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Neuroscience

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58788
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, *1,2,3, *1,2,3
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), UMR-S 1270 Paris, France, 2Sorbonne Université, Paris, France, 3Institut du Fer à Moulin, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Mikroglia, die ansässigen Immunzellen des Gehirns, reagieren schnell auf Änderungen ihrer Umgebung mit morphologischen Veränderungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie zwei-Photonen-Mikroskopie zu verwenden, um die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse gegenüber Serotonin oder ATP in akuten Hirnschnitten von Mäusen zu studieren.

Abstract

Mikroglia-Zellen sind resident angeborenen immunen Zellen des Gehirns, die ständig ihre Umgebung mit ihren langen Prozessen absuchen und bei Störung der Homöostase, schnelle morphologische Veränderungen durchlaufen. Zum Beispiel induziert eine Laser-Läsion in wenigen Minuten eine ausgerichtete Wachstum von Mikroglia Prozesse, auch genannt "direktionale Motilität", in Richtung der Stelle der Verletzung. Eine ähnliche Wirkung kann erzielt werden, durch die Bereitstellung lokal ATP oder Serotonin (5-Hydroxytryptamine [5-HT]). In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll eine gerichtete Wachstum der Mikroglia Prozesse in Richtung einer lokalen Anwendung von ATP oder 5-HT in akuten Hirnschnitten von jungen und Erwachsenen Mäusen zu induzieren, um diese Attraktion im Laufe der Zeit durch multiphoton Mikroskopie Bild. Eine einfache Methode zur Quantifizierung mit freien und Open-Source Bildanalyse-Software wird vorgeschlagen. Eine Herausforderung, die nach wie vor akuten Gehirnscheiben charakterisiert ist die begrenzte Zeit, verringern mit dem Alter, in dem die Zellen in einem physiologischen Zustand bleiben. Dieses Protokoll ist somit Höhepunkte einige technischen Verbesserungen (Mittel, Luft-Flüssigkeit Schnittstelle Kammer, Kammer mit einer doppelten Perfusion imaging) zur Optimierung der Lebensfähigkeit der Mikroglia-Zellen über mehrere Stunden, vor allem in Scheiben von Erwachsenen Mäusen.

Introduction

Mikroglia-Zellen sind resident Makrophagen des Gehirns und eine Rolle in beiden physiologischen und pathologischen Bedingungen1,2. Sie sind haben eine stark verzweigte Morphologie und ständig erweitern und ihre Prozesse3,4einfahren. Dieses "Scan" Verhalten wird geglaubt, um Verwandte und notwendig, um den Überblick über ihre Umgebung werden. Die morphologische Plastizität der Mikroglia drückt sich in drei Modi. Zunächst einige Verbindungen schnell modulieren Mikroglia Morphologie: die Zugabe von ATP5,6 oder NMDA5,7 mittelfristig akute Gehirnscheiben Baden erhöht die Komplexität der Mikroglia Verzweigungen während Noradrenalin es6 sinkt. Diese Effekte sind direkt vermittelt durch Mikroglia-Rezeptoren (für ATP und Noradrenalin) oder erfordern eine ATP-Freisetzung von Neuronen (NMDA). Zweitens kann die Wachstum und Retraktion Geschwindigkeit der Mikroglia Prozesse, Motilität oder "Surveillance", genannt extrazellulären Faktoren8, Homöostase Störungen9,10oder Mutationen9betroffen sein, 10,11. Drittens: Neben diesen isotropen Änderungen der Morphologie und Motilität Mikroglia haben die Fähigkeit, ihre Prozesse gerichtet in Richtung einer Pipette liefert ATP3,5,12, zu verlängern 13 , 14, in der Kultur, in akuten Gehirnscheiben oder in vivo, oder liefern 5-HT in akuten Gehirn Scheiben15. Solches orientierte Wachstum Mikroglia Prozesse, auch genannt gerichtete Motilität, wurde als Reaktion auf eine lokale Laser Läsion3,4erstbeschrieben. Also physiologisch, es kann im Zusammenhang mit der Reaktion auf eine Verletzung oder erforderlich für targeting Mikroglia Prozesse in Richtung Synapsen oder Hirnregionen erfordern Rebschnitt während Entwicklung15,16, oder im physiologischen17 ,18,19 oder pathologischen Situationen9,18,19,20 im Erwachsenenalter. Die drei Arten von morphologischen Veränderungen setzen auf verschiedene intrazelluläre Mechanismen11,13,20, und einer bestimmte Verbindung nicht unbedingt modulieren alle von ihnen (z. B. NMDA, die indirekt auf wirkt Mikroglia, wirkt auf die Morphologie aber nicht dazu veranlassen, direktionale Motilität5,7). Mit dem Ziel, die Wirkung des eine Verbindung, eine Mutation oder eine Pathologie auf Mikroglia charakterisieren, ist es daher wichtig, die drei Komponenten ihre morphologische Plastizität zu charakterisieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der gerichteten Wachstums der Mikroglia Prozesse in Richtung einer lokalen Quelle Verbindung, was hier ist, ATP oder 5-HT.

Es gibt mehrere Modelle, Mikroglia Prozesse Attraktion zu studieren: Primärkulturen 3D-Umgebung6,18,19, akute Gehirn Scheiben6,13,15, und in Vivo Imaging-3,13. Der in-vivo-Ansatz ist die beste, die physiologische Zustand der Mikroglia zu bewahren. Allerdings intravitalen Bildgebung des tiefen Regionen erfordert komplexe chirurgische Eingriffe und daher ist es oft auf oberflächliche kortikalen Schichten beschränkt. Die Verwendung von Mikroglia Primärkultur ist die einfachste Technik, um eine große Anzahl von Bedingungen mit einer begrenzten Anzahl von Tieren zu testen. Dennoch ist es unmöglich, die gleiche Zelle Morphologie wie in Vivo zu erhalten, und Zellen verlieren ihre physiologischen Wechselwirkungen mit Neuronen und Astrozyten. Akute Gehirnscheiben sind ein Kompromiss zwischen diesen beiden Ansätzen. Dieses Modell erlaubt Forschern, Hirnstrukturen zu studieren, die sonst schwer zu erreichen und zu Bild mit hoher Auflösung in-vivo und Scheiben von Neugeborenen Stadien zu untersuchen sind, während die transkranielle Mikroskopie meistens im Erwachsenenalter durchgeführt wird. Schließlich macht es möglich, die Auswirkungen von lokalen Zulassungsantrag in Echtzeit zu beobachten, und versuche zu wiederholen, wobei eine begrenzte Anzahl von Tieren. Dennoch ist ein Problem mit akuten Gehirnscheiben der begrenzten Zeit (einige Stunden), während die Zellen am Leben, insbesondere für Scheiben von Mäusen, die älter als zwei Wochen, und die mögliche Änderung der Mikroglia Morphologie über Zeit21,22 bleiben .

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur akuten Hirnschnitten von jungen und Erwachsenen Cx3cr1 bereitenGLP / + Mäuse bis zu zwei Monate alt, mit der Erhaltung der Mikroglia Morphologie und Motilität für mehrere Stunden. Wir beschreiben, wie diese Scheiben zu verwenden, um die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse in Richtung Verbindungen wie ATP oder 5-HT zu studieren.

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Protocol

Alle Experimente wurden durch die lokale Ethikkommission genehmigt (Darwin Ausschuss, Vereinbarungen #1170 und #10921).

1. Vorbereitung von Glas Mikropipetten für die lokale Anwendung von Verbindungen

  1. Bereiten Sie Pipetten aus Borosilikat dünnwandige Glaskapillaren mit einer Elektrode Abzieher. Passen Sie die Parameter um Pipetten mit 4-5 µm Durchmesser an der Extremität zu erhalten. Abb. 2D zeigt eine Pipette im Hellfeld bei kleiner Vergrößerung.

(2) Lösungen

  1. Stellen Sie sicher, dass nur Gläser, die durch ein Autoklav Zyklus gereinigt wurde, gefolgt von Spülung 2 X - 3 X mit Reinstwasser, verwendet werden. Nie verwenden Glaswaren, die Kontakt mit Paraformaldehyd stattgefunden hat.
  2. Bereiten Sie eine 2 mol· L-1 CaCl2 Stammlösung durch Auflösen von 14,7 mg CaCl2·2H2O in 50 mL Wasser von hoher Reinheit (Reinstwasser, Widerstand 18.2 MΩ; die Spuren des Metalls in destilliertem Wasser oder Leitungswasser können führen zu suboptimalen Slice Qualität aufgrund Pro-oxidative Wirkung).
    1. Speichern Sie diese Stammlösung bei Raumtemperatur für maximal einen Monat.
  3. Am Tag des Experiments bereiten Sie 1 L Cholin-ACFS (künstliche Liquor cerebrospinalis) Lösung, deren Zusammensetzung 110 Mmol· ist L-1 Cholin Cl, 25 mmol· L-1 Glukose, 25 mmol· L-1 Nahco33, 7 mmol· L-1 MgCl2, 11,6 mmol· L-1 Ascorbinsäure, 3.1 mmol· L-1 Natrium Pyruvat, 2,5 mmol· L-1 KCl, 1,25 mmol· L-1 NaH2PO4und 0,5 mmol· L-1 CaCl2, 0,5.
    1. Zur Vorbereitung dieser Lösung hinzufügen, in der folgenden Reihenfolge in eine 1 L Schloss Kolben: 0,186 g KCl, 0,195 g NaH2PO42,04 g der Säure Ascorbinsäure, 2,1 g Nahco33und 4,5 g Glukose.
    2. Füllen Sie ca. zur Hälfte das Endvolumen mit Reinstwasser und rühren Sie bis zur vollständigen Auflösung.
    3. 0,34 g Natrium Pyruvat und 15,36 g Cholin Cl zugeben.
      Hinweis: Es ist bequem, erste auflösen Cholin Cl mit 5 bis 10 mL der Lösung in 2.3.2 Schritt vorbereitet, bevor Sie die gesamte Lösung hinzufügen.
    4. Fügen Sie 1 Mol· 7 mL L-1 MgCl2 und 250 µL 2 mol· L-1 CaCl2 (in Schritt 2.2 zubereitet) und die Lösung.
    5. Füllen Sie den Messkolben bis zu 1 L mit Reinstwasser.
    6. Überprüfen Sie mit einem Dampfdruck XR, dass die Osmolarität zwischen 300 und 310 mΩ. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie es mit Glucose.
    7. Den pH-Wert nach Carbogenation (d. h. mit "Carbogen" sprudelt, eine Mischung aus 95 % O25 % CO2) zu überprüfen und gegebenenfalls zu 7,3-7,4 mit 10 M NaOH einstellen.
    8. Übertragen Sie die Lösung in eine Glasflasche zur Aufbewahrung. Halten Sie die Flasche in den Kühlschrank bis zur Verwendung (Schritt 3.1).
      Hinweis: Es wird empfohlen, eine frische Lösung am Tag des Experiments zu machen. Allerdings kann bei Bedarf Cholin-ACFS zwei Tage bei 4 ° c gelagert werden
  4. Am Tag des Experiments bereiten Sie 1 L einer ACFS Lösung, deren Zusammensetzung 124 Mmol· ist L-1 NaCl, 26,2 mmol· L-1 Nahco33, 25 mmol· L-1 Glukose, 2,5 mmol· L-1 KCl, 2 mmol· L-1 CaCl2, 1 mmol· L-1 MgCl2und 1,25 mmol· L-1 NaH2PO4.
    1. Zur Vorbereitung dieser Lösung hinzufügen, in der folgenden Reihenfolge zu einem Messkolben: 0,150 g NaH2PO4, 0,186 g KCl, 2,2 g Nahco33, 4,5 g Glukose und 7,3 g NaCl. Die Lösung auf ein Volumen von 1 L mit Reinstwasser zu bringen und es auf einem Teller rühren kräftig rühren.
    2. Fügen Sie 1 mL 1 mol· L-1 MgCl2 und 1 mL 2 mol· L-1 CaCl2 zur Lösung und zum Transfer der ACFS Lösung um eine Glasflasche zur Aufbewahrung.
    3. Überprüfen Sie, ob die Osmolarität 300-310 mΩ· L-1 und wenn nicht, stellen Sie es mit Glucose.
    4. Überprüfen Sie den pH-Wert nach Carbogenation (d. h. mit "Carbogen" blubbern) und gegebenenfalls auf 7,3-7,4 mit 10 M NaOH einstellen.
    5. Übertragen Sie die Lösung in eine Glasflasche zur Aufbewahrung. Halten Sie die Flasche in den Kühlschrank bis zur Verwendung (Schritt 3.1).
      Hinweis: Es wird empfohlen, eine frische Lösung am Tag des Experiments zu machen. Jedoch ist eine Alternative zur Vorbereitung eine 10-fach-Stammlösung mit NaCl, Nahco33KCl und NaH2PO4 10 x die Endkonzentration, die nicht mehr als eine Woche bei 4 ° c aufbewahrt werden können Machen Sie die endgültige ACFS am Tag des Experiments durch Verdünnen der 10-fach-Stammlösung mit Reinstwasser und der Glukose, CaCl2und MgCl2hinzufügen.
  5. Bereiten Sie die Droge Lösungen am Tag des Experiments. Verwenden Sie die ACFS Lösung um zu bringen, die Endkonzentrationen sind hier 500 µmol· L-1 für ATP und 5 µmol· L-1 für 5-HT.
    Hinweis: Für ATP, eine Stammlösung hergestellt werden kann (z. B. 50 mM ATP im Wasser), in regelmÄÑig Form bei-20 ° C gelagert und verdünnt mit ACFS auf die Endkonzentration am Tag des Experiments. Im Gegensatz dazu muss die 5-HT (Serotonin-HCl) Lösung werden aus Pulver am Tag des Experiments, bei 1 Mg·mL-1 im Wasser vorbereitet, gehalten bei 4 ° C, 5-HT-Oxidation zu vermeiden und verdünnt in ACFS zum Zeitpunkt des Experiments.

3. Vorbereitung des akuten Gehirnscheiben

  1. Vorbereitung des Bereichs Dissektion
    1. Bereiten Sie 70 mL eiskaltes Cholin-ACFS in einer 80-mL-Becherglas auf Eis für kardiale Perfusion, schnelle Abkühlung des Gehirns und schneiden zu verwendende gelegt. Bereiten Sie 150 mL Cholin-ACFS in ein 200 mL kristallisieren Gericht, platziert in einem beheizten Wasserbad auf 32 ° c gehalten Legen Sie ein Nylon-Sieb in der kristallisierenden Teller, die Scheiben zu behalten. Hiermit werden die Scheiben für 10 min gerade schneiden erholen zu lassen.
    2. Mindestens 30 min vor Beginn der Dissektion (Abschnitt 3.2), beginnen diese zwei Lösungen (70 mL Cholin-ACFS auf Eis) und 150 mL von Cholin-ACFS bei 32 ° C mit Carbogen sprudeln. Konstante Carbogenation während des gesamten Verfahrens zu erhalten.
    3. Bereiten Sie die Kammer Schnittstellengerät (Abbildung 1), die verwendet wird, um die Scheiben zu halten, bis ihre Verwendung.
      1. In einem versiegelten Lebensmittel-Box (10 x 10 cm oder 10 cm im Durchmesser, Höhe 8 cm), installiert auf einem Magnetrührer, legen Sie eine 200 mL kristallisieren Gericht mit einer Bar Magnet.
      2. Fügen Sie 200 mL ACFS in diesem kristallisierenden Gericht und 3D-gedruckten Schnittstelle Slice Platzhalter oben drauf (die Schnittstelle Stück Halter besteht aus zwei perfekt passende Teile, mit Polyamid Gewebe erstreckte sich zwischen ihnen, Abb. 1A, B).
      3. Entfernen Sie überschüssige Menge aus der kristallisierenden Schale, nur eine dünne Schicht der Lösung, die das Netz von der Schnittstelle Stück Halter zu halten. Dadurch entsteht später eine feine Felge Lösung rund um die Scheiben (aber ohne abdecken).
      4. Legen Sie ein paar Millimeter der ACFS am unteren Rand der Lebensmittel-Box und starten Sie sprudelt es mit Carbogen (beim ersten Gebrauch machen ein kleines Loch in der verschlossenen Lebensmitteln Box Wand um sicherzustellen, dass die Schläuche kann Feld eingeben).
      5. Schließen Sie das versiegelte und gleichzeitig konstante Carbogenation. Dadurch wird eine befeuchtete 95 % O25 % CO2 reichhaltige Umgebung erstellt, in der die Scheiben nach ihrer Genesung in Cholin-ACFS übertragen und gepflegt, bevor sie abgebildet sind. Dieses Gerät ist nachfolgend als die "Schnittstelle Kammer" (Abbildung 1).
  2. Gehirn sezieren und schneiden
    1. Die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 50 Mg·mL-1 Pentobarbital (0,15 mL/20 g Maus Körpergewicht) zu betäuben, es zu immobilisieren aussetzen das Herz und führen eine kardiale Perfusion mit 10 mL der eiskalte, Carbogenated, Cholin-ACFS (siehe Schritt 3.1.1), mit einer peristaltischen Pumpe. Beobachten Sie die Blässe der Leber als Indikator für eine gute Durchblutung. Die Perfusion dauert weniger als 5 Minuten.
    2. Enthaupten Sie die Maus zu und schneiden Sie die Haut um den Schädel zu entlarven. Gelten Sie mit großen Scheren zwei transversale Schnitten von großen Foramen und einem langen sagittaler Schnitt und mit feinen Pinzette, die Schädel-Platten zu entfernen.
    3. Schnell und schonend extrahieren Sie des Gehirns (in weniger als 1 min) und legen Sie sie für 1 min in den 80-mL-Becherglas mit den verbleibenden (~ 60 mL) eiskalte Cholin-ACFS (noch unter konstanten Carbogenation), um es abzukühlen.
    4. Übertragen Sie das Gehirn auf ein Filterpapier vorher nass mit ACFS.
    5. Schneiden Sie das Gehirn nach der Region des Gehirns von Interesse und bevorzugten Winkel des Schneidens. Zum Beispiel um den Thalamus oder der Hippocampus auf koronalen Scheiben image, schneiden Sie mit einer Skalpellklinge das Kleinhirn und dann, etwa 2 mm von der Höhlung und kaudalen Extremitäten des Gehirns.
      Hinweis: Es ist wichtig, Gehirn Teile entfernen, die auch rostral oder auch kaudalen sind denn je kleiner der Region zu trimmen, bevor man den Bereich von Interesse, desto schneller schneiden. Gesamtzeit für slicing (Schritt 3.2.7) von weniger als 20 Minuten wird empfohlen.
    6. Positionieren Sie für koronalen Scheiben und kleben Sie (mit Cyanacrylat-Klebstoff) der kaudalen Gesichts des Gehirns auf einer 10 cm Petrischale, des Schneidblockes eines vibrierenden Slicers aufgeklebt und positionieren Sie es in die Vorratskammer des vibrierenden Slicers, die in einer größeren Kammer angeordnet ist mit Eis gefüllt. Füllen Sie die Petrischale mit all den restlichen eiskalte Cholin-ACFS.
    7. Während 95 % O25 % CO2 konstant zu halten von den eiskalten Cholin-ACFS, sprudeln 300 µm dicken koronale Scheiben schneiden (Geschwindigkeit: 0,08 Mm·s-1, Klinge Vibration: 60 Hz, Schwingungsamplitude: 1 mm).
    8. Sammeln pipette die Gehirnscheiben mit einem breit-Mund (4 mm Durchmesser) Einweg-Transfer, eins nach dem anderen nach jedem Durchgang der Klinge, um die Ansammlung von toxischen Bestandteilen, veröffentlicht von der Peripherie der Scheiben zu vermeiden. Achten Sie darauf, um Luftblasen zu vermeiden, während der Übertragung und jede Scheibe in die Cholin-ACFS bei 32 ° C für ca. 10 min für die Wiederherstellung.
    9. Mit der Transferpipette, legen Sie die Scheiben auf Objektiv Reinigung Papier gekrönt mit einem Rückgang von Cholin-ACFS. Das Übermaß an Cholin-ACFS Aspirieren und mit dem Spatel, legen Sie die Scheiben, auf das Objektiv Reinigung Gewebe auf dem Netz der Schnittstelle Kammer mit Carbogenated ACFS bei Raumtemperatur gelegt (siehe 3.1.3.5). Lassen Sie die Scheibe in diesem Umfeld für mindestens 30 Minuten zu erholen.
      Hinweis: Danach die Scheiben sind bereit und können für Mikroglia imaging für bis zu 6 h nach der Gehirn-Extraktion von jung (weniger als ein Monat alt) Mäuse und bis zu 4 h nach der Gehirn-Extraktion von zwei Monate alten Erwachsenen verwendet werden.

4. zwei-Photonen-Mikroskopie

  1. Parameter-Einstellung
    1. Das multiphoton System (Hybrid-Detektoren, Laser, Scanner, elektrooptischen Modulator, Mikroskop) einschalten.
    2. Optimieren den Laser bei 920 nm, überprüfen Sie, ob der Laser modengekoppelten ist, und legen Sie die Macht in 5-15 % und der Gewinn von 10 %. Dies entspricht einer Leistung von 3 bis 5 mW im Rahmen des Ziels. Sicherstellen Sie, dass die nondescanned Detektoren tätig sind und die entsprechenden Emissions- und Erregung Filter installiert.
    3. Parameter der imaging-Software auf die folgenden Werte festlegen: für die Frame-Größe 1024 x 1024 Pixel entspricht einer Fläche von 295.07 x 295.07 µm; für den Zoom, 2. Wenn das Signal sehr laut ist, gelten Sie einen Linie-Durchschnitt von 2. Setzen Sie für die Pixel-Dynamik die Software zur Abbilderstellung bei 12 Bit oder mehr.
      Hinweis: Bilder mit einer höheren Bit-Wert erlauben Forschern, kleinere Unterschiede in der Fluoreszenzintensität als Bilder mit einer geringeren Bit-Wert zu unterscheiden: eine Änderung von einem Grauwert in einem 8-Bit-Bild einem Wechsel von 16 Grauwerte in einem 12-Bit und 256 grau entspräche Werte i n eine 16-Bit-Bild. Daher höhere Bit-Bilder sind besser geeignet für Quantitative Analyse, aber da ihre Größe mit Bit-Tiefe, Speicherkapazität und computing erhöht werden macht begrenzen.
    4. Wählen Sie den Scanmodus XYZT mit einem Z-Intervall auf 2 µm und einem T-Intervall von 2 min.
      Hinweis: Die x-, y- und Z-Auflösung richten sich nach dem Nyquist-Abtasttheorem. Eine Z-Schrittweite um 0,8 wäre optimal, Mikroglia Prozesse zu lösen (mit einem Durchmesser von < 1 µm), aber die optische Auflösung des multiphoton Mikroskopie begrenzt (bei 920 nm mit 0,95 NA Zielsetzung, die axiale Auflösung ist um 1 µm). Hinzu kommt, dass physikalische Barriere, in ein live-Imaging-Experiment, die Empfindlichkeit oder Signal-Rausch-Verhältnis, die Auflösung, die Geschwindigkeit und die gesamte Beobachtung Zeit Angelegenheit. Unter Berücksichtigung all diese Parameter, Z-Schritt 2 µm (wie in zahlreichen Studien3,11,14), einer Bildgröße von 1024 x 1024 Pixel und einer High-Speed-Übernahme mit einem Resonanz-Scanner gekoppelt an HyD Detektoren (es dauert ca. 15 s 50 Z-Pläne zu erwerben) wurden hier ausgewählt. Die Häufigkeit der Akquisitionen ist eine XYZT Serie alle 2 min und die Gesamtdauer beträgt 30 Minuten. Wenn das Setup nicht schnell oder empfindlich genug ist, ist es möglich, die laterale Auflösung (bis zu 512 x 512) oder die Anzahl der Z-Scheiben zu reduzieren (durch Bildgebung ausschließlich in die Z-Tiefe, die die stärkste Fluoreszenz aufweist [d. h. nicht die tiefste Z-Scheiben wo Fluoreszenz ist schwach]), oder um die Geschwindigkeit des Scanners zu verringern. Die axiale Auflösung kann auch durch eine Erhöhung des Z-Schritt bis zu 3 µm verringert werden, aber da dies die Quantifizierung auswirken kann, sollten alle Experimente verglichen werden mit der gleichen Z-Schritt durchgeführt werden.
      Hinweis: Es ist möglich, ähnliche Experimente auf Scheiben aus CX3CR1creER-YFP Mäuse18, eine Mauslinie verwendet, um genetische Deletion im Mikroglia nur zu induzieren, und in welche Mikroglia konstitutiv express gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) durchführen. Die Expression von YFP ist jedoch sehr gering im Vergleich zu grün fluoreszierendes Protein (GFP) in CX3CR1GLP / + Mäuse; so Bildgebung ist möglich, aber anspruchsvoll und erfordert die Optimierung der Aufnahmeparameter. Es wird empfohlen, diese wie folgt anzupassen.
    5. Optimieren den Laser bei 970 nm (welche ist besser angepasst an YFP Erregung als 920 nm), die Macht bei 50 % und der Gewinn bei 50 %, das entspricht einer Laserleistung unter der Zielsetzung von 5 bis 6 mW.
    6. Legen Sie einen Durchschnitt von Linie 4 (oder mehr), das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
  2. Positionierung des Segments und das Glas Mikropipette und die lokale Anwendung der Verbindung
    1. Anschließen Sie die peristaltische Pumpe zur Aufnahme Kammer, 30 min vor Beginn der Aufzeichnung. Beginnen Sie nach der Reinigung des ganze Perfusion Systems mit 50 mL Reinstwasser die Perfusion der Aufnahme Kammer mit ACFS (50 mL) in ein Becherglas unter ständiger Carbogenation enthalten. Während das Experiment halten Sie die zirkulierenden ACFS auf 32 ° C mit einer Inline-Microheater oder eine Peltier Heizung.
      Hinweis: Eine spezifische Perfusion Kammer mit oberen und unteren Perfusion soll die Sauerstoffversorgung auf beiden Seiten der Scheibe zu optimieren. Die Perfusion Kammer besteht aus zwei perfekt passende Teile, mit Polyamid-Gewebe erstreckte sich zwischen ihnen (Abbildung 2A, B). Im Vergleich mit anderen Arten von Kammern, wo die Scheibe direkt auf einem Glas Deckgläschen Verlegung ist, dieser Kammer neuronalen Tod im Unterteil der Scheibe reduziert, verbessert die Rentabilität und die Slice-Bewegungen induziert durch die Schwellung reduziert.
    2. Übertragen Sie mit einer Transferpipette breit-Mund Einweg-die Gehirn-Scheibe abgebildet werden, um das ACFS Becherglas, entfernen das Objektiv Papier, lassen es sinken (als Nachweis, dass keine Luftblase angeschlossen ist), und übertragen Sie es auf der Aufnahme (Perfusion) Kammer.
    3. Positionieren Sie einen Slice-Halter (eine Haarnadel von Platin mit den beiden Zweigen verbunden durch parallele Nylonfäden gemacht) auf die Scheibe um Scheibe Bewegung aufgrund der Perfusion zu minimieren.
    4. Verwenden Sie die Hellfeld Beleuchtung auf die Region des Gehirns von Interesse (Belichtungszeit: 50 bis 80 ms) mit einer niedrigen Vergrößerung Ziel (5 X oder 10 X). Wechseln Sie zu der höheren Vergrößerung (25 X mit einem 0,35 X Objektiv) Wasser eintauchen Objektiv und passen Sie die Position.
      Hinweis: Vermeiden Sie zu Bildfelder in der Nähe der Scheibe Inhaber Nylonfäden lokal verformen die Scheibe und das Licht zu blockieren können. Stellen Sie sicher, dass das Interessengebiet flach ist. Entfernen Sie ggf. die Scheibe Inhaber um das Segment zu positionieren und/oder die Slice-Inhaber.
    5. Die Fluoreszenz-Beleuchtung verwenden, um fluoreszierende Microglial Zellen im Bereich abgebildet finden (Belichtungszeit: 250-500 ms).
      Hinweis: Dieser Schritt erlaubt Forschern, die Anwesenheit von Zellen in der Region von Interesse und deren Fluoreszenzintensität zu prüfen und für die Höhe der Zelltrümmer steuern.
    6. Die Pipette mit 10 µL ACFS Hinterfüllung mit ATP, 5-HT oder das Medikament auf die Endkonzentration von Interesse. Zeigen Sie die Spitze nach unten und schütteln Sie die Droge-gefüllte Pipette entfernen Sie eventuell vorhandene Luftbläschen in der Spitze gefangen.
      Hinweis: Wenn die Lösung injiziert werden tendenziell Bläschen bilden, Borosilikat Pipetten mit einem internen Filament in Betracht. Austritt von ATP aus der Pipette kann Mikroglia Prozesse schon vor der Injektion zu gewinnen (in diesem Fall wird es an den Analyseschritt sichtbar sein). Obwohl dies sollte moderat mit der ATP-Konzentration verwendet (500 µmol· L-1), wenn es ein Problem ist, betrachten die Mikropipette mit 2 mL ACFS vor dem Hinzufügen der ATP (oder andere Verbindung) prefilling Lösung bei Schritt 4.2.6.
    7. Montieren Sie die gefüllte Pipette in eine Pipette Halter, verbunden mit transparenten Schlauch an einer 5 mL Spritze mit einem Kolben an der 5 mL-Position positioniert. Die Pipette Halterung selbst ist auf einem dreiachsigen Mikromanipulator montiert.
    8. Verwenden Sie unter Hellfeld Beleuchtung die Mikromanipulator, um die Pipette in der Mitte des Feldes zu positionieren. Zeigen Sie für eine reproduzierbare und optimale Zentrierung an und verwenden Sie der Herrscher auf dem Bild.
    9. Senken Sie die Pipette vorsichtig in Richtung der Scheibe, Steuerung und Anpassung das Ziel zur gleichen Zeit, bis die Pipettenspitze leicht berührt die Oberfläche der Scheibe. Den Abstieg der Pipette zu stoppen, sobald es sichtbar ist, dass die Scheibe berührt wurde die Pipettenspitze, 80-100 µm von der Oberfläche des Segments zu durchdringen kann (siehe Abb. 3 b).
    10. Einstellen des Lasers (siehe die oben genannten Parameter) und das Mikroskop in den multiphoton-Modus zu wechseln. Stellen Sie sicher, dass die Kammer von jeder Lichtquelle (z. B. einem Computer-Bildschirm) abgeschirmt ist. Einschalten der nondescanned Detektoren und des Gewinns. Verwenden Sie eine Lookup-Tabelle (LUT) mit einer farbcodierten Obergrenze um zu vermeiden, die Pixel im Bild zu sättigen.
    11. Bestimmen Sie die Dicke der Scheibe zu abgebildet werden (d. h. den oberen und unteren Z-Positionen, wo Fluoreszenz nachweisbar [in der Regel zwischen 220 und 290 µm insgesamt]).
      Hinweis: An der Oberfläche der Scheibe ist eine erhöhte Dichte von Prozessen und möglicherweise der Mikroglia, oft mit einer ungewöhnlichen Morphologie, im Vergleich mit der Innenseite der Scheibe. Diese Ansammlung wird deutlicher, mit der Zeit (dh., sichtbarer in den letzten als in der ersten Gehirn Slice abgebildet werden). Daher Z-Flugzeuge in den ersten ~ 30 µm sollten nicht für die Analyse verwendet werden und können auch für den Erwerb übersprungen werden.
    12. Starten Sie die Aufnahme einer Gesamtdauer von 30 min (oder mehr wenn gewünscht) und nach 5 min Basislinie vor Ort gelten Sie die Verbindung getestet werden (ohne Unterbrechung der Bildgebung). Um dies zu tun, drücken Sie langsam den Kolben der Spritze angeschlossen an die Mikropipette von 5 mL auf 1 mL (ca. 5 s). Widerstand, wenn den Kolben drücken muss sofort spürbar. Wenn dies nicht der Fall ist, die Spitze gebrochen werden könnte.
      Hinweis: Für einen ausgebildeten Experimentator die Injektionen mit dieser Methode sind reproduzierbar, aber alternativ auf die manuelle Manipulation einer Spritze, die Pipette auf eine automatisierte Druck-Auswurf-System ermöglicht eine bessere Kontrolle über die Lautstärke geliefert verknüpft werden könnte. Die Injektion schafft eine körperliche Verzerrung des Segments an der Injektionsstelle. Diese Verzerrung ist sichtbar Nachhinein in den ersten zwei oder drei Bilder nach der Injektion sollte jedoch nicht auf dem vierten Bild (d. h. 8 min nach der Injektion) sichtbar. Wenn es anhält, in Erwägung die Parameter für die Vorbereitung der Pipette.
    13. Am Ende des Erwerbs (30 min) verwerfen Sie die Mikropipette und entfernen Sie der Scheibe zu. Falls gewünscht, beheben Sie die Scheibe für weitere Immunolabeling. Zum Beispiel die SNAPSHOT-Methode ist optimiert für die Fixierung und Färbung der dicke Scheiben23.
    14. Vor dem Start zum Bild eines neuen Slices, 2D Film (Abschnitt 5.1) zu machen, um zu überprüfen, dass Mikroglia haben eine normale Morphologie und bewegen und damit, dass die Scheiben gesund sind.

5. Analyse der Attraktion der Mikroglia Prozesse

  1. 2D Projektion und Drift-Korrektur
    1. Öffnen Sie die Datei (. LIF) mit Fidschi24.
    2. Wenn nötig, machen Sie eine Substack (Bild/Stapel/Tools/Make Substack) nur die Z-Flugzeuge von Interesse. Zum Beispiel ausschließen, die Z-Ebenen entsprechend an die Oberfläche der Scheibe, wenn sie erworben wurden, aber nicht für die Analyse verwendet werden sollen (siehe Hinweis nach Schritt 4.2.11) und den tiefsten Z-Ebenen mit keine Fluoreszenz. Der letzte Stapel enthält in der Regel 90-110 Z-Scheiben (180-220 µm).
    3. Starten Sie die Funktion Z Projekt (Bild/Stapel/Z Projekt") und wählen Sie den Projektionstyp Max Intensität zu den Projektionen des Z-Stack zu jedem Zeitpunkt erworben.
    4. Starten Sie das MultiStackReg -Plugin (Plugin/Registrierung/MultiStackReg), Auswahl Aktion 1: richten Sie und Transformation: Rigid Body leichte Abweichungen zu korrigieren, die beim Erwerb stattgefunden haben kann. Speichern Sie diese 2D Film als eine neue Datei (.TIF).
  2. Datenverarbeitung
    1. Öffnen Sie diese neue Datei mit eisigen25.
    2. Zeichnen einer kreisförmigen R1 -Region of Interest (ROI) von 35 µm im Durchmesser, zentriert auf die Injektionsstelle (gekennzeichnet vor allem durch den Schatten von der Pipette und die Verzerrung erstellt zum Zeitpunkt der Injektion).
    3. Verwenden Sie das Plugin ROI Intensität Evolution und Messen Sie die mittlere Intensität im Laufe der Zeit in R1.
    4. Speichern Sie die Ergebnisse ein. XLS-Datei.
  3. Quantifizierung und Darstellung der Ergebnisse
    1. Zur Quantifizierung der Mikroglia Antwort im Laufe der Zeit zu bestimmen, zu jedem Zeitpunkt
      Equation
      Here,'R1(0) ist der Mittelwert der R1(t) Werte vor der Injektion. Dann die Ergebnisse als eine kinetische der Mikroglia Antwort dargestellt werden können, oder zu einem bestimmten Zeitpunkt zeigen (siehe Abbildung 7).

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Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum auslösen, zu beobachten und zu quantifizieren das orientierte Wachstum der Mikroglia Prozesse in Richtung einer lokal applizierten Verbindung, z. B. ATP oder 5-HT, in akuten Gehirn Scheiben von Jugendlichen oder Erwachsenen (mindestens bis zu zwei Monate alten) Mäuse. Zu den Faktoren, die zur Aufrechterhaltung Hirnschnitten von erwachsenen Tieren in einem gesunden Zustand für mehrere Stunden ist die Verwendung von zwei Tools zur Optimierung der Zelle überleben nur zwei Schritte des Protokolls. Erstens verbessert die Schnittstelle Stück Halter in der Schnittstelle Kammer (Abbildung 1) die Erhaltung der Scheiben nach dem Schneiden. Zweitens hat die Aufnahme Kammer (Abbildung 2) eine Perfusion System ermöglicht der ACFS am oberen und am unteren Rand der Scheibe während der Bildgebung zu laufen. Hier verwendeten Aufnahme-Kammer-Dimensionen sollen standard Mikroskope zu passen, wie sie ähnlich wie bei klassischen Bad Kammer Einsätze (mit einem 62 mm Außendurchmesser sind), wie ihre Modelle zum Download aus dem Zusatzmaterial, das Design kann jedoch in Scheibe Inhaber anderer Dimensionen angepasst. Zu beachten ist, dass jede Kammer der Versammlung, ohne Kleber, perfekt passende zweiteilig, mit Polyamid Gewebe erstreckte sich zwischen ihnen besteht.

Um ATP oder 5-HT in einem kleinen Gebiet liefern und induzieren eine lokale Reaktion der Mikroglia, wird eine Pipette, mit der Verbindung (sichtbar in Abbildung 2D) mit seiner Spitze auf der Oberseite der Scheibe platziert. Bei den ersten versuchen kann es hilfreich sein, die Lösung eine Leuchtstofffärbung hinzufügen, um die Position der Pipettenspitze auf den Bildern zu visualisieren, die mit der zwei-Photonen-Mikroskop (Abb. 3A) erworben werden. In Abbildung 3 bist es sichtbar, dass obwohl der Experimentator die Pipette Abstieg gestoppt, sobald seine Spitze berührte und die Slice-Oberfläche auf das Hellfeld Bild des Computerbildschirms verformt, seine dünne Extremitäten leicht in das Gewebe bis zu 80 eingegeben- 100 µm von der Oberfläche. Es ist wichtig, dass die Pipette nicht zu oberflächlich ist, weil es kann nicht die Lösung korrekt auf die Zellen zu liefern, noch geben Sie zu tief, da es eine Region erreichen kann, wo das Fluoreszenzsignal zu schwach ist. Die Parameter, die die Tiefe erreicht durch die Pipettenspitze beeinflussen können sind die Winkel der Pipette, die mit den dreiachsigen Mikromanipulator und die Pipette Mund Durchmesser eingestellt werden kann.

Beachten Sie, dass mit der Projektion auf die Y-Achse (Abb. 3 b), es möglich ist, zu beobachten, dass die Fluoreszenz stärker in der oberen als im unteren Teil der Scheibe ist. Dies ist sowohl die progressive Abstumpfung des Signals innerhalb der Scheibe und die Tatsache, die dass Prozesse der Mikroglia die oberflächlichen Schichten der Scheibe und manche Zellkörpern neigen, in Richtung zur Oberfläche zu migrieren. Infolgedessen könnte Mikroglia in den oberflächlichen Schichten des Segments zeigen eine unterschiedliche Morphologie als jene im Inneren der Scheibe, die darauf hinweist, dass sie nicht im gleichen Zustand sind, und unterschiedlich auf die Stimulation reagieren können. So kann oberflächlich Mikroglia-Aktivierung in der Z-Projektion, die Antwort von unten Mikroglia Maske. Darüber hinaus ist die Oberfläche oft geneigt, und die ersten Z-Bilder der Stacks sind lückenhaft. Daher wird empfohlen, für eine bessere Genauigkeit, die oberflächlichste Z-Flugzeuge aus der Z-Projektion und Analyse auszuschließen. Jedoch als verändert, Mikroglia Morphologie und das Vorhandensein von Schutt in den oberflächlichen Schichten sind Indikatoren für den Zustand der Scheibe, es kann interessant sein, die volle Tiefe eines Segments zu seinen Status im Nachhinein überprüfen Bild. Dies kann besonders hilfreich, um neue Experimentatoren, die nicht leicht abnorme Mikroglia oder Schmutz aus einzelnen Z-Ebenen erkennen kann. Die Z-Flugzeuge in den ersten 30 µm genommen werden dann bei der Z-Projektion Schritt (Schritt 5.1.2 des Protokolls) ausgeschlossen werden.

Sobald die Scheibe mit der Verbindung von Interesse behandelt und aufgenommen wurde, abgebildet der Serie Z-Flugzeuge (mit Ausnahme der ersten 30 µm, wie oben beschrieben) an jedem Punkt entlang der z-Achse um einen 2D Film Z-Projektion Bilder projiziert werden. Zu beachten ist, dass in dem hier vorgestellten Protokoll die Dicke für die max Z-Projektion verwendet die Z-Scheiben umfasst wo Fluoreszenz sichtbar ist (in der Regel 180-220 µm, siehe Schritt 5.1.2 des Protokolls). Daher haben Abweichungen in der absoluten Anzahl der Z-Scheiben keine Auswirkungen auf die Quantifizierung der Antwort. Im Gegensatz dazu verwenden einige Studien dünner Z-Stapel (40-60 µm) für Z-Projektion6,7,11,27. Dies ist eine weitere Option, die kommt mit dem Risiko ausschließen einige Z-Scheiben, die eine Reaktion zeigen, wie wir beobachten, dass der Lockstoff-Effekt bis zu 70 µm (in Z) Weg von der Pipettenspitze in einigen Experimenten zu sehen war. Wenn die dünnere Option bevorzugt wird, ist es, so entscheidend für die Mitte der Z-Stapel auf die Pipette Tipp in Z, und wichtiger, nur Z-Projektionen auf die gleiche Weise getan (d. h., alle fluoreszierende Z-Scheiben oder verwenden einen dünnen Z-Stapel) verglichen werden können.

Eine R1-Region von Interesse ist dann für die Quantitative Analyse definiert. Abbildung 4 zeigt einen ROI auf eine Z-Projektion. Die roten gestrichelten Linien repräsentieren die vermeintliche Position der Pipette. Der gelbe Kreis ist R1, mit Icy gezeichnet und auf die vermeintlichen Spitze der Pipette zentriert. Wichtig ist, haben wir beobachtet, dass eine deutliche Variabilität bei der Quantifizierung von der Lokalisierung des R1-ROI, entstand deren Abhandenkommen zu einer Unterschätzung der Antwort führt. Um Positionierung den ROI auf dem Gelände der Lieferung, empfehlen wir die Herrscher in der Datenerfassungs-Software anzeigen, wenn die Pipette in das Hellfeld Positionierung um die Pipettenspitze stellen immer in der gleichen zentralen XY-Position im Feld abgebildet werden. Dies liefert einen Hinweis darauf, wo später den ROI in der Z-Projektion der Fluoreszenzbilder positionieren. Jedoch werden der letzte Tipp-Position und damit den tatsächlichen Ort der Lieferung etwas von dieser zentralen Position, abhängig von der Tiefe erreicht durch die Pipettenspitze verlagert werden. Aus diesem Grund auf Position R1, berücksichtigen wir drei weitere Kriterien: (i) R1 muss an der Spitze der Pipette, die Position von denen ist abgeleitet von dem dunklen Hintergrund in der rechten unteren Ecke (Ii) es sollte den Bereich entspricht, wo eine transiente Verzerrung des Gewebes tritt auf, wenn die Substanz injiziert, und (Ii) es zum Bereich entsprechen soll, wo eine lokale Reaktion (falls vorhanden) wird beobachtet. Wenn dies nicht ausreicht, um mit guter Genauigkeit der Zählpunkt zu finden ist, hilft die Pipette mit einer fluoreszierenden Substanz füllen. Nach R1, wir laufen den Film erneut, um sicherzustellen, dass es gut, zu allen Zeitpunkten positioniert ist und es gibt keine aberrante Drift, Verzerrung oder Artefakt Fluoreszenz zu jedem Zeitpunkt gezogen haben könnte die Quantifizierung bias. Der Film entsprechend Abbildung 4und zur Veranschaulichung der Wirkung von ATP Anwendung finden Sie im Zusatzmaterial (Film S1).

Wir haben zunächst die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse in Richtung ATP oder 5-HT in den Thalamus P11 Mäuse15. Diese Experimente wurden in jüngerer Zeit, wiederholt in Scheiben aus vier Tage bis zwei Monate alte Mäuse, und in verschiedenen Regionen (z. B. Abbildung 3 entspricht einer Aufnahme im Hippocampus). Wir verwendeten meist drei bis vier Wochen alten Mäusen, verbindet die Vorteile einer ausgereiften Gehirn-mit Reife und verzweigten Mikroglia-mit ein gutes Stück Lebensfähigkeit. Vor allem repräsentativen Zustand Normal Mikroglia zeichnen sich durch eine kleine Soma, lange Prozesse mit kleinen Klemmen und ständig in Bewegung Prozesse in den Ausgangszustand. In der Regel unverändert in Scheiben von 18 auf 30 Tage alte Mäuse, die Mikroglia Morphologie meist für bis zu 6 h nach der Slice-Vorbereitung. Für Scheiben von älteren Mäusen (zwei Monate) ist die Fähigkeit, die Scheiben in einen physiologischen Zustand aufrechtzuerhalten reduziert (~ 4 h). Beispiele der Mikroglia Richtung Motilität in dem Thalamus, in Reaktion auf die 5-HT in einer Scheibe von einer 20-Tag-alte Maus und ATP in ein Stück aus einer zwei-Monats-alte Maus in Abbildung 5. Der Film entspricht der 5-HT-Anwendungdes in Abbildung 5 finden Sie im Zusatzmaterial (Film S2).

Abbildung 6 zeigt zwei suboptimale Experimente, die auf Scheiben, die länger als 6 h in ACFS gehalten, bevor sie abgebildet waren (nur mal 0 angezeigt werden). Beachten Sie in Abbildung 6Adie Anwesenheit von Mikroglia mit mehreren kurzen Prozessen oder mit erweiterten Terminals erinnert an Neurit Wachstum Kegel und das Vorhandensein von vielen fluoreszierende Zellenrückstand oder Partikel. Diese sehr fluoreszierende Elemente bleiben unbeweglich oder zufällig während der Bildgebung, die darauf hinweist, dass sie nicht zu "Leben" Mikroglia gehören zu bewegen (siehe Film S3 in das ergänzende Material). Zu beachten ist, dass in diesem speziellen Beispiel Mikroglia waren ständig ihre Umgebung scannen, aber ihre Morphologie wurde so geändert, dass sie nicht als in einem physiologischen Zustand angesehen werden könnten. Darüber hinaus hätte die große Menge der Ablagerungen die Fluoreszenzanalyse schlecht zuverlässige. Abbildung 6 b zeigt das Vorhandensein von Mikroglia mit großen und flachen Zellkörper oder Vorsprünge, die manchmal auf die oberflächlichen Schichten der Scheiben gefunden werden können, die immer mehrere Stunden, bevor sie abgebildet waren. Nur haben oberflächliche Z-Positionen verwendet worden, um diese Z-Projektion zu machen. Abbildung 6 ist ein Substack, an tiefer Z-Positionen, von der gleichen Gehirn-Scheibe wie in Abbildung 6dargestellt. Obwohl sie nicht an der Oberfläche positioniert, diese Mikroglia haben einen abnormen "buschigen" Aspekt. Durch den Aspekt der Mikroglia wurden die Filme entspricht diese zwei Scheiben nicht zur Quantifizierung verwendet.

Nach dem Extrahieren der Daten aus der 2D-Filmen, können die Ergebnisse durch Plotten normalisierte R(t) Fluoreszenz im Laufe der Zeit dargestellt werden. Ein Diagramm fasst mehrere Experimente wird in Abbildung 7A, präsentiert, um die Variabilität der Antworten zeigen. Anmerkung, die die Fluoreszenz sofort aber vorübergehend (in den ersten drei Bildern) nach der Injektion durch Gewebe Verzerrung abnimmt (d.h. Die Flüssigkeitseinspritzung mit der Pipette vorübergehend drückt das Gewebe entfernt und dann erhöht). Die Variabilität in der Reaktion auf ATP veranschaulicht die Tatsache, dass selbst wenn Scheiben mit bewegliche und verzweigte Mikroglia ebenso gesund aussehen, sie nicht in der gleichen Weise reagieren (aber alle von ihnen reagieren). Auf intrinsische Probe Heterogenität gibt es einige Lockerheit in die R1-Positionierung, wie oben erwähnt, und auch einen Einfluss, z. B. Unterschiede in der Lautstärke der Lösung die geliefert wird kann nicht ausgeschlossen werden. Um kleine Effekte oder Abweichungen zu erkennen, kann es daher interessant, eine automatische Vorrichtung für die zusammengesetzte Injektion zu verwenden sein.

Abbildung 7 b zeigt, wie die Größe des ROI auch die Quantifizierung, hier des Wachstums des ATP-induzierten Prozesse auswirkt. Erhöht den Durchmesser von 35 (der Durchmesser in Abbildung 7A und für alle hier vorgestellten Analysen verwendet), 50 oder 70 µm reduziert die Variabilität unter Experimente (Scheiben) durch das Problem der kleinen R1 Positionierung zu unterdrücken. Es verringert sich jedoch auch um Genauigkeit und den Umfang der gefundenen Antwort. In der Tat, mit größeren ROIs, gibt es weitere Hintergrundinformationen durch Prozesse oder Zellkörper, die nicht durch die Behandlung beeinträchtigt, und eine Wachstum von Prozessen kann werden teilweise abgestumpft durch die damit einhergehende Retraktion der Mikroglia Filialen weiter entfernt von der Pipette aber dennoch im Inneren des ROI. Zusammenfassend kann es für ROIs mit einem anderen Durchmesser Kreis als ein verwenden, 35 µm ist, relevant, aber es ist von grundlegender Bedeutung, dass der ROI ist immer das gleiche in den Datensätzen verglichen werden.

Abbildung 7 zeigt den Mittelwert ± SEM für mehrere Experimente mit ACFS, ATP oder 5-HT. Die Wirkung von ATP ist in der gleichen Größenordnung wie denen, die durch andere Gruppen mit einer ähnlichen Methode in-vivo (0,5 nach Davalos Et Al.3 und 0,4 nach Haynes Et Al.13) und in Scheiben schneiden (0,8 Wenn normalisiert wie hier getan wird nach Dissing Olesen Et Al.5und 0,6 nach Pagani Et Al.28). Auf der einen Seite Unterschiede können kommen aus biologischer Parameter, wie die Scheibe Vorbereitung Methode, die Menge von ATP injiziert, das Alter der Maus oder der Hirnregion verwendet und auf der anderen Seite von Analyseparameter, wie der Durchmesser des ROI und der Dicke der Z-Stapel für die Z-Projektion (d. h. die ganze Dicke wo Fluoreszenz erkannt wird oder nur die 40-60 µm um die Pipettenspitze, wo die maximale Antwort erwartet wird) verwendet.

In Abbildung 7ist die ACFS Injektion die negativ-Kontrolle, zu prüfen, dass lokale Injektion und der Druck der Pipette nicht zu eine Verletzung führen, die Mikroglia Prozesse gewinnen kann. Darüber hinaus ermöglicht die ACFS Kontrolle Forscher zu prüfen, ob im Laufe der Zeit gibt es keine Immunofluoreszenz. Immunofluoreszenz, das Photon-induzierten Zerstörung des fluoreszierenden Proteinen oder Fluorophore, würde in der Tat eine fortschreitende Abnahme der Fluoreszenz im Laufe der Zeit induziert. Wie es Messungen beeinflussen kann, ist es wichtig, konsequent zu prüfen, ob in der experimentellen Bedingungen gibt es keine Immunofluoreszenz. Um dies zu tun, es empfiehlt sich, eine XYZT-Serie auf eine Scheibe mit GFP exprimierenden Mikroglia, für 30 min zu erwerben (ACFS injiziert werden kann, aber eigentlich braucht man keine Stimulation), mit der Erregung und Erwerb Parameter wie in den experimentellen Bedingungen. Dann wird eine quantitative Messung der Fluoreszenz im Laufe der Zeit in verschiedenen Regionen von Interesse, einschließlich Mikroglia Zellkörper oder Prozesse, offenbaren, wenn gibt es ein allmählicher Verlust in Emissionsintensität, in der Regel eine exponentielle Zerfall, Immunofluoreszenz angibt. Wenn dies der Fall ist, können einige Anpassungen durchgeführt werden: eine Neuausrichtung des Lasers, eine Reduzierung der Laserleistung und eine Erhöhung des Detektors zu gewinnen, eine Verringerung der Anzahl der Z-Ebenen und eine Erhöhung des Intervalls zwischen ihnen, Beleuchtung zu begrenzen. Immunofluoreszenz wird begünstigt durch Hochleistungs- oder lange (ex: Beleuchtung für durchschnittlich Zeile wiederholt) Erregung; so müssen Forscher Aufmerksamkeit zu schenken, wenn eine nachhaltige Beleuchtung verwendet wird, um Zellen mit niedrigen Fluoreszenz image.

Nach der lokalen Injektion von ATP oder 5-HT ist ein Anstieg der Fluoreszenz in R1, die ein Plateau (Abbildung 7) erreicht. Neben der Kinetik kann es interessant sein, die Attraktion bei einem stabilen Endpunkt zu vergleichen sein. Hier, wir entschieden uns für die Mikroglia Antwort bei t = 26 min. (d.h. 20 Minuten nach der Injektion) in Abbildung 7. Dies ist nützlich, um statistisch Verbindungen vergleichen oder die Wirkung des Antagonisten zu testen, die in der Badewanne (d. h. in der Perfusion Lösung oder zusammen mit der Verbindung in der Pipette [nicht angezeigt]) hinzugefügt werden können.

Figure 1
Abbildung 1: Schnittstelle Kammer Details. (A) Entwurf für den 3D-Druck des Slice-Inhabers. Der Außendurchmesser des Inhabers ist 7 cm. (B) Schnittstelle Stück Halter mit Nylon-Mesh (Pfeil), das Forscher zu Scheiben an der Air liquide-Schnittstelle ermöglicht. (C) Schnittstelle Kammer Gerät, das macht es möglich, die Scheiben in einer Carbogenated (der Pfeil zeigt den Schlauch Weiterleitung) und feuchte Umgebung zu pflegen, bevor sie abgebildet sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Perfusion Kammer Details. (A) Entwurf für den 3D-Druck. Der Außendurchmesser der Perfusion Kammer beträgt 5,9 cm. (B) die Perfusion Kammer mit Nylon-Mesh (Pfeil), unterstützt die Scheibe, die verhindert, dass die Folie unten berühren und ermöglicht der ACFS fließen über und unter ihm. (C) Bild von der Versammlung auf der zwei-Photonen-Mikroskop. Die Mikropipette die Verbindung vor Ort liefern ist sichtbar auf der rechten Seite (Sternchen). (D) Pipette im Hellfeld abgebildet. Die Maßstabsleiste = 60 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Position der Mikropipette in die Scheibe. Beispiel für eine Übernahme aus einem Stapel von Bildern (im Hippocampus eines 30 Tage alten Tieres) mit einer Mikropipette gefüllt mit Fluorescein (1 µM). Fluorescein macht es möglich, die Pipette (Sternchen) in der max Projektionen entlang (A) die z-Achse oder (B) die y-Achse zu finden. Beachten Sie im Bedienfeld " B ", obwohl schwächer Fluoreszenz, gibt es auch Mikroglia unterhalb der Pipettenspitze. In diesem dargestellten Beispiel wurde die gesamte Infrastruktur, einschließlich die Aufnahmen in den oberflächlichsten Bestandteil des Segments, der Projektionen eingesetzt. Maßstabsleiste = 30 µm in zentrale A und wie angegeben (jede Graduierung = 50 µm) im Bedienfeld " B". Die Z-Dicke des Stacks = 220 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Positionierung der R1, der ROI für die Quantifizierung verwendet. Diese Abbildung zeigt drei experimentellen Zeitpunkte ein Experiment wo ist ATP auf eine Scheibe (aus dem Thalamus ein 20 Tage alten Tier), mit Zeichnungen von der vermeintlichen Ort der Pipette (rote gestrichelte Linie in der ersten Zeitpunkt) und die Abgrenzung der R1 angewendet worden ROI. Maßstabsleiste = 30 µm. Hinweis den dunkleren Bereich in der rechten unteren Ecke, im Schatten der Pipette, die Beleuchtung und Bildgebung behindert entspricht. Beachten Sie auch die kleine Region intensiver Fluoreszenz bei 25 min, die den Speicherort der die Pipettenspitze anzeigt. Die Z-Dicke des Stacks = 220 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Mikroglia Antworten. Antworten auf die lokale Anwendung von 5-HT (5 µM) auf ein Gehirn schneiden Sie von einer 20-Tag-alte Maus (links; die Scheibendicke Z = 220 µm) und ATP (500 µM) auf eine Scheibe von einer zwei-Monats-alte Maus (rechts; die Scheibendicke Z = 220 µm). Die roten gestrichelten Linien stellen die Pipette Position dar. Beide Aufnahmen wurden in den Thalamus durchgeführt, und die oberen 30 µm der Scheiben ausgeschlossen wurden. Die Bilder stammen vor (obere Reihe) und 25 min nach (untere Zeile) die Injektion. Maßstabsleiste = 30 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Beispiele für suboptimale Experimente. Diese Scheiben haben mehr als 6 h vor Bildgebung gewartet und haben seit ihrer oberen Fläche abgebildet worden. (A) Beispiel für einen Z-Stapel mit viel Schutt (etwa rund, fluoreszierenden Partikeln, aber mit unregelmäßige Ränder; Sternchen) und "buschig" Mikroglia (Pfeile), d. h. mit zahlreichen aber kurze Prozesse. Beachten Sie die erweiterten Prozess Terminals (Pfeilspitzen) das axonale Wachstum Kegel aussehen. Die Z-Dicke des Stacks = 220 µm. Die anderen beiden Platten zeigen zwei Sub-Stapel von der gleichen Scheibe, mit (B) 1-30 Z-Ebenen (Z-Dicke = 59 µm) und (C) 30-120 Z-Ebenen (Z-Dicke = 180 µm). Auf den oberen Ebenen (gezeigt im Bedienfeld " B"), neben den großen Terminals und Trümmer wie in Gruppe Asind Mikroglia mit ungewöhnlich großen flachen Körpern oder Vorsprünge (Sterne). Auf den tieferen Ebenen (gezeigt im Bedienfeld " C"), gibt es weder Schmutz noch flache Objekte, aber die Zellen sind buschig (Pfeile) und die Dichte ist ungewöhnlich hoch. Insgesamt zeigen diese Beobachtungen, dass die Mikroglia sind nicht in einem normalen Zustand. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Quantifizierung der Attraktion der Mikroglia Prozesse. (A) Beispiel für eine Reihe von Experimenten mit ATP Variabilität zu veranschaulichen. (B) Auswirkungen der ROI Größe auf die Quantifizierung. Jedes Experiment im Panel angezeigt wurde (ATP Injektion) mit einem ROI von 35, 50 oder 70 µm Durchmesser untersucht. Der Mittelwert ± SEM von Thefluorescence zu jedem Zeitpunkt ist für die verschiedenen ROIs gezeigt. (C) Zusammenfassung der Experimente mit ACFS, 5-HT und ATP. Der ACFS Injektion hat keinen Einfluss auf die Lage der Mikroglia Prozesse. ATP und 5-HT induzieren eine lokalisierte Wachstum der Mikroglia Prozesse auf die Pipette, mit der lokalen Zunahme der Fluoreszenz gemessen. Der Mittelwert ± SEM sind angegeben. (D) Zusammenfassung der Mikroglia Antworten bei t = 20 min Steroidtherapie (26 min vom Beginn der Aufnahme). Der Mittelwert ± SEM sind angegeben. Einfache ANOVA mit Dunnett post Hoc Test dient. p < 0,01 *** p < 0,001 im Vergleich zu der ACFS Injektion. Für ACFS, n = 7; für ATP, n = 8; für 5-HT, n = 6. Diese Experimente wurden durchgeführt in den Thalamus, aber ähnliche Ergebnisse erzielt werden, aus dem Hippocampus oder Kortex. Die Z-Dicke der Stacks verwendet für Z-Projektionen und Quantifizierung = 180-220 µm. Alle Maßnahmen mit Ausnahme der im Bedienfeld " B " sind mit einem 35 µm Durchmesser ROI durchgeführt worden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 1
Film S1: Beispiel für den Effekt einer lokalen ATP (500 µM) Anwendung. Dieses Experiment wurde in den Thalamus ein 20 Tage altes Tier durchgeführt. Bilder von diesem Film wurden für Abbildung 4verwendet. Maßstabsleiste = 30 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)

Movie 2
Film S2: Beispiel für den Effekt einer lokalen 5-HT (5 µM) Anwendung. Dieses Experiment wurde in den Thalamus ein 20 Tage altes Tier durchgeführt. Bilder von diesem Film wurden für Bild 5 (links) verwendet. Maßstabsleiste = 30 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)

Movie 3
Film S3: Beispiel für eine suboptimale Experiment in einer Scheibe, die für mehr als 6 h vor Bildgebung gewartet haben. Beachten Sie die Anwesenheit von zahlreichen Trümmer, die zufällig im Laufe der Zeit verschiebt und die ungewöhnliche Morphologie der Mikroglia. Ein Bild von diesem Film dient als Abbildung 6A. Maßstabsleiste = 30 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)

Ergänzende Datei: Imaging-Kammer und Schnittstelle Aufnahmekammer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Durch die Beibehaltung, anders als in dissoziiert oder organotypischen schneiden Kultur, eine strukturelle Integrität mit begrenzten Anpassungen, akute Gehirnscheiben erlauben Forschern, Mikroglia in ihrer physiologischen Umgebung zu studieren. Eine wichtige Einschränkung ist jedoch die Tatsache, dass die Slice Prozedur Verletzungen erstellt, die schnell die Lebensfähigkeit von Neuronen, besonders im erwachsenen Gehirn beeinträchtigen können. Mikroglia sind besonders reaktiv zu Zellschäden, ist es wichtig, neuronaler Zelltod Mikroglia in der Nähe ihrer physiologischen Zustand zu bewahren so weit wie möglich zu begrenzen. Das trägt wiederum über ein positiver Kreislauf zu einem besseren allgemeinen Zustand des Segments.

Das Protokoll in diesem Artikel beschriebenen gilt mehrere Verbesserungen, die in der Literatur für Elektrophysiologie Experimente, die darauf abzielen, eine bessere Lebensfähigkeit der Scheiben über mehrere Stunden zu erhalten, vor allem von Erwachsenen Mäusen gefunden. Um die altersbedingte Unterschiede bei Slice Lebensfähigkeit zu überwinden, wir ersetzt Natrium mit Cholin und verwendet dieses Cholin-ACFS Medium während der kardialen Perfusion, schneiden und Erholung. Dies bringt die Zelle Excitotoxizität eine minimale29,30. Es sei darauf hingewiesen, dass neben Cholin-ACFS, gibt es viele andere Alternativen ACFS Rezepte, die hochwirksam gegen neuronale Konservierung, wie N-Methyl-D-Glucamine (NMDG)-ACFS31, die auch für Mikroglia Studien interessant sein könnte aber hier nicht getestet wurden. Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist die kardiale Perfusion. Durch die Vorrichtung des Tieres mit einer kalten Cholin-ACFS Lösung, mit niedrigen Na+, niedrige Ca2 +und hohe Mg2 +, einem raschen Absinken der Körpertemperatur wird induziert und die Stoffwechselaktivität der Zellen im Gehirn wird abgesenkt, wodurch die zellulären Stress verursacht durch das Schneiden. In der Tat haben wir beobachtet, dass dieser Ansatz mehr Schutz als einfaches Entfernen das ganze Gehirn und eintauchen in ACFS Lösung angeboten. Inspiriert durch ein Protokoll optimiert für Patch-Clamp und optogenetische Studien29, verwendeten wir auch eine "schützende" Erholungsphase unmittelbar nach der physischen zerteilen, so dass die Scheiben wieder aus dem Trauma des Schneidens für 10 min in Cholin-ACFS bei 32 ° C. Danach wurden die Scheiben in die Oberfläche hält die Kammer für eine zusätzliche Mindestzeit von 30 min zu erholen übertragen. Die Dauer dieser zweiten Erholungsphase nach dem Hirnareal, das Na+ -Ersatz, und das Alter des Tieres optimiert werden könnte, und es sollte mindestens 1 h dauern, wenn Elektrophysiologie parallel mit Bildgebung durchgeführt werden muss.

Die Wartung des Slice in einem gesunden Zustand vor dem Gebrauch und der Perfusion während der Bildgebung sind ebenfalls wichtige Parameter. Die Schnittstelle und die Dual-Perfusion Kammer sind weithin etablierte Werkzeuge in Elektrophysiologie. Zum Beispiel hat die Interface-Methode eingesetzt, um die Lebensfähigkeit des Hippokampus Scheiben seit 199526zu verbessern. Ähnlich wie die Kammern, die hier verwendeten Geräte sind von mehreren Unternehmen vorgeschlagen aber häufig noch nicht für Mikroglia Bildgebung verwendet. Wir haben eine Schnittstelle, die Kammer, wo die Scheiben auf einem Netz lag und auf der Schnittstelle mit einem großen Reservoir der ACFS sind, halten verzögern die zelluläre Verschlechterung der Scheiben während längeren Inkubationszeiten entwickelt. In der Bildgebung Kammer verwendeten wir eine gestaltete doppelseitig Perfusion Kammer ermöglicht erhöhte Sauerstoffversorgung des akuten Slice Vorbereitungen, Aufrechterhaltung der Zellen in einem gesunden Zustand während multiphoton Mikroskopie. Im Gegensatz zu der einzigen Durchblutung kann die doppelte Perfusion der Untergetauchten Scheiben erhöht die Lebensfähigkeit der Zellen, da Sauerstoff sowie andere Materialien frei und effektiv mit hohem Durchsatz von beiden Seiten deutlich dicke Scheiben diffundieren.

Dieses Protokoll richtet sich an die globale Lockstoff Wirkung von ATP oder andere Verbindungen auf Mikroglia Prozesse zu quantifizieren, und seine Quantifizierungsmethode basiert auf die man früher in Davalos Et Al.3. Es ist möglich, andere Arten der Analyse durchführen. Zum Beispiel ist eine alternative Methode, erfordert weitere Aktionen der Experimentator für die Bildanalyse aber hängt nicht von der Fluoreszenz-Ebene der Mikroglia-Prozesse, die Reduktion des leeren Raumes um die Pipettenspitze nach Verbindung messen Anwendung11,32. Es ist auch möglich, die Bewegung der Spitze der einzelnen Mikroglia Prozesse15,28zu verfolgen.

Darüber hinaus kann die isotrope Motilität oder Überwachung der Mikroglia auch in basalen Zustand oder nach Bad Anwendung von Verbindungen des Interesses auf die Scheiben, die mit diesem Protokoll vorbereitet registriert werden. Um die schnellen ein- und Ausfahren Preise der Mikroglia Prozesse zu quantifizieren und Variationsmöglichkeiten zu erkennen, wäre es jedoch für die Übernahme-Frequenz zu erhöhen. Z. B. Pagani Et Al. Verwenden einer Frequenz von einem Bild alle 10 s28.

Schließlich beschrieben den letzten Veröffentlichungen Methoden zur Quantifizierung von morphologischen Veränderungen oder die Beweglichkeit der einzelnen Prozesse in drei Dimensionen. Für solche Analysen obwohl ein Z-Step-Intervall von 2 µm für einige Programme27 reicht, erfordern andere eine bessere axiale Auflösung (d.h., ein Z-Schritt von 0,4 µm gemäß Heindl Et Al.33.

Hier zeigten wir Experimente an Wildtyp Mäusen mit endogenen Ausdruck der GFP in Mikroglia und eine mechanische Anwendung von Verbindungen, aber dieses Protokoll lässt sich anpassen an andere fluoreszierende Reporter Proteine in Mikroglia, wie YFP18oder an die exogene Kennzeichnung der Mikroglia mit fluoreszierenden Isolectin11,34. Schließlich haben wir den Auswuchs der Mikroglia Prozesse in Richtung einer lokalen Anwendung von ATP oder 5-HT in einer normalen Umgebung von Wildtyp studiert, aber dieses Protokolls genutzt werden, um andere Verbindungen, andere Arten der Stimulation (z. B. Käfig Verbindungen), testen und testen wie direktionale Motilität wird durch Mutationen, pharmakologische Wirkstoffe oder pathologischen Zusammenhänge beeinflusst.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken der Zelle und Gewebe Imaging Facility des Institut du Fer À Moulin, wo alle Bildaufnahme und Analysen durchgeführt wurden. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch das Centre National De La Recherche Scientifique, Institut National De La Santé et De La Recherche Médicale, Université Sorbonne Wissenschaften, und durch Zuschüsse von Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie-Universität () Emergence-UPMC Programm 2011/2014), die Fondation pour la Recherche Sur le Cerveau, Fondation de France, die Fondation pour la Recherche Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", dem französischen Forschungsministerium (Agence Nationale Pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 und des Investissements Avenir Programm "Bio-Psy Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) und Kooperationsforschung in Computational Neuroscience Programm, National Science Foundation/Französisch National Agency for Research (Nummer: 1515686). Alles, was die Autoren angehören, um Forschung Gruppen, die Mitglieder der Paris School of Neuroscience (ENP) und der Bio-Psy Labex sind. Z.B. ist ein Ph.d. Student angegliedert Sorbonne Université, Collège Doktoranden, F-75005 Paris, Frankreich, und wird durch die Bio-Psy Labex finanziert. Caracterización ist ein Post-Doktorand geförderten Sonderforschungsbereichs Computational Neuroscience Programm, National Science Foundation/Französisch National Agency for Research (Nummer: 1515686). Die Autoren danken Marta Kolodziejczak, die bei der Initiierung des Projekts teilgenommen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
for pipettes preparation
Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries Harvard Apparatus 30-0065 Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225
DMZ Universal Puller Zeitz Instrumente
Name Company Catalog Number Comments
for solutions
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
D-(+)-Glucose Sigma G8270
L-Ascorbic acid Sigma A5960
Magnesium Chloride solution 1 M (MgCl2) Sigma 63020
Potassium chloride SigmaUltra >99.0% (KCl) Sigma P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
Sodium Chloride (NaCl) Sigma S5886
Sodium phosphate monobasic Sigma S5011
Sodium pyruvate Sigma P2256
Ultrapure water MilliQ for all the solutions
Name Company Catalog Number Comments
for slice preparation
2x 200 mL crystalizing dishes
80 mL Pyrex beaker
Antlia-3C Digital Peristaltic pump DD Biolab 178961 For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF)
Carbogen 5% CO2/95% O2 Air Liquide France Industrie
Dolethal Vetoquinol Dolethal 50 mg/mL
Filter papers (Whatman) Sigma WHA1001042 Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM)
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-60
Food box 10 cm diameter, 8 cm Height
glue (ethyl cyanoacrylate) Loctite super glue 3 power flex
Hippocampal Tool (spatula) Fine Science Tools 10099-15 The largest extremity has to be angled at 90°
Ice
Iris Forceps (curved) Moria MC31
Lens cleaning tissue THOR LABS
Nylon mesh strainer diameter 7 cm
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 For the slicer
scalpel blade
Slice interface holder home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material
Surgical Scissors - Sharp Fine Science Tools 14002-14
Vibrating slicer Thermo Scientific 720-2709 Model: HM 650V (Vibrating blade microtome)
Water bath Set at 32 °C (first recovery step)
Name Company Catalog Number Comments
for slice imaging
× 25 0.95 NA water-immersion objective Leica Microsystems (Germany) HCX Irapo
2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors Leica Microsystems (Germany)
Antlia-3C Digital Peristaltic pump DD Biolab 178961 For 2-photon chamber perfusion with aCSF
Carbogen 5% CO2/95% O2 Air Liquide France Industrie I1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser Coherent (Germany)
disposable transfer pipettes , wide mouth ThermoFischer scientific for example : 232-11 5.8 mL with fin tip, but we cut it (approx 7 cm) to have a 4 mm diameter mouth
emission filter SP680 Leica Microsystems (Germany)
fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) Leica Microsystems (Germany)
glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice
Heating system Warner Instrument Corporation Automatic Heater Controller TC-324B to maintain perfusion solution at 32 °C
perfusion chamber home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material
slice holder ("harp") home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads
Name Company Catalog Number Comments
for slice stimulation
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A-26209 to be prepared ex-temporaneously : 1 mg/mL (3 mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4 °C (a few hours) and diluted just before use
Fluorescein (optional) Sigma F-6377 use at 1 µM final
Micromanipulator Luigs and Neumann SM7 connected to the micropipette holde
Micropipette holder same as for eletrophysiology
Serotonin hydrochloride Sigma H-9523 aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20 °C. 500 µM solution prepared the day of the experiment.
Syringe 5 mL (without needle) Terumo medical products SS+05S1
Transparent tubing Fischer Scientific 11750105 Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing
Name Company Catalog Number Comments
for image analysis
Fiji https://fiji.sc Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038
Icy Institut Pasteur http://icy.bioimageanalysis.org de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)
Name Company Catalog Number Comments
mice
CX3CR1-GFP mice Jung et al, 2000 male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.
CX3CR1creER-YFP mice Parkhurst et al 2013 male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.

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References

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Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben
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Etienne, F., Mastrolia, V., Maroteaux, L., Girault, J. A., Gervasi, N., Roumier, A. Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (143), e58788, doi:10.3791/58788 (2019).

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