Summary
住民の免疫細胞、脳の小膠細胞, は、形態学的変化と彼らの環境の変更に迅速に対応します。このプロトコルでは、2 光子励起顕微鏡を使用して、マウスの急性脳スライスにおけるセロトニンや ATP に向かってミクログリア プロセスの魅力を研究する方法について説明します。
Abstract
ミクログリア細胞は常駐自然免疫系細胞、脳の常に長いプロセスの環境をスキャンし、恒常性の中断時に急激な形態学的変化を受けます。たとえば、レーザー病変は、数分で、傷害の現場に向かって「方向運動」とも呼ばれるミクログリア プロセスの配向成長を誘発します。ATP またはセロトニン (5-ヒドロキシトリプタミン [5-HT]) ローカルで提供することにより同様の効果が得られます。この資料では、ATP や若くて大人のマウスの急性脳スライスにおける 5 HT のローカル アプリケーションに向けたミクログリア プロセスの一方向成長を誘引し、多光子顕微鏡による時間の経過とともにこの魅力をイメージするプロトコルについて述べる.無料とオープン ソースの画像解析ソフトウェアと定量化の手法を提案する.まだ急性期脳スライスを特徴付けるチャレンジは限られた時間の中にセルの生理学的状態のまま、年齢とともに減少します。このプロトコル、したがって、大人のマウスからスライスを中心に、数時間にわたってミクログリア細胞の生存率を最適化することを目的としたいくつかの技術的な改善 (媒体、空気液体インターフェイス室、ダブル灌室をイメージング) ハイライト。
Introduction
ミクログリア細胞は脳のマクロファージ、両方生理学的および病理学的条件1,2の役割を果たします。彼ら高分岐形態し常に拡張され、そのプロセス3,4を取り消します。この「スキャニング」現象は関連とその周辺調査必要と思われます。ミクログリアの形態的可塑性は、3 つのモードで表現されます。最初に、いくつかの化合物は急速に調節するミクログリアの形態: ATP5,6または NMDA5,7急性脳スライスを入浴中のまたミクログリア影響の複雑さが増大一方、ノルエピネフリンはそれに6を減少させます。これらの効果は、直接 (ATP のノルエピネフリン) ミクログリアの受容器によって仲介されるか、(NMDA) の神経細胞からの ATP 放出を必要とします。第二に、運動や「監視」と呼ばれる、ミクログリアのプロセスの成長と後退速度は細胞外要因8恒常性混乱9,10、または突然変異9、によって影響を受けます 10,11。第三に、形態と運動のこれらの等方性の変更に加えてミクログリアは ATP3,5,12,を提供するピペットの方向に向かってそのプロセスを拡張する能力を持っています。13,14、文化、急性脳スライスまたは急性脳内 5-HT の生体内で、または提供する15 をスライスします。このような配向成長方向運動とも呼ばれるミクログリア プロセスの最初ローカル レーザー病変3,4への応答として記述されていた。したがって、生理学的、それが傷害に応答に関連またはシナプスに向かってミクログリア プロセスをターゲットに必要なまたは開発15,16中、または生理学的な17 に剪定を必要とする脳の領域 ,18,19 , 病理学的状況9,18,19,20成人。形態学的変化の 3 つのタイプはさまざまな細胞内メカニズム11,13、20に依存し、1 つの特定の化合物は必ずしもすべてのそれら (例えば、NMDA、ない直接に作用を調節しません。ミクログリア、形態に及ぼす影響が方向運動5,7を誘発しない)。したがって、ミクログリアに及ぼす化合物、突然変異または病理学の特徴を目指している、その形態的可塑性の 3 つのコンポーネントの特性評価に重要です。ここでは、ミクログリアのプロセスは、ここで、化合物のローカル源、ATP または 5 HT への一方向の成長を調査する手法について述べる.
ミクログリアのプロセスの魅力を研究するいくつかのモデルがあります: 3 D 環境6,18,19, 急性期脳スライス6,13,15、及び生体内で初代培養3,13をイメージングします。生体内でのアプローチがミクログリアの生理状態を維持するために最適です。ただし、深い領域の生体イメージングは、複雑な手術を必要とし、したがって、皮質表層に限られます。ミクログリア培養の使用は、多数の動物の限られた数の条件をテストする最も簡単な手法です。それにもかかわらず、それは生体のように同じ細胞の形態を得ることが可能ではなく、細胞はニューロンとアストロ サイトの生理学的な相互作用を失います。急性脳スライスは、これらの 2 つのアプローチ間の妥協を表します。このモデルに到達するために生体内で、高解像度の画像と新生児の段階からスライスを調査するが難しいがそれ以外の場合経頭蓋顕微鏡はほとんど成人で行われます、脳の構造の研究に研究できます。最後に、薬剤の局所適用の効果をリアルタイムで観察して動物の限られた数を使用しながら実験を繰り返す可能となります。それにもかかわらず、急性脳スライスの問題は限られた時間 (数時間) 中にセルのまま生きている、特に 2 週間やミクログリアの形態の潜在的な変更よりも古いマウスからスライス時間21,22 以上.
ここでは、若者や大人 Cx3cr1 の急性脳スライスを準備するためのプロトコルについて述べるGFP/+マウス 2 ヶ月古い、ミクログリアの形態や運動のいくつかの時間のための保全と。我々 は、その後、これらのスライスを使用して ATP または 5 HT のような化合物に向けたミクログリア プロセスの魅力を研究する方法をについて説明します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての実験は、ローカル倫理委員会で承認された (ダーウィン委員会、契約 #1170 と #10921)。
1. 化合物のローカル アプリケーション用ガラス マイクロ ピペットの準備
- 薄肉・ ガラス管電極引き手とホウケイ酸塩からピペットを準備します。四肢の運動で 4-5 μ m 径のピペットを取得するパラメーターを調整します。図 2 Dは、低倍率で明視野で 1 つピペットを示しています。
2. ソリューション
- オートクレーブ サイクルによって掃除されているその唯一の硝子を確保するため、すすぎ 2 x - 続いて超純水、3 x が使用されます。パラホルムアルデヒドと接触されているガラスを決して使用。
-
2 mol· を準備します。L-1 CaCl2·2H の2O 高純度の水 50 mL で 14.7 mg を溶解して CaCl2原液 (超純水、抵抗 18.2 MΩ; 蒸留水や水道水の金属のトレース品質最適なスライスにつながることができますプロ酸化作用)。
- この原液常温 1 ヶ月の最大値を格納します。
-
実験の日、その組成は 110 mmol· コリン アプライド (人工髄液) ソリューションの 1 L を準備します。L-1コリン Cl、25 mmol·L-1グルコース、25 mmol·L-1 NaHCO3、7 mmol·L-1 MgCl2、11.6 mmol·L-1アスコルビン酸、3.1 mmol·ピルビン酸ナトリウム-1 L、2.5 mmol·L-1 KCl、1.25 mmol·L-1 NaH2PO4と 0.5 mmol·L-1 CaCl20.5。
- 準備するこのソリューションに追加、卒業 1 L フラスコに、次の順序で: グルコースの 4.5 g、NaHCO3、2.1 g 酸アスコルビンの 2.04 g NaH2PO4の 0.195 g KCl の 0.186 g。
- 純水で最終巻の約半分を記入し、完全な解散になるまでかき混ぜます。
- ピルビン酸ナトリウムとコリン Cl 15.36 g 0.34 g を追加します。
注: 最初のディゾルブ全体のソリューションにそれを追加する前に手順 2.3.2 では、溶液の 5 ~ 10 mL で Cl コリンに便利です。 - 1 mol· 7 mL を加えるL-1 MgCl2と 2 mol· の 250 μ LL-1 CaCl2 (手順 2.2 で準備) ソリューション。
- 純水で 1 L まで卒業のフラスコを埋めます。
- 蒸気圧 osmometer と 300 と 310 mΩ 間浸透圧であることを確認します。ない場合は、血糖値を調整します。
- Carbogenation (すなわち、「カーボゲン ・」に沸き立って、95% O25 CO2のミックス) 後 pH を確認し 10 M NaOH で 7.3 7.4 に、必要に応じてそれを調整します。
- ソリューションを保存用のガラス瓶に転送します。(ステップ 3.1) に使用されるまで冷蔵庫の中にボトルを維持します。
注:実験の日に新鮮なソリューションを作成することをお勧めします。ただし、必要に応じて、コリン アプライドに格納できる 4 ° C で 2 日に
-
実験の日、その組成は 124 mmol· アプライド ソリューションの 1 L を準備します。L-1 NaCl、26.2 mmol·L-1 NaHCO3、25 mmol·L-1グルコース、2.5 mmol·L-1 KCl、2 mmol·L-1 CaCl2、1 mmol·L-1 MgCl2、および 1.25 mmol·L-1 NaH2PO4。
- 準備するこのソリューションに追加、卒業のフラスコに、次の順序で: 7.3 g の塩化ナトリウム、ブドウ糖、4.5 g NaHCO32.2 g KCl の 0.186 g NaH2PO40.150 g。純水で 1 L のボリュームにソリューションをもたらすと撹拌プレートに混ぜ。
- 1 mol· の 1 つの mL を追加します。L-1 MgCl2と 2 mol· 1 mLL-1 CaCl2ソリューション、ストレージ用のガラス瓶への転送アプライド ソリューション。
- 浸透圧が 300 310 mΩ· であるかどうかを確認してください。L-1そうでない場合はグルコースでそれを調整します。
- Carbogenation 後、pH をチェック (すなわち、「カーボゲン ・」とバブル) と 10 M NaOH で 7.3 7.4 に、必要に応じて、それを調整。
- ソリューションを保存用のガラス瓶に転送します。(ステップ 3.1) に使用されるまで冷蔵庫の中にボトルを維持します。
注:実験の日に新鮮なソリューションを作成することをお勧めします。しかし、代わりに、ストック溶液塩化ナトリウム、NaHCO3KCl、NaH2PO4 4 ° C で 1 週間以上保存することができます最終的な濃度 x 10 x 10 を準備するには純水を 10 倍原液を希釈してグルコース、CaCl2MgCl2を追加実験の日に最終的なアプライドを作る。
- 実験日医薬ソリューションを準備します。最終濃度は、ここでは、500 µmol· をさせるアプライド ソリューションを使用します。ATP と 5 µmol· L-1L-1 5 HT。
注:ATP の貯蔵液を準備すること (例えば、50 mM 水の ATP)、-20 ° C で検体のフォームに格納され、実験の日に最終濃度にアプライドで希釈します。対照的に、5-HT (セロトニン HCl) ソリューションする必要があります準備粉から 1 mg·mL-1水の中で、実験の日に、5 HT の酸化を避けるために 4 ° C で保管し、実験の時にアプライドで希釈しました。
3. 急性脳スライスの準備
-
郭清範囲の準備
- 心臓血流、脳の急速な冷却とスライスに使用する氷は、80 mL のビーカーに冷たいコリン アプライドの 70 mL を準備します。コリン-アプライド結晶皿、32 ° C で維持される温水のお風呂は、200 mL で 150 mL を準備します。スライスを保持する結晶皿にナイロン メッシュのストレーナを配置します。これは、スライス スライス直後後 10 分の回復に使用されます。
- (セクション 3.2)、郭清を開始する前に、少なくとも 30 分は、カーボゲン ・と 2 つのソリューション (氷上コリン アプライドの 70 mL) と 150 mL 32 ° C でコリン アプライドのバブルを開始します。全体の手順中に定数 carbogenation を維持します。
- その使用までスライスを保つために使用されるインターフェイス商工会議所デバイス (図 1) を準備します。
- 磁性攪拌器にインストールされている密封された食品ボックス (10 × 10 cm、高さ 8 cm、直径 10 cm) で位置にバーが付いている皿を結晶 200 mL マグネット。
- この結晶皿にアプライドの 200 mL を追加し、(インターフェイス スライス ホルダーは、図 1 a B間延伸ポリアミド メッシュに 2 つの完全に継ぎ手部分、) それの上に 3 D プリント インターフェイス スライス ホルダーを配置します。
- インターフェイス スライス ホルダーのメッシュ カバーの薄膜のみを維持する結晶皿から余分なボリュームを削除します。これは後で (しかしそれらをカバーすることがなく) スライスを取り巻くソリューションの良い縁が作成されます。
- フード ボックスの下部にアプライドの数ミリを入れて、カーボゲン ・でバブリングを開始 (最初の使用時に小さな穴チューブ ボックスを入力することができますように密封された食品ボックス壁)。
- 定数 carbogenation を維持しながら密閉ボックスを閉じます。加湿 95% O25% CO2豊かな環境、スライスはコリン アプライドで回復した後に転送されが作成されます前に維持されますが作成されます。このデバイスは、「インターフェイスの部屋」として以下が (図 1)。
-
脳解剖とスライス
- 50 mg·mL-1ペントバルビ タール (マウス体重 0.15 mL/20 g) の腹腔内注入マウスを麻酔、それを固定、心を公開、冷たいの 10 mL で心筋灌流を実行 carbogenated、コリン アプライド (手順を参照してください。3.1.1) 蠕動性ポンプで。良い血流の指標として肝の青白さを観察します。灌流は、5 分以内を持続させます。
- マウスの首をはねるし、頭蓋骨を公開する皮膚をカットします。大きなハサミには、大孔と 1 つの長い矢状切口から 2 つ横のカットを適用し、スカル プレート微細鉗子を使用して、削除します。
- 迅速かつ優しく (1 分以内) の脳を抽出し、それを冷却するために、残り (〜 60 mL) 冷たいコリン-アプライド (まだ下で定数 carbogenation) を含む 80 mL ビーカーで 1 分の場所します。
- アプライドで以前ウェット フィルター紙の上に脳に転送します。
- 興味の脳の領域とスライスの設定角度によると脳を切り取る。たとえば、視床や辺縁系の海馬をイメージするカット、メスの刃、小脳と、その後、脳の吻側と尾側の四肢から mm 2 について。
注:吻側またはあまりにも尾にある脳の部分を削除することが重要ですので、関心のある領域に到達する前にトリムするより小さい地域高速スライスします。スライス (3.2.7) のステップ 20 分以内の所要時間をお勧めします。 - コロナのスライスの位置し振動スライサーの切断ブロックの接着 10 cm シャーレに脳の尾の顔 (シアノアクリ レート系接着剤) で接着剤し、貯水池商工会議所より大きい商工会議所に配置される振動のスライサーの位置氷で満ちています。次に、すべて、残り冷たいコリン-アプライドでペトリ皿を記入します。
- 95% O25% CO2を一定維持しながら冷たいコリン-アプライドのバブル 300 μ m の厚さにコロナ スライスをカット (速度: 0.08 mm·s-1, 翼振動: 振動振幅 60 Hz: 1 mm)。
- 広口 (直径 4 mm) 使い捨て転送と脳スライスのピペット収集、スライスの周囲が発表した有害成分の蓄積を避けるために、ブレードのすべての単一パスの後一人ずつ。世話を転送中に空気の泡を避けるために、約 10 分間の回復のための 32 ° C でコリン アプライドで各スライスを配置します。
- 転送ピペットとレンズ クリーニングの部分にスライスを配置紙コリン アプライドのドロップをトッピングします。コリン アプライドの過剰を吸引、ヘラとの室温で carbogenated アプライドを含むインターフェイス チャンバーのメッシュで、レンズ クリーニング ティッシュの上に置いたスライスを配置 (3.1.3.5 を参照)。スライスは、少なくとも 30 分間、この環境で回復をしましょう。
注:この後、スライスは準備ができているし、生後 2 ヶ月の大人からの脳抽出後ミクログリア 6 h まで若いから脳の抽出後のイメージング (より小さい 1 ヶ) マウスと 4 h まで使用できます。
4. 2 光子顕微鏡
- パラメーターの設定
- 多光子システム (ハイブリッド検出器、レーザー、スキャナー、電気光学変調器、顕微鏡) に切り替えます。
- 920 でレーザーを調整 nm、レーザー モード ロックは、電力を 5%-15% と 10% でゲイン設定とチェック。これは目的の下で 3-5 mW の力に対応します。Nondescanned 探知機を従事している適切な発光と励起フィルターがインストールされていることを確認します。
- 次の値には、イメージング ソフトウェアのパラメーターを設定: フレームのサイズは、1024 x 1024 ピクセル 295.07 μ m x 295.07 の領域に対応します。ズーム、2。信号に非常にノイズが多い場合は、2 ラインの平均値を適用します。ピクセル ダイナミクスの 12 ビット以上では、イメージング ソフトウェアを設定します。
注:ビット価値の高い画像が低いビット値を持つイメージよりも蛍光強度の小さい相違を区別するために研究者を許可する: 8 ビット イメージのグレー値が 256 のグレーの 12 ビットの 16 の灰色の値の変更に対応する 1 つの変更の値私n 16 ビット イメージ。したがって、高ビット画像は定量分析に適していますが、制限のサイズも拡大ビット深度、ストレージ容量、およびコンピューティング電力がなることができます。 - スキャン モード XYZT 2 μ m と 2 分の T 間隔で Z 間隔の範囲を選択します。
注:X、y および z の解像度は、ナイキストのサンプリング定理によって決まります。約 0.8 Z ステップ サイズはミクログリアのプロセスを解決するが最適だろう (直径の < 1 μ m)、多光子顕微鏡の光学解像度を制限することが、(920 で 0.95 NA 目的 nm、軸の分解能は 1 μ m 周辺)。その上で物理的な障壁、ライブ イメージング実験、感度解析スタディまたは信号対雑音比、解像度、速度、および全観測時間の問題で。これらのパラメーターはすべて、(多数研究3,11,14) のように 2 μ m、1024 x 1024 ピクセルのイメージ サイズ、HyD 探知器 (それに結合共振型スキャナーを使用してください。 高速集録の z ステップを考慮してください。約 15 を取る 50 z 計画を取得する s) ここに選ばれました。買収の頻度 1 つ XYZT シリーズ 2 分ごと、所要時間は 30 分です。場合セットアップは、高速または十分な区別には、水平解像度 (512 x 512) または z スライスの数を減らすことが可能だ (最も強い蛍光性を表わす z 深度における排他的イメージングを用いた [すなわち、ない深い z スライス、蛍光、かすかな]) またはスキャナーの速度が低下します。軸方向の解像度は、3 μ m まで z ステップを増やすことによって減らすことができますが、比較するすべての実験が同じ z ステップと実行が必要と定量化に影響を与える可能性があります。
注:CX3CR1creER YFP マウス18、ミクログリアだけで遺伝子の欠失を誘発し、ミクログリアの恒常黄色い蛍光蛋白質 (YFP) を表現するために使用マウス線からスライスで同様の実験を行うことが可能です。ただし、YFP の発現レベルが非常に低い CX3CR1 における緑色蛍光タンパク質 (GFP) と比較してGFP/+マウス;したがって、イメージングは可能ですが困難なアクイジション ・ パラメーターの最適化が必要です。それらを次のように調整することをお勧めします。 - 970 でレーザーを調整 nm (YFP 励起 920 よりも優れている適応 nm)、50% で 5-6 mW を目的としてレーザー電源に対応する 50% の利得パワー。
- 信号対雑音比を改善するために 4 (またはそれ以上) のラインの平均値を設定します。
- ガラス マイクロ ピペットと化合物のローカル アプリケーションのスライスの位置決め
- 録音を開始する前に 30 分録音室に蠕動性ポンプを接続します。純水の 50 mL で全体の灌流システムを洗浄した後定数 carbogenation の下でガラス ビーカーに含まれるアプライド (50 mL) と録音室の灌流を開始します。実験を通して循環アプライドをインライン マイクロヒータとペルチェ ヒーター 32 ° C に保ちます。
注:上部と下部の血流を特定の灌流チェンバはスライスの両側に酸素化を最適化するために設計されています。灌流チェンバは 2 つの完全に継手部品、それら (図 2 a B) の間延伸ポリアミド メッシュで構成されます。スライスは直接ガラス基盤上に敷設されて、部屋の他のタイプと比較してこの室削減されスライスの下の部分に神経細胞死、生存率を向上させると膨潤によるスライスの動き。 - 広口使い捨て可能な移動のピペット レンズ ペーパーを削除、それが (空気の泡がアタッチされていない証拠) としてシンク、および記録 (血流) 室に転送するアプライド ビーカーにイメージングされる脳スライスを転送します。
- 灌流によるスライスの動きを最小限にスライス スライス ホルダー (並列ナイロン スレッドによって参加している 2 つの枝を持つプラチナ製ヘアピン) に配置します。
- 明視野照明を使用して興味の脳の領域をターゲットに (露出時間: 50 に 80 ms) 低倍率の目的 (5 X 10 X) を使用します。高倍率 (0.35 x レンズで 25 倍) 水浸対物レンズを切り替えるし、位置を調整します。
注:光を遮断でき、ローカル変形スライス スライス ホルダーのナイロン スレッドに近いイメージ フィールドに避けてください。関心のある領域はフラットであることを確認します。必要であればスライスの位置を変更するためにスライス ホルダー、スライス ホルダーを取り外します。 - 蛍光照明を使用して、フィールドにイメージを作成する蛍光ミクログリア細胞を見つけます (露出時間: 250-500 ms)。
注:この手順では、研究者の関心とその蛍光強度領域における細胞の存在を確認して細胞の残骸の量を制御することができます。 - ATP とバックフィル アプライドの 10 μ L をピペット 5-HT またはその最終濃度で興味の薬剤。下方の先端をポイントし、先端に閉じ込められている空気の泡を削除する薬物を充填ピペットを軽く振る。
注:注入するソリューションは気泡を形成する傾向がある場合、は、内部のフィラメントとホウケイ酸ピペットの使用を検討します。ピペットから ATP の漏れは注射の前にもミクログリア プロセスを引き付けることができる (このような場合、それは解析ステップで表示されます)。これは ATP の濃度と適当にする必要があります使用 (500 µmol·L-1)、問題は場合、は、ATP (または他の化合物) を追加する前にアプライドの 2 ml ピペットを設定しやすくなってすることを検討してくださいステップ 4.2.6 でソリューション。 - 5 mL の位置に配置されプランジャーと 5 mL の注射器に透明チューブを接続、ピペット ホルダーにいっぱいピペットをマウントします。ピペット ホルダー自体は三次元マイクロマニピュレーターにマウントされます。
- 明視野照明下でピペットをフィールドの中央に位置するのにマニピュレーターを使用します。再現性と最適な中心、表示し、画像を定規を使用します。
- 制御およびピペット チップまで、同時に目的を軽く調整するスライスの表面に触れて、スライスに向かって優しくピペットを下げなさい。スライス面の 80-100 μ m を貫通するピペット チップ スライスに触れたが表示されてすぐにピペットの降下を停止することができます (図 3B参照)。
- レーザーを調整 (上記のパラメーターを参照) と顕微鏡を多光子モードに切り替えます。商工会議所は任意の光源 (コンピューター画面など) から上映されていることを確認します。Nondescanned 検出器に切り替え、ゲインを設定します。色分けされた上限値とイメージのピクセルの飽和を避けるためにルックアップ テーブル (LUT) を使用します。
- イメージを作成するスライスの厚さを決定する (すなわち、上限と下限の z 位置蛍光は [合計 220 と 290 μ m] の間に通常検出)。
注:スライスの表面、密度増加プロセスのおそらくミクログリア、スライスの内側と比較しての異常な形態であります。この蓄積は、時間 (すなわち.、イメージを作成する最初の脳スライス内のより最後のほうが目立つ) とより顕著になります。したがって、まず 〜 30 μ m で z 平面解析には使用しないでください、買収についても省略できます。 - 30 分 (またはそれ以上必要な場合) の合計時間の録音を開始し、5 分ベースライン後ローカル (イメージングを妨げず) テストする化合物を適用します。これを行うには、マイクロ ピペット、1 mL の位置に 5 mL から接続シリンジのプランジャーを押してゆっくりと (約 5 秒)。プランジャーを押すときの抵抗を直に触れられる必要があります。されていない場合は、先端が壊れることがあります。
注:訓練を受けた実験者のこの方法で注射は再現できるが、また注射器の手動操作、するに、ピペットを配信量のよりよい制御を許可する自動圧力放出システムにリンクする可能性があります。注入は、注入のサイトでスライスの物理的な歪みを作成します。この歪みが表示される最初の 2 つまたは 3 つの事後注入後画像しますが、ない (すなわち、注入後 8 分)、4 番目の画像上に表示する必要があります。それが解決しない場合は、ピペットの準備のためのパラメーターを変更してみます。 - 取得 (30 分) の終わりに、マイクロ ピペットを破棄し、スライスを削除します。必要な場合は、さらに反応のスライスを修正します。たとえば、スナップショット メソッドの最適化を固定用、23のスライス厚の染色します。
- 新しいスライスをイメージ、そのミクログリアをチェックするために (セクション 5.1) の 2 D の映画を作る起動する前に通常形態と動いているため、スライスが正常であります。
- 録音を開始する前に 30 分録音室に蠕動性ポンプを接続します。純水の 50 mL で全体の灌流システムを洗浄した後定数 carbogenation の下でガラス ビーカーに含まれるアプライド (50 mL) と録音室の灌流を開始します。実験を通して循環アプライドをインライン マイクロヒータとペルチェ ヒーター 32 ° C に保ちます。
5. ミクログリアの魅力解析処理します。
-
2 D 投影とドリフト補正
- ファイルを開く (。LIF) フィジー24。
- 必要な場合のみ興味の z 平面を使用して substack (スタック/ツール/確認/画像 Substack) を作る。たとえば、彼らは取得されているが、分析に使用することが場合、スライスの表面に対応する z 平面を除外 (4.2.11 の手順の後のメモを参照) と no 蛍光と深い z 平面。最後のスタックには、90-110 z スライス (180-220 μ m) 一般に含まれています。
- Z プロジェクト機能を起動 (画像/スタック/Z プロジェクト」)、時間の各ポイントで取得した z のプロジェクションを行うこと最大強度投影タイプを選択。
- MultiStackRegプラグイン (プラグイン/登録/MultiStackReg) の起動を選択するアクション 1: 配置と変換: 剛体買収時に発生したわずかなドリフトを修正します。新しいファイル (.tiff) としてこの 2 D のムービーを保存します。
-
データ処理
- 氷25とこの新しいファイルを開きます。
- (特にピペットと射出の時に作成された歪みの影によって識別される) 注射部位を中心とした直径 35 μ m の利益 (率 ROI) の円形R1領域を描画します。
- 投資収益率強度進化プラグインを使用して、R1 で時間の経過と共に平均強度を測定します。
- 結果を保存します。XLS ファイル。
-
定量化と結果の表現
- 時間をかけてミクログリア応答を定量化するには、各時点で決定します。
Here,'R1(0) は、注射前に R1(t) 値の平均です。その後、結果ミクログリア応答の運動として表すことができます。 または特定の時間ポイント (図 7参照)。
- 時間をかけてミクログリア応答を定量化するには、各時点で決定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルを誘発する、観察、およびミクログリア プロセス ローカルで適用される化合物への配向成長を定量化する方法を記述する、たとえば、ATP または急性脳内の 5-HT を若者や大人からスライス (少なくともまで 2 ヶ) マウス。正常な状態の大人動物から脳スライスを数時間維持に寄与する要因はプロトコルの 2 つの手順で細胞の生存を最適化するために設計された 2 つのツールの使用。まず、インターフェイスの商工会議所 (図 1) のインターフェイス スライス ホルダー切削後のスライスの保全が向上します。第二に、記録室 (図 2) には、アプライド イメージング中にトップとスライスの下の両方を実行することができます灌流システムがあります。ここで使用される記録槽寸法 (の 62 mm 外側直径)、古典的なバス商工会議所挿入に似ているが、デザインをすることができます彼らのモデルは補足資料からダウンロード可能な標準的な顕微鏡に合うように設定されてほかのディメンションのスライス ホルダーに合うように適応します。注意するには、は各商工会議所はそれらの間延伸ポリアミド メッシュでアセンブリ、2 つの完全に継ぎ手部分、接着剤なしで作られています。
ATP または小さい区域の 5 HT を提供し、ミクログリアの局所的な応答を誘発する、(図 2d表示) の化合物を含むピペットはスライスの上に、その先端で配置されます。最初の実験でそれは二光子励起顕微鏡 (図 3 a) で取得した画像のピペット チップの位置を視覚化するために蛍光染料をソリューションに追加することができます。図 3 b、それはその先端に触れるし、コンピューター画面の明視野像のスライス面の変形とすぐに、実験者はピペット降下を停止しているがその細い下肢は 80 - まで、組織にわずかに入力表示表面から 100 μ m。それはそれ、細胞に正常なソリューションの実現も入力ができなくため、ピペットがあまりにも表面的な重要それは蛍光信号が低すぎる領域に達する可能性がありますのであまりにも深い。ピペット先端までの深さに影響するパラメーターは、三次元マイクロマニピュレーターとピペット口直径を調整できるピペットの角度です。
注、(図 3 b) y 軸に沿って投影は、蛍光がより上位のスライスの下の部分に強いことを確認することが可能です。これは、両方のスライス内信号の進行鈍化し、スライスといくつかの細胞体の表面的な層のミクログリアのプロセスは表面に向かって移動する傾向があるという事実に予定です。その結果、スライスの最も表層におけるミクログリアのスライスは、彼らが同じ状態ではありません、異なる刺激に反応することがあることを示す内部のそれらより異なった形態が表示されます。したがって、表面的なミクログリア活性化マスク可能性があります、z の投影で以下のミクログリアの応答。また、表面が傾いている多くの場合、スタックの最初の z 画像は斑状。したがって、お勧めします、最も表面的な z 平面を z 投影と分析から除外する、精度を上げるため。しかし、として変更ミクログリアの形態と浅の残骸の存在層スライスの状態の指標である、それは事後状況を確認するスライスの完全な深さをイメージする面白いことができます。これは特に新しい被験者を可能性があります簡単に異常ミクログリアまたは単一の z 平面からの残骸を認識できます。Z 投影手順 (プロトコルの手順 5.1.2) で z 平面の最初 30 μ m での撮影が除外されます。
スライスの関心の化合物で処理して記録した後 z 平面 (前述の通り最初に 30 μ m を除く) のシリーズは各時 z 投影像の 2 D ムービーを作成する z 軸に沿ってポイントを投影イメージ。注意するは、ここに示すプロトコルで最大 z 投影に使用される厚さ網羅すべての z スライス蛍光が表示される (通常 180 220 μ m、プロトコルの手順 5.1.2 を参照)。したがって、z スライスの絶対数の変化では、反応の定量化は影響しません。対照的に、いくつかの研究は、z 投影6,7,11,27薄く z スタック (40-60 μ m) を使用します。これは誘引効果が目に見える限り 70 μ m (z) いくつかの実験でピペット チップから見た応答を表わすいくつかの z-スライスを除外するリスクが付属しています別のオプションです。薄くオプションを優先する場合、したがって、重要ですセンター ピペット上 z スタック チップ z、そして重要な z のみの投影が同じ方法で行われます (すなわち、すべての蛍光 z スライスを使用してまたは薄い z スタックを使用する) と比較することができます。
定量分析のための興味の R1 地域を定義します。図 4は、z 投影に投資収益率を示しています。赤の破線は、ピペットの推定位置を表します。黄色の円、R1、氷で描かれ、ピペットの推定の先端を中心としました。重要なは、顕著な変動がその紛失が応答の過小評価につながる R1 ROI のローカリゼーションから定量化の中に起こったことを観察した.配信のサイトの ROI を配置するには、イメージを作成するフィールドの同じ中央 XY 位置に常にピペット チップを配置するために、明視野でピペットを配置する場合、集録ソフトウェアに、ルーラーを表示するをお勧めします。これは、その後、蛍光画像の Z 投影で ROI を配置する場所の表示を提供します。ただし、最終的な先端位置と、したがって、配信の実際のサイトは、ピペット先端までの深さに応じて、中央の位置から若干シフトされてされます。このため、R1 の位置に考慮他の 3 つの条件: R1 (i) (ii) は、一時的な領域に対応する必要があります、右下隅の暗い背景からポジションが推論されます、ピペットの先端にある必要があります組織の歪みは、化合物を注入すると、(ii)、(もしあれば) ローカル応答領域に対応する必要がありますそれが観察されるときに発生します。これは精度の良い配信のポイントを見つけるために十分ではない場合を助ける蛍光化合物とピペットを充填します。R1 は、我々 は、それがよくすべての時間ポイントの位置にあると異常なドリフト、歪み、または任意の時点でアイテム蛍光性がないことを確認するもう一度映画を実行を描いたあと定量化をバイアスがあります。補足資料 (映画 S1) で ATP アプリケーションの効果を示すと図 4に対応する映画を見つけることが。
当初、ATP または P11 マウス15の視床における 5 HT に向けたミクログリア プロセスの魅力を調べた。最近では、これらの実験を繰り返した 4 日間-2 カ月齢のマウスからのスライスと様々 な地域 (たとえば、海馬での録音に対応する図 3 )。我々 はほとんど成熟した脳の成熟しており、区分されたミクログリアを持つことの利点を組み合わせた 3-4 週齢のマウスを使用-良いスライスの生存率と。重要なは、代表的なノーマル状態ミクログリアは、小さな相馬、小型端末を持つ長いプロセス、基準状態で絶えず移動プロセスによって特徴付けられます。通常、30 日齢のマウスに 18 からスライスにミクログリアの形態ほとんど変わって 6 h までのスライスの準備の後。生理の状態でスライスを維持する能力は、古いマウス (2 ヶ月) からスライス、減らされた (~ 4 h) です。に応えてスライスの 5 HT 20 日齢のマウスからの ATP のスライスで 2 ヶ月齢マウスからの視床におけるミクログリア方向運動の例としては、図 5で提供されます。図 5に 5 HT アプリケーションに対応する映画は、補足資料 (映画 S2) で見つけることが。
図 6は、2 つ準実験スライス彼らをイメージしました前にアプライドで 6 h 以上の保管は、(0 のとおり回のみ) を紹介します。図 6A、複数の短いプロセスまたは拡大端末を連想させる神経突起成長円錐は、ミクログリアの存在と多くの蛍光細胞の残骸または粒子の存在を確認します。これらの非常に蛍光要素不動滞在または「生きている」ミクログリアに属していないことを示す、イメージング中にランダムに移動 (補足資料の映画 S3を参照)。注意しては、この特定の例では、ミクログリアは常に自分の環境をスキャンしたが彼らいない生理学的状態にあると考えられることの形態が変更されたので。さらに、大量の破片ろう蛍光分析不十分な信頼性の高かった。図 6 bは、大規模なフラットの細胞体と突起は、時々 いくつかの時間前に彼らをイメージしましたが保管されているスライスの浅層にあるミクログリアの存在を示しています。のみ浅の z 位置はこの z 投影に使用されています。図 6より深い z 位置、同じ脳スライスから図 6 bに示すように、substack です。ただし、彼らは表面に配置されていませんが、これらのミクログリアは異常「ふさふさ」一面を持っています。ミクログリアの側面であるため、これらの 2 つのスライスに対応する映画は定量化のため使用されませんでした。
2 D 映画からデータを抽出した後、時間の経過とともに正規化 R(t) 蛍光をプロットすることによって結果を表現できます。図 7 aでいくつかの実験をまとめたグラフを発表することで、応答の可変性を示します。蛍光減少直後に、一過性 (最初の 3 つのイメージ) の組織の歪みのため注入後メモ (すなわち、ピペットで液体注入一過性ティッシュをプッシュし、増加)。ATP への応答の可変性、でもスライス見る同様にヘルシーで、運動性と区分されたミクログリアと、応答がない同じように事実を示しています (ただし、すべてのそれらの応答を行う)。組み込みサンプルの不均一性の上に、前述のように、R1 の位置でいくつかの緩みがあるし、我々 も配信される溶液の量の違いなどの影響を除外することはできません。したがって、小さな効果や変化を検出するは興味深い化合物注射用自動装置を使用するがあります。
図 7 bは、どのように ROI のサイズにも影響定量化、ATP 誘起プロセスの成長のここを示しています。35 (ここに示すすべての解析図 7 aで使用される直径) から 50 や 70 μ m に直径を増加すると、小型の R1 の位置決めの問題を抑制することによって実験 (スライス) の間で変動が減少します。しかし、また精度と検出の応答の大きさを減少させます。確かに、大きな roi プロセスや治療を受けない細胞体のためのより多くの背景があるし、プロセスの成長することができますされる部分的に鈍化ミクログリア枝ピペットからより遠くの併用の収縮によってそれにもかかわらず投資収益率の中。結論としては、Roi を使用し 35 μ m は、1 つ以上の異なる直径の円に関連することが基本的な投資収益率は常に比較されるすべてのデータのセットに同じであること。
図 7は、アプライド、ATP、5 HT といくつかの実験の平均 ± SEM を示しています。ATP の効果は、生体内で同様の方法で他のグループによって得られるものと同じ範囲 (0.5 Davalos に従ってら3 ・ ヘインズら13によると 0.4)、スライス (0.8 同様に正規化された場合、Dissing 欧米ら5、および 0.6 パガーニによるとによるとら28)。一方、違いから来ることがスライスの調製法などの生物学的パラメーター注入、マウス、または使用すると、脳の領域と ROI の直径などの解析パラメーターから一方の時代 ATP の量とz 投影法 (すなわち、蛍光が検出された全体の厚さまたは最大応答が必要なところ、ピペット チップ周り 40-60 μ m のみ) に使用される z スタックの太さです。
図 7、アプライド注入はネガティブ コントロール、局所注射とピペットの圧力がミクログリア プロセスを集めることができる傷害を引き起こさないことを確認してください。さらに、アプライド コントロールは研究者が時間をかけて退色がないことを確認することができます。確かに、退色、蛍光タンパク質、蛍光物質の光子誘起破壊蛍光時間の経過と共に徐々 に減少を誘導するいると思います。それは測定をバイアスすることができます、厳密な実験条件下では退色がないをチェックすることが重要です。これを行うには、するには、30 分間の gfp 発現するミクログリアとスライスに XYZT シリーズを取得する勧め (アプライドに注入することができますが、実際には、刺激は不要)、実験条件のように設定励起と集録パラメーターを持つ。その後、ミクログリア細胞体やプロセスなどのさまざまな地域で時間をかけて蛍光の定量的測定は、通常、指数関数的減衰、退色を示す発光強度の漸進的な損失があるかどうか明らかになります。いくつかの調整を行うことがこの場合: レーザーの再編、レーザー パワーの削減と検出器の増加を得るため、z 平面の数、照明を制限するそれらの間の間隔の増加の減少。退色は高出力または長期で愛用されて (ex: ラインの平均の照明を繰り返し) 励起;したがって、持続的な照明を使用して低い蛍光性を持つ細胞をイメージする場合、研究者は注意を払う必要があります。
ATP または 5 HT の局所注射後、高原 (図 7) に達すると、R1 で蛍光性の増加があります。反応速度論、に加えて安定したエンドポイントで魅力を比較する興味深いことです。Tにおけるミクログリアの応答を表すことにしましたここでは、図 7で 26 分 (すなわち、注入後 20 分) を =。これは、化合物を統計学的に比較するか (つまり、灌流液または [見せない] ピペットの化合物と共に) お風呂に追加できる拮抗薬の効果をテストするために便利です。
図 1: インターフェイスの商工会議所詳細。(A) スライス ホルダーの 3 D プリントの概要。ホルダーの外径が 7 cm。 (B) インターフェイス スライス ホルダーにより、液体空気インターフェイスでスライスを維持する研究者ナイロン メッシュ (矢印)。(C) インターフェイスでは、デバイスが作成されます前にスライス (矢印は、バブルのチューブを示します) carbogenated と加湿環境を維持するために可能にする商工会議所します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 灌流チャンバー詳細。(A) 3 D プリントの概要。灌流チェンバの外径である 5.9 cm ナイロン メッシュ (矢印) に灌流チェンバ (B)、スライスをサポートし、下のスライドに触れるを防ぐ、上と下にフローするアプライド。2 光子励起顕微鏡でアセンブリの (C) の画像。ローカルの化合物を提供するマイクロ ピペットが右 (アスタリスク) で表示されます。(D) ピペット明視野でのイメージを作成します。スケール バー = 60 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: マイクロ ピペットのスライス位置。マイクロ ピペット (30 日古い動物の海馬) の画像のスタックの買収の例は、フルオレセイン (1 μ M) でいっぱい。フルオレセインは、(A) z 軸に沿って最大突起または (B) y 軸でピペット (アスタリスク) を検索することが可能になります。、が、蛍光で暗く、軽いがあることもピペット チップ下ミクログリア パネルBに注意してください。この図の例では、スライスの最も表面的な部分での撮影画像を含む完全なスタックを予測のため使用されています。スケール バー パネルAと示された 30 μ m を = (各卒業 = 50 μ m) パネルBで。スタックの厚さ z = 220 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 定量化のための投資収益率使用の R1 の位置決め。この図は、ATP がピペット (最初の時点で赤い破線) の推定位置と R1 の描写の図面 (から 20 日古い動物の視床) スライスに適用して実験の 3 つの実験的な回ポイントを示しています投資収益率。スケール バー = 30 μ m. 注右下隅の暗いエリアの照明とイメージングと干渉するピペットの陰に対応します。また、ピペット チップの位置を示す 25 分で強烈な蛍光の小さな領域に注意してください。スタックの厚さ z = 220 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ミクログリア応答します。5 HT (5 μ M) を脳の上のローカルのアプリケーションへの応答は 20 日齢マウスからスライス (左; スライス z 厚 = 220 μ m) と ATP の (500 μ M) 2 ヶ月齢マウスのスライス上 (右; スライス z 厚さ 220 μ m =)。赤の破線は、ピペット位置を表します。両方の録音は視床で行われているし、スライスの上の 30 μ m を除外されています。(上段) の前に、画像は撮影後 (下段) 25 分注入。スケール バー = 30 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 最適な実験例。これらのスライスはイメージングの前に 6 時間以上を待っているし、上面からイメージが作成されました。(A) は瓦礫の山と z スタックの例 (約ラウンド、蛍光粒子ですが不規則な国境のアスタリスク) と「ふさふさ」ミクログリア (矢印)、多数ですが短いプロセスでは。軸索成長円錐のように見える拡大プロセス端末 (矢印) に注意してください。スタックの z 厚さ 220 μ m を =。他の 2 つのパネルの表示 (B) で、同じスライスの 2 つのサブ スタック 1 30 z 平面 (z 厚さ = 59 μ m) および (C) 30-120 z 平面 (z 厚 180 μ m を =)。大規模なプロセスの端子とパネルAのような残骸に加え (パネルBに示すように)、トップ面、珍しい大きな平らな体や突起 (星) とミクログリアがあります。(パネルCで表示) より深い面、上、破片もフラット オブジェクトはありませんが、セルがふさふさした (矢印) と密度が異常に高い。完全に、これらの観察は、ミクログリアが通常の状態でないことを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: ミクログリア プロセスの魅力の定量化します。一連の実験の変動を説明するために ATP の例を (A)。(B) 影響の定量化に関する ROI サイズ。パネルに示すように各実験 (ATP 注入) は、35、50、70 μ m 径の投資収益率と分析されています。別の Roi の平均の ± SEM モネンシンの各時点でが表示されます。(C) アプライド、5-HT、ATP と実験の概要です。アプライド注入は、ミクログリアのプロセスの場所に影響を与えません。ATP と 5 HT、ピペット、蛍光の局所的増加で測定に向けたミクログリア プロセス チューブの局所成長を誘発します。SEM の平均の ± が示されます。Tにおけるミクログリアの回答の概要を (D) = 20 分これら (録音の初めから 26 分)。SEM の平均の ± が示されます。Dunnett投稿アドホックテストの一方通行 ANOVA を使用します。p < 0.01 * * * p < 0.001 アプライド注入と比較して。アプライド、 nの = 7;ATP、 nの = 8;5 - ht、 n = 6。視床でこれらすべての実験を行ったが、海馬や皮質から同様の結果を得ることが。Z 予測と定量化のため使用しているスタックの z 厚さ 180 220 μ m を =。パネルBを除くすべての措置は、35 μ m 径の投資収益率で行われています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ムービー S1: ローカル ATP (500 μ M) アプリケーションの効果の例です。この実験は、20 日齢動物の視床に行われてきました。この映画からの画像は、図 4のために使用されています。スケール バー = 30 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
映画 S2: ローカル 5 HT (5 μ M) アプリケーションの効果の例です。この実験は、20 日齢動物の視床に行われてきました。この映画からの画像は、図 5 (左) 使用されています。スケール バー = 30 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
映画 S3: スライスのイメージングの前に 6 時間以上を待っていたところで最適な実験例。ランダムに時間をかけて移動する多数の残骸の存在と、ミクログリアの珍しい形態に注意してください。この映画からのイメージは、図 6 aとして使用されます。スケール バー = 30 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
の補足ファイル: インターフェイス開催商工会議所商工会議所のイメージングします。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
図りとは違っての解離や切片スライス文化、限られたネットワーク調整と構造健全性急性脳スライス許可彼らの生理学的環境におけるミクログリアの研究に研究。しかし、主な制限の 1 つはスライス手順が急速に特に成体脳におけるニューロンの生存を危険にさらすことができます傷害を作成するという事実です。ミクログリア細胞の損傷に特に反応、神経細胞死の生理学的状態に近いミクログリアを維持するために可能な限り制限することが重要です。、これは順番、を介してスライスの良い全身状態に好循環に貢献しています。
この資料で説明されているプロトコルは、特に大人のマウスから数時間にわたってスライスのより良い生存率を得ることを目的とした電気生理学実験のための文献が見つかりましたいくつかの改良を適用されます。スライスの生存率の加齢に伴う格差を克服するためには、コリンとナトリウムを置換し、心臓の血流、スライス、および回復段階の間にこのコリン アプライド媒体を使用します。これは最小29,30に細胞毒性をもたらします。コリン-アプライドに加えて N-メチル-D-glucamine (NMDG) のような神経の保存効果の高い他の多くの代替アプライド レシピがあることに注意してください-アプライド31ミクログリアの研究のための興味深い可能性がありますしかし、ここではテストされていません。この手順の別の重要なステップは、心臓の血流です。冷たいコリン アプライド ソリューションと動物を灌低 Na+、低 Ca2 +、および高い Mg2 +を含む、体温の急激な減少が誘発され、脳細胞の代謝活性が低下を減らす、切断による細胞ストレス。確かに、我々 は、このアプローチは、単に脳全体を取り外し、アプライド ソリューションでそれを沈めるよりもより多くの保護を提供して観察。パッチ ・ クランプ、光遺伝学的研究29の最適化されたプロトコルに触発され、我々 も期間を使用「保護回復」物理スライスの直後の 10 分 32 でコリン アプライド スライスのトラウマから回復するスライスを許可します。° C.その後、スライス インターフェイスを保持追加最小時間 30 分の回復室に移った。この 2 番目の回復期間は興味、Na+代替、動物の年齢・脳領域に応じて最適化できる、電気生理学、イメージングと並行して実行する場合に少なくとも 1 時間を持続させるべき。
使用する前に正常な状態で血流イメージング中にスライスのメンテナンスの重要なパラメーターがあります。インターフェイスとデュアル灌流チェンバの両方は、電気生理学で広く確立されたツールです。たとえば、インターフェイスのメソッドは、1995年26以来海馬スライスの生存率を改善するために使用されています。ここのチャンバーと類似する装置はいくつかの企業によって提案されたが、まだ一般的ミクログリア イメージング用します。我々 は、長時間インキュベーション時間スライスの細胞劣化を遅らせること保持室、網の上に置くにスライス、アプライドの大規模な貯水池を持つインターフェイスでは、インターフェイスを設計しました。映像室では多光子顕微鏡検査中に正常な状態で細胞を維持する急性スライス標本の増加酸素化を可能にする設計両面灌流チェンバを使用しました。単一灌流とは対照的水中スライス増加のダブルの灌流、他の材料と同様、酸素、以来、細胞の自由にかつ効果的に拡散がかなり厚切りの両側から高流量で。
このプロトコルはミクログリア プロセスに ATP または他の化合物のグローバル誘引効果の定量化を目的とした、その定量化はダバロスはで使用されるに基づいていますら3。他の種類の分析を実行することが可能です。たとえば、ミクログリア プロセスの蛍光レベルに依存しないが、画像解析の実験者のより多くのアクションを必要とする、別の方法、調合後ピペット チップ周囲の空きスペースの削減を測定することです。アプリケーション11,32。また、個々 のミクログリア プロセス15,28の先端の動きを追跡することが可能です。
また、等方性運動やミクログリアの監視も登録できます基底状態でまたはこのプロトコルを使用したスライスの利子の化合物の申請によりお風呂。ただし、ミクログリア プロセスの高速伸縮率を定量化し、潜在的な変化を検出、取得頻度を増やすに関連するででしょう。たとえば、パガーニらはすべて 10 秒281 つの画像の周波数を使用します。
最後に、最近の出版物は、形態学的変化または個々 のプロセスの 3 つの次元の運動性を定量化する方法を説明します。このような分析より軸解決 (すなわち、z-ステップ Heindl ら33によると 0.4 μ m を必要他の人と 2 μ m の z ステップ間隔は十分ないくつかのプログラムの27。
ここでは、我々 は野生型マウス内因性ミクログリアの GFP 発現と化合物の機械的適用実験を示したが、このプロトコルは、ミクログリア、YFP18のようなまたはの他の蛍光レポーター蛋白質に合わせることができる、外因性蛍光 isolectin11,34ミクログリアのラベリング。最後に、ATP または 5-HT 野生型の通常の環境でのローカル アプリケーションに向けたミクログリア プロセスの副産物を調べたが、他の化合物、刺激 (例えば、ケージド化合物) の他の種類のテストし、テストにこのプロトコルを使用することができる方法方向の運動は、突然変異、薬理学的エージェント、または病理学的コンテキストに影響されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 感謝細胞と組織イメージング施設インスティトゥート du Fer à ムーラン、すべての画像の取得と解析が行われているのです。センター国民 de の la Recherche 日仏 Institut 国立デ ラ健康にこの作品の一部でサポート エ デ ラ抜き Médicale ソルボンヌ大学科学とソルボンヌ Universités ピエールからの補助金によって et マリー キュリー大学 (Emergence-UPMC プログラム 2011/2014) こそ注ぐラ凝ったシュル ル Cerveau、財団・ ド ・ フランス、こそ注ぐラ凝った Médicale「エキップ FRM DEQ2014039529」、フランス語研究 (Agence 国立注ぐラ凝った省ANR-17-CE16-0008 ・ Investissements d'Avenir プログラム「バイオ買う Psy Labex「ANR-11-アイデックス-0004-02) および計算の神経科学プログラム、国立科学財団/フランス国立研究機関における共同研究 (番号: 1515686).すべて著者が所属して研究グループ (ENP) 神経科学のパリ校とバイオ買う Psy の Labex のメンバーであります。F. e. 提携してソルボンヌ大学、Collège 博士、F-75005、パリ、博士課程の学生でありバイオ買う Psy の Labex によって資金を供給されます。V. m. は計算神経科学プログラム、国立科学財団/フランス国立研究機関での共同研究によって資金を供給される博士研究員 (番号: 1515686)。著者らは、プロジェクトの開始に参加したマルタ [コロジエチャク] をありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1 M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99.0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32 °C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8 mL with fin tip, but we cut it (approx 7 cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32 °C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1 mg/mL (3 mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4 °C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20 °C. 500 µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5 mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
- Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
- Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).
- Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).
- Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
- Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Wu, L. -J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
- Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
- Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
- Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, 1.23.1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
- Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 221-242 (2014).
- Mainen, Z. F., et al.
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
- Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).
