimi (i) ezelî harekete geçirmek saptamak için uygun ligand konsantrasyonu bulduysanız agonist bağımlı ERα yakın homodimerization etkinliğini belirlemek mümkün (Örn., Koşul 1 nM E2 Şekil 4A). Böylece, M2H tahlil kullanarak agonist-aracılı ERα yakın homodimerization etkinliğini tespit etmek zordur. Öte yandan, (i) ile 4OHT birlikte faaliyet araç kontrol olduğu gibi (0 nM) düzeyi (Şekil 4B). Bu sonuç ERα AF-2 fonksiyonu 4OHT tarafından etkinleştirilmemesini öneririz. Böylece, M2H tahlil ERα yakın homodimerization aktivite 4OHT ile analiz etmek için uygun bir seçenektir (Şekil 3B, 3E).

Fare ERα yakın ifade plazmid (pBIND-mERαEF + Paktı-mERαEF) 4OHT ile kombinasyonu aktivitesinden insan ERα yakın ifade plazmid (pBIND-hERαEF + Paktı-hERαEF) ile birlikte önemli ölçüde daha yüksek (Şekil 5A, 5B). Bu sonuç fare ERα yakın 4OHT bağlı homodimerization etkinliği daha güçlü insan ERα yakın olduğunu gösterir. Ayrıca, insan-fare F etki alanı takas ERα yakın ifade plazmidler, mERαEhF (fare ERα E etki alanı insan F etki alanı ile) ve hERαEmF (insan ERα E etki alanı ile fare F etki alanı) kullanarak 4OHT bağımlı yakın homodimerization etkinliğini analiz ettik. MERαEhF homodimerization etkinliğini önemli ölçüde mERαEF daha düşük. Buna ek olarak, hERαEmF homodimerization faaliyet hERαEF (Şekil 5C) anlamlı olarak daha yüksek. Böylece, F etki alanı species-specific 4OHT bağlı ERα yakın homodimerization aktivite üzerinde büyük etkisi var gibi görünüyor.

Bu sonuçlar SERMs gibi 4OHT benzeri ligandlar ERα yakın dimerization faaliyet M2H tahlil tarafından algılanabilir öneririz. Sonra biz ERα yakın homodimerization aktivite agonistik kimyasal analiz için olası bir yol göstermek. ERα yakın dimerization faaliyetlerinin E2 ve dietilstilbestrol (DES) tarafından M2H tahlil bir tek-amino-asit-mutasyona ERα yakın (fare ERα-I362D) kullanırken tespit edilebilir. Bu mutasyon E2 bağımlı coactivator işe alım faaliyet ERα yakın8bozar. Kombinasyon (i) (pG5-Luc + pBIND-mERα-I362D + Paktı) değil harekete geçirmek tarafından E2 ne de herhangi bir konsantrasyon DES (Şekil 6B), hangi WT ERα yakın (Şekil 6A) farklı analiz ettik. ERα-I362D yakın dimerization aktivite des E2 daha güçlü (Şekil 6B). Bu mutant agonist bağımlı ERα yakın dimerization aktivite karşılaştırmalı bir çalışma için kullanılabilir; Ancak, daha fazla çözümleme ve bu mutant ERα biyolojik işlevselliğini karakterizasyonu gerektirir.

Figure 1
Resim 1 : Plazmid M2H tahlil için kullanılan diyagram. (A) Bu paneli gösterir pG5-Luc, içeren gen kodlama bir luciferase ile erimiş GAL4 duyarlı bir öğe (GAL4 RE) muhabir plazmid. (B) Bu panel pBIND-mERαEF, GAL4DBD füzyon mERαEF protein ifade plazmid gösterir; Renilla luciferase transfection verimliliği normalleştirme için çalışır. (C) Bu panel gösterir Paktı-mERαEF, protein ifade plazmid nükleer yerelleştirme sinyal (NLS) için-VP16AD füzyon mERαEF erimiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Bu deneyde kullanılan ERα yakın ifade plazmid diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : M2H tahlil düzeninin. Bu rakam kombinasyonu (i) plazmid (solda) hücreleri durumunu transfected ve hücreleri (sağda) kombinasyonu (II) Plasmid'ler ile transfected temsilcisi gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Ligand-bağımlı dimerization faaliyet fare ERα yakın. Hücrelerin luciferase aktivite ile kombinasyon (i) plazmid (pG5-Luc + Paktı + pBIND-mERαEF) ya da kombinasyon (II) plazmid (pG5-Luc + Paktı-mERαEF + pBIND-mERαEF) veya E2 olmadan transfected (A) Bu panel gösterir. (B) Bu panel ile kombinasyon (i) plazmid ya da kombinasyon (II) plazmidleri veya 4OHT olmadan transfected hücre luciferase faaliyet gösterir. Faaliyete ortalama temsil edilir ± standart sapma (SD). Grafiğin Masası'a A daha önce yayımlanmış veri11' den yeniden oluşturuldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Fare ve insan ERα yakın 4OHT ile fark dimerization faaliyeti. (A) Bu panel gösterir hücrelerin luciferase faaliyet transfected kombinasyonu ile fare ERα yakın ifade plazmid (Paktı-mERαEF + pBIND-mERαEF) veya insan ERα yakın ifade plazmid (Paktı-hERαEF + pBIND-hERαEF) kombinasyonu ile veya 4OHT. (B) düşük aktivite Masası'a A dizi insan ERα yakın ve deneysel bazal düzeyleri (Paktı + pBIND-mERαEF, Paktı + pBIND-hERαEF) dimerization etkinliğini gösteren büyütülmüş olduğunu. (C) Bu panel fare-insan F etki alanı takas yakın ifade Plasmid'ler ile transfected hücre luciferase faaliyet gösterir. mERαEhF fare ERα E gösterir etki alanı insan F etki alanı ile erimiş. hERαEmF insan ERα E etki alanı fare ile erimiş F etki gösterir. Faaliyet ortalama ± SD gösterilir Grafikler daha önce yayımlanmış veri1' den yeniden oluşturdum. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Agonist-aracılı ERα yakın dimerization etkinliği bir AF-2 kullanarak tespiti mutasyona ERα yakın. Kombinasyon (i) plazmid (pG5-Luc + Paktı + pBIND-mERαEF) ya da kombinasyon (II) plazmid (pG5-Luc + Paktı-mERαEF + pBIND-mERαEF) ile ya da ezelî ligandlar hücrelerin luciferase faaliyet transfected (A) Bu panel gösterir; E2 (kırmızı), DES (mor). (B) Bu panel ile birlikte (i) plazmid (pG5-Luc + Paktı + pBIND-mERα-I362D) ya da kombinasyon (II) plazmid (pG5-Luc + Paktı-mERα-I362D + pBIND-mERα-I362D) ile ya da ezelî ligandlar transfected hücre luciferase faaliyet gösterir; E2 (kırmızı), DES (mor). Faaliyet ortalama ± SD gösterilir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada, ERα yakın homodimerization aktivite örnek olarak algılamak için tahlil koşullar odaklanan M2H tahlil için protokol açıkladığımız. Genel olarak, M2H tahlil ligand-bağımlı ERα yakın dimerization etkinlik değerlendirmesi için popüler değil. Bu ERα bir transkripsiyon etkinleştirme işlev sahip yakın nedeniyle. Hangi etkinlik rahatsız ediyor, bazı durumlarda, M2H tahlil sonuçları. Biz burada göstermek gibi ancak, M2H tahlil yakın (Örneğin, 4OHT, SERMs) AF-2 transactivation işlevi etkinleştirmezseniz belirli maddelerin yakın dimerization etkinliğini analiz etmek için kullanılabilir. YAKIN (arka plan etkinliği) iç etkinliğini azaltmak için en düşük fiyat E2 içeren kömür elimden FBS üretim çok seçilen ve kömür elimden FBS ısı inaktive kullanılır. Bu faktörler WT ERα yakın kullanarak M2H tahlil ve zayıf etkileşim bir etkinlik tespit başarısı için önemlidir. Buna ek olarak, biz ERα yakın agonistler (E2 ve DES) dimerization faaliyet gösterdi AF-2 agonist bağımlı coactivator işe alım faaliyete bozan mERα-I362D mutant kullanarak. Bu sonuç M2H tahlil ligand-bağımlı ERα yakın dimerization etkinlik değerlendirmesi için daha yararlı olabilir öneririz.

NR araştırma alanında M2H tahlil ligand-bağımlı coactivator değerlendirilmesi veya NR LBDs9,10corepressor işe alım faaliyeti için kullanılmıştır. Kofaktör NR etkileşen bölgesiyle erimiş pBIND plazmid deney pBIND ERαEF kullanmak yerine bu tür için kullanılır. Bu deney motifi (LxxLL) etkileşim NR içeren kısa protein öğeye bir daha büyük yapısal coactivator yerine kullanır. Bir ihtimal daha büyük coactivator öğesi transkripsiyon VP16AD füzyon yakın alımı olmadan etkinleştirebilirsiniz; Bu M2H tahlil sonuçlarından rahatsız. Alternatif olarak, bu iletişim kuralını ERα maddelere çeşitli bağlama etkinliği analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, hücreleri pG5-Luc, NR etkileşen motifi pBIND erimiş ve Paktı-ERαEF Plasmid'ler ile transfected ve daha sonra endokrin engellemeden kimyasallar veya potansiyel hormonal tedavi gibi çeşitli kimyasallar ile tedavi. O zaman luciferase etkinliği bir kimyasal bu tahlil tarafından arttırılırsa, kimyasal ERα NR etkileşen motif8işe yakın ile etkileşim öngörülmektedir.

M2H tahlil memeli hücrelerinde protein-protein etkileşimleri gösterir. Girişbölümünde belirtildiği gibi protein-protein etkileşimleri fizyolojik rolü bir hücre türüne özgü içeriği farklı olabilir. M2H deneyleri transkripsiyon etkinlik analizi gibi diğer deneyler için kullanılan aynı hücresel bağlamında protein-protein etkileşim aktivitesinin sonuçlar sağlayabilir. Ayrıca, hücre sinyallemesi modülatörler (Örneğin, inhibitörleri veya aktivatörler kinaz) hücrelerdeki protein-protein etkileşimleri ile ilgili etkisini çözümleyebilirsiniz. Bu diğer vitro protein-protein etkileşim çalışmaları karşılaştırıldığında M2H tahlil bir avantajdır.

Ancak, protein-protein etkileşimler yoluyla M2H tahlil iki protein arasında doğrudan bir etkileşim gösterebilir değil tespit dikkate alınması gerekir. Başka bir deyişle, iki protein arasındaki bağlantı sağlayan hücresel factor(s) var olduğunu olasılığı vardır. Böyle bir göz herhangi bir anlaşmazlık durumunda, vitro protein-protein etkileşim çalışmaları değerlendirilmesi GST-füzyon protein açılan tahlil gibi gerekli olmalıdır. Buna ek olarak, ifade tahlil sistem performansını değerlendirmek için hücrelerdeki pBIND ve Paktı-plazmid-kaynaklı proteinlerin kontrol etmek daha iyidir. Özellikle etkileşim etkinlik tespit edilemez zaman protein ifade düzeyleri bilgiler sonucu nedenini belirlemek için yardımcı olur. Anti-Gal4DBD antikor ve anti-VP16AD antikor bir western blot analizi için kullanılabilir.

Laboratuvar düzenleyici elemanlarının transkripsiyon faaliyetini çözümleme veya düzenleyen faktörler için kullanılabilir, luciferase muhabir deneyleri için deneysel set-up varsa M2H tahlil yapmak oldukça basittir. M2H tahlil transkripsiyon Yönetmelik çalışmaları için avantajlı bir katkı yöntemidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar Drs. Sueyoshi ve Wang, Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) için el yazması ve Tanner Jefferson okuma kritik videoda yordamları gerçekleştirmek için teşekkür ederiz. Bu eser (adı için) Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 1ZIAES070065 NIEHS, Intramural araştırma bölümü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293, (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389, (6652), 753-758 (1997).
  3. Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95, (7), 927-937 (1998).
  4. Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295, (1-2), 94-100 (2008).
  5. Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9, (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).
  6. Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21, (4), 829-842 (2011).
  7. Mitry, R. R., Hughes, R. D. Human Cell Culture Protocols. Humana Press. (2011).
  8. Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290, (28), 17611-17627 (2015).
  9. Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16, (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).
  10. Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19, (12), 8226-8239 (1999).
  11. Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288, (29), 21105-21116 (2013).
Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).More

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter