Summary
ここでは、ex vivo 血管反応性定量分離、加圧、齧歯動物中間の大脳動脈 (MCA) セグメントを使用してプライマリ爆発外傷性脳損傷 (bTBI)、次の方法について説明するためのプロトコルを提案する.bTBI 誘導は、衝撃波管として知られている高度なブラスト シミュレータ (ABS) のデバイスを使用して行われます。
Abstract
爆発の露出の病理組織学的および行動効果の研究がずっとある、けれども、少ないはブラストの脳血管作用する専用されています。衝撃 (すなわち,非-ブラスト) 外傷性脳損傷 (TBI) は、ヒトと実験動物における脳血管の圧力自己調節を減少する知られています。した爆発による外傷性脳損傷 (bTBI)、TBI に影響を与えるような結果障害脳血管反応性の仮説は、齧歯動物中間の大脳動脈 (MCA) の血管内減圧に筋の引き延ばし応答を測定することによってテストされました。高度なブラスト シミュレータ (ABS) ショック チューブを使用して軽度の bTBI を受けるラットからセグメント。アダルト, 雄ラットだった麻酔、挿管、換気、偽 bTBI (同じ操作と爆風損傷を除いて麻酔) または穏やかな bTBI のために準備します。ラットは無作為に偽 bTBI または犠牲 30 または 60 分後損傷が続く穏やかな bTBI を受け取る。BTBI 後すぐに立ち直り反射 (RR) 抑制時間が評価した時間ポイントの受傷後に安楽死が完成した脳が収穫された、個々 の MCA セグメントされた収集、マウントおよび加圧します。動脈セグメントを介して灌流内圧は 20 mmHg に 100 から 20 mmHg 単位で減少したと MCA の直径を測定し、記録.小さい MCA 直径着実に大きく偽 bTBI グループの基準上 MCA 散大応答が有意に抑制された (p < 0.05) 両方の bTBI グループ、障害によって立証されるように内圧を減少MCA の直径は、bTBI グループの記録。さらに、bTBI グループで RR 抑制が有意 (p < 0.05) シャム bTBI グループよりも高い。MCA の収集された偽 bTBI から大幅展示 bTBI 以下の MCA の収集中の内圧の減少する展示の一般的な血管拡張プロパティが減少する筋原性血管拡張反応を障害者グループの圧力bTBI 後、少なくとも 60 分間保持されます。
Introduction
影響 (つまり,非-ブラスト) TBI、爆風による外傷性脳損傷 (bTBI) 脳血管障害1に関連付けられている、障害に起因するものに類似した出現する脳血管の代償反応が好き二酸化炭素 (パコ2)2,の3、4と酸素 (パオ2) の5の分圧の変化。さらに、爆発の露出は動物6と bTBI 患者7,8の脳動脈の血管攣縮を起こしています。臨床の TBI9と流体打楽器の傷害 (FPI)10、11,12は動脈血圧の変化に対する障害脳血管反応に関連付けられている間 (すなわち,自己調節を圧力)9,10、11,12bTBI が脳血管圧自己調節能力に及ぼす影響に関する不確実性が残る。
連続的な酸素と代謝活性の高い脳13,14,15に配信される栄養の供給を維持する目的で全身動脈圧の変化に反応する脳循環 16。恒常性のユニークなタイプは、「器官は、血圧 (血流) やその他の生理学的または病理学的刺激の変化にかかわらず一定の血流を保持して"は、自己調節17,18,19に発生します20. 脳動脈が収縮したり、血圧、一酸化窒素 (NO)、血液粘度、パコ2パオ2等4,11,16,の変化に反応して膨張21. 動脈筋応答はそのような収縮や膨張を指します。灌流圧が減少した場合、ベイリス22と、脳血流の自己調節に貢献する主要なメカニズムによって最初に説明された筋の血管反応は灌流圧を増加させる場合は血管収縮と血管拡張によって特徴付けられる14,17. この血管反応は伸縮への対応や内腔や壁張力23,24,の変化 (血管平滑筋細胞など、細胞の) 収縮組織の固有能力25,26,27,28,29。動脈が引き伸ばされます (例,血管内の圧力の間に増加する)、細胞の収縮24,25,26,28。
抵抗血管を調べる研究前のヴィヴォ一般的を採用している分離抵抗血管の薬理学的・生理学的特性をテストするための 2 つの方法の 1 つ: リング マウント法と ● キャニュレイテッド、加圧法。リングに取り付けられた容器の製法には、血管を介して intraluminally を渡された場所でセグメントを保持する 2 本のワイヤーが含まれます。細胞の刺激を測定尺持続的な線に適用されるフォースの量を測定します。ただし、この手法を特定の予約, 内腔の内皮層に支えられてワイヤーがそれを通して渡されるとき最も顕著な必然的な損害それを運ぶ30とセグメントを分離によって持続的なストレッチの度合いターンでは、容器の壁の膨満、最終的に薬理学的エージェント31船の感度に影響を与えるに します。● キャニュレイテッド、加圧容器の準備方法は、それぞれの家の中間の大脳動脈 (MCA) の配置が 1 つの動物から収穫 2 つの別々 の部屋で構成されています、によりを利用しています。マイクロ ピペットは、セグメントの各端に挿入されるセグメントの近位端を縫合糸でピペットを固定、内腔は血液やその他の物質を排除するために (PSS) 生理食塩水で灌流そっと。遠位端は縫合を確保します。上記の各セグメントが他32,33,34,35 に関してさまざまな高さで適切な高さに各ピペットに接続されている 2 つの貯水池を上げることによって貫または管腔内圧が設定されて ,36。貯水池やマイクロ ピペットに沿って配置圧力トランスデューサー血流モニター、ビデオカメラ、外部の測定を可能にするスケーラー倒立顕微鏡を用いて血管を拡大される間圧力測定を提供します。MCA の直径。両方の方法は、貴重な ● キャニュレイテッド、加圧容器の準備方法をより模倣し、許可船調査の生体内での条件32,37に近い位置に。
衝撃 (すなわち,非-ブラスト) 脳血管反応の TBI は以前脳動脈セグメント21,35,36,38で研究されているさまざまな種類の効果。容器収集、取付および前述の現在の研究では血流の ex vivo MCA プロトコルと同様を使用して、以前の研究脳血管系障害の関連のメカニズムに彼らのそれぞれの調査で成功を得られるTBI に続きます。ゴールディングら34アダルト、オス ロング ・ ラット MCA の次の制御された皮質衝撃 (CCI) 傷害によって厳しい TBI の内皮を介した不整を検討しました。2 番目の研究、ゴールディングら36持続軽度 CCI ラットから MCA を収穫後低血圧または CO2脳血管反応性を検討しました。Yu ら38への緩慢な応答を改善パーオキシ ナイト ライト スカベン ジャーがマシューら21筋レスポンスを勉強している間、FPI を受ける大人、男性の Sprague-dawley ラット MCA セグメントで血管内減圧するかどうかを分析MCA の低血圧は中程度後、収穫の中央 FPI。
よい仮説を調査するには、非爆発 TBI、障害脳血管反応性の結果のようなその bTBI 我々 はテスト血管内減圧に筋の緩慢な応答を測定することによって侵害された自己調節に貢献機構(図 2および図 3) 高度なブラスト シミュレータ (ABS) 衝撃管モデルを用いた軽度の bTBI を受けるラットから収集した孤立した、加圧の齧歯動物 MCA セグメント (図 1) で体外 (ロドリゲスを参照してくださいら39表 1)波の上と下で圧40 Freidlander のようなを生成するドライバーの商工会議所に直接配信される圧縮空気を使用する (ロドリゲスを参照してくださいら39図 1A)。
図 1: 中大脳動脈 (MCA) の場所。MCA の後大脳動脈 (PCA)、頸動脈 (ICA)、外部頸動脈 (ECA)、脳底動脈 (BA) および総頚動脈 (CCA) を基準としての場所を強調ラット脳の腹側のビュー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ブラスト シミュレータ (ABS) 衝撃波管装置を高度な.研究のすべての動物の主な爆発障害を生成するために使用する ABS。1 = ドライバー室;2 = 拡張室; 3 = 標本室4 = 反射波抑制;黄色の星 = 試験片トレー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Protocol
実験的プロトコルをすべて機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) テキサス医学部、評価会の大学によって承認された、実験動物管理 (AAALAC) 認定認定施設。
1. 動物腹筋爆発怪我に備えて
- 齧歯動物ボリュームを機械的人工呼吸器をオンにし、呼吸率は 40-45 分あたり呼吸の間を設定します。
- スイッチはサーモスタット制御地球温暖化の毛布に、青いパッドの上にテープします。
- ベンチレーター ホースを人工呼吸器に接続します。
- 気管内挿管のそり、喉頭鏡、長いピックアップ ピンセット、スタイレット、気管内チューブを収集し、綿棒が 0.05 mL の 1% リドカイン塩酸整理青いパッドの上で浸漬します。
- 齧歯動物麻酔「バブル」商工会議所、人工呼吸器、空気室とイソフルラン チャンバー ホースを安全に接続し、それぞれのプラグやソケットに接続されているを確認します。麻酔泡箱クランプすべきオープン。人工呼吸器のクランプを閉じる必要があります。
- 空気室の 2 L/分、1 L/分の酸素のためのつまみに部屋の空気のためのつまみを設定します。
- イソフルランをオンにし、ボリュームの混合物の 4% にノブを設定します。
- タイマーを開始し、4-6 分間麻酔の泡箱のヤング アダルト (≈3 ヶ月)、雄 Sprague-dawley ラット (350-400 g) を配置します。
- 2 分のマークでラットの重量を量る。
- ラット後肢のつま先を軽くつまんで麻酔をかけられ完全に確認してください。足撤退を認められなかった場合、部屋の空気を減らすし、1 L/分、0.4 L/分の酸素、ボリューム混合の 2% にイソフルランにノブを設定します。
- 直腸 telethermometer 温度モニターをオンにします。
- 人工呼吸器にクランプを開き、麻酔の泡箱にクランプを閉じます。
- ラットを麻酔泡箱と気管内挿管のそりの上の位置から削除します。
- ラットを挿管します。動物の口の中で喉頭鏡を置き、方法のうち、舌の位置に長いピックアップ ピンセット、喉の内側に沿って綿棒リドカインに浸した綿綿棒の先端を使用して、ゆっくりラットの気管に気管内チューブを含むスタイレットを挿入します。
- 挿管、気管内チューブの外側の端に人工呼吸器のホースの端を挿入し、観察し、呼吸ラットでは着実に、難なくご確認ください。
- 場所は舌は結び目から無料世話に気管内チューブを固定します。
- Telethermometer 直腸プローブに白色ワセリンを適用し、尾のすぐ下に挿入します。
- 試料室から abs 樹脂試験片トレーを取り外し、トレイにラット配置される前に地球温暖化の熱ランプの下で。
- 目の上と下にラットの頭皮の上を剃る耳の間。
- 標準サイズの泡耳プラグをハサミで同一の半分に切る。プラグの底面の中心で始まり、丸みを帯びた先端までまっすぐカットします。鼓膜に接触が行われるまでまず外耳道に沿って各耳の先端に半分の部分を挿入します。
- 直腸の温度を監視します。37 ° C の温度に達すると、ネズミは abs 樹脂試験片トレーにロードする準備ができています。
- Abs 樹脂試験片トレーにラットを保護します。気管内チューブから人工呼吸器ホースを外し、すばやく、そっと優しく導くヘッド ホルダーを開くとゴムの襟を頭、トレイの上端にラットをスライドします。気管内チューブにベンチレーター ホース取り付け直しますチェックそれは確実にないようにゴム首輪首周りにしっかりとラットが側腹臥位 (図 3) で敷設されていることを確認し、。
- オフに、イソフルラン、気管内チューブからベンチレーター ホースを取り外します。
- ロック、abs 樹脂標本室に麻酔下のラットを含む ABS 試験片トレーを固定します。
- 優しくピンチ後肢足長いピンセットを使用してつま先のすべての 3 s まで撤退の反射的な反応が引き出されます。
2. 腹筋爆発デバイス作製とブラスト TBI 誘導
注:プロトコル手順 2.1-2.10 は通常手順 1.1-1.22 と同時に完了したので ABS は爆風損傷管理権利の準備ができて後ラットが読み込まれ、標本室に確保します。
- ドライバー室 (図 4B) から脱出し、そのシールからチャンバーを緩めるに残留空気を可能にするために油圧の手ポンプ (図 4A) ノブを緩めます。
- ドライバー室を取り巻くすべてのスレッド棒 (図 4D) からキャップ ナット (図 4C) を緩め、左とチャンバー (図 4E) からチャンバーをスライドさせます。
- 2 つのすべてのスレッドの棒とドライバーの間にマイラー シートの配置を可能にするためにドライバー室と拡張室の上部にある彼らの対応するキャップ ナットを完全に削除します。
- スタックとテープの上端から 4 の事前カットに沿って一緒と中古 (長さ 30 cm、幅 20 cm、0.004 インチ厚い) マイラー シート (成形、マイラー ' 膜') 2.54 cm 部分のマスキング テープを使用しています。ドライバーと拡張室 (図 4F) 間の開口部の中央に膨張空洞の上部にマイラー膜の上端をテープ テープの 2 番目の部分を使用して、安全に。
- 商工会議所と手締めの上部に 2 つのすべてのスレッドの棒の商工会議所を取り巻くすべてのキャップ ナットを取り付け、マイラー膜に対してドライバー室を固定します。
- しっかりと合うまで油圧手ポンプ ブロックとドライバー室に対してアクセサリー鋼ブロックを移動します。
- 油圧手ポンプを締め、油圧計の定圧しきい値を観察することによってドライバー室まま漏れと加圧を確認します。
- ABS 爆発デバイス コンピューター上の abs 樹脂ブラスト装置圧力トレースを記録するトリガー取得ファイルを開きます。
- 圧縮空気タンクの (図 4G) 主なノブ十分な気道を少し開くことを緩めます。
- ゲージ インジケーター ≈5、000 の psi の必要なチャンバー圧力レベルを示す赤い矢印に到達するまでは、油圧手動ポンプを動作します。
- セキュリティで保護されたと外側腹臥位 (図 3) で abs 樹脂試験片トレー (図 4H) に麻酔下の動物を配置し、(図 4私) abs 樹脂標本室に試験片トレーをロックします。
- すべての 3 の長いピンセットを使用して軽くピンチ、後肢足 s 撤退の反射的な反応が引き出されるまで。
- ABS ブラスト装置コンピューターで開かれた取得ページを開始をクリックします。
- 'Acquisitioning' ウィンドウが画面に表示されたらを押し ABS ブラスト装置トリガー爆発消灯、マイラー膜を破裂し、ラットの ABS の爆発損傷 (20.9 psi ±1.14, 138 kPa ±7.9) の管理まで。爆発爆発直後後は、どのくらい時間 (分および秒) が受傷後経過を追跡する 2 番目のタイマーを開始します。
- Abs 樹脂試験片トレーからラットを削除、青パッドと完全に立ち直り反射抑制の評価のための彼の背中に彼を置く地球温暖化の毛布に戻ります。
- 立ち直り反射のリターンのための時間を記録します。2 番目のタイマー、分と秒連続 3 彼の胃の上に背中からロールをラットにかかる受傷後、時間の長さの文書を観察します。ラットを麻酔の泡箱に戻ります。
- ドライバー室を緩めると動きを可能にするために油圧の手ポンプ ノブを緩めます。
- 気道を閉じるために、圧縮空気タンクの主なノブを締めます。
図 3: ラット配置 ABS 試験片トレーと ABS. 内方向と ABS の内部研究動物の向き。ABS に置かれ、動物は衝撃波の方向 (赤矢印) に垂直の頭の背側表面で横の腹臥位では。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:高度なブラスト シミュレータ (ABS) ショック チューブ デバイスの概略図。ABS の主要なコンポーネントです。A = 油圧ハンドポンプ。B = ドライバー室;C = ナット;D = すべてのスレッド棒; E = チャンバー;F = のマイラー膜の配置場所G = 圧縮空気ボンベH = 試験片トレー。私 = 標本室。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
3. 齧歯動物 MCA PSS 溶液の調製
注:プロトコル手順 3.1-3.3 は通常同時に完了した手順 1.1-1.22 PSS ソリューションが使用可能に。
- 準備し、次の組成と濃度の 1,000 mL 生理食塩水 (PSS) をミックス: 130 mM NaCl;4.7 mM KCl;1.17 mM MgSO4∙7H2O;5 mM グルコース;1.5 mM CaCl2;15 mM NaHCO3。
- 21% O2と N2のバランスで 5% CO2の混合ガスで PSS を平衡します。ソリューションは、pH 7.4 の読み取り準備ができてです。
注:すべてのガスは、上記濃度圧縮ガスボンベから取得されます。 - リザーバー ボトルやチューブ準備 PSS ソリューションを埋める、残りの溶液を冷やしなさい。
4. 齧歯動物 MCA セグメントの抽出
- 立ち直り反射時間の長さを記録後、ラットを麻酔の泡箱に戻ります。人工呼吸器、クランプを閉じ、商工会議所にクランプを開きます。ボリュームの混合物の 4% にイソフルランを切り、深く麻酔までの 2-3 分のために部屋でネズミを維持します。
- ラットを麻酔すると、一度人工呼吸器にクランプを開き、麻酔の泡箱にクランプを閉じます。ボリュームの混合物の 2% に、イソフルランを減らすし、泡チャンバーから彼を削除します。地球温暖化の毛布の上に彼の胃に彼の場所、気管内チューブの外側の端に人工呼吸器のホースの端を再挿入します。
- 30 分または 60 分の呼吸率は 40-45 分あたり呼吸とボリュームの混合物の 2% で麻酔の間に機械換気を維持すぐにポスト bTBI 傷害。
- いずれか 30 分または 60 分の生存時間の補完増加量の混合物の 4% にイソフルランと深くすぐに 5-6 分の麻酔後、斬罪に齧歯動物固有のギロチンを使用して安楽死させます。
注:これらの実験で我々 動物の麻酔や立ち直りのリターンに続く換気反射まで保った斬首。 研究は、長い生存縦長を必要とする場合、麻酔から出現する前に動物に鎮痛薬を投与すべき。 - 繊細な頭蓋骨から脳を削除します。#10 メス刃を使用して、後頭顆まで坊主の頭皮の上から中央、1.5 インチ垂直、骨に深い切開を行います。
- 小さな骨 rongeurs を使用して開き、頭蓋の骨から頭皮皮膚を分離します。
- 大きな骨 rongeurs を使用して、カットし、後頭、interparietal、および脳を包む頭骨の下半分を抽出します。
- 脳が周囲骨の無料頭蓋骨から脳を慎重に発掘するのに手術のヘラを使用します。
注:頭蓋の壁からセグメント頭蓋骨から脳を分離すると、不必要にタグボートにジャークや、繊細な MCA を引くときは、細心の注意を取る。 - 小さいガラスは固体の氷ブロックの上に直接休んでいるペトリ皿に含まれるチルド PSS ソリューションに収穫された脳を入金します。
- ウィリス動脈輪から左と右 MCA 始まる両方を慎重に取り外します。約 4-5 mm の横方向と背側にセグメントを削除を続けます。
- 優しくきれいに microforceps を使用して任意の結合組織の長さ 4-5 mm 程度の収集した MCA セグメント。
- により、MCA をマウントします。最初ガラス マイクロ ピペット (直径 ≈70 μ m) と各セグメントの近位端を cannulate、10-0 ナイロン縫合糸で固定します。
- そっと、内腔から任意の残留血液やその他の内容を削除する PSS ルミナを灌流します。
- MCA のセグメントをストレッチすることがなく 2 番目のピペットで各セグメントの遠位端を cannulate、10-0 ナイロン縫合糸で固定します。
- MCA のセグメントの成功実装後血管の倍率の倒立顕微鏡のステージの上にチャンバーを配置します。顕微鏡付けビデオ カメラ、モニター、ビデオ スケーラ血管径測定のための光学マイクロメータの校正
- 各セグメント、周囲によりバスを室温から 37 ° C に加温し、21% O2と N2のバランスで 5% CO2の混合ガスと平衡循環継続的に PSS で埋めます。
- 60 分 50 mmHg の圧力で MCA セグメントは、セグメント上の適切な高さにマイクロ ピペットに接続されているリザーバー ボトルを上げることによって平衡します。マイクロ ピペットとリザーバー ボトル間にある圧力トランスデューサーは、目的 50 mmHg の圧力を達成するかを示す MCA セグメント内経壁圧を評価します。
- 平衡期間の結論の後さまざまな高さでリザーバー ボトルを設定することによって 100 mmHg に血管内の圧力を高めます。
- (血管収縮の確認) のための 30 ミリメートル K+を提供を介して内腔液と動脈の直径を測定します。約 10 分後 10-5 M Ach (血管拡張) を提供し、動脈の直径を測定します。
- 容器の緩慢な応答を確認します。80 mmHg に 100 mmHg から血管内の圧力を減らすためにリザーバー ボトルを下げます。10 分測定動脈径の平衡に MCA セグメントを許可します。
- 60 mmhg 80 mmHg から血管内の圧力を減らします。10 分測定動脈径の平衡に MCA セグメントを許可します。
- 40 mmHg に 60 mmHg から血管内の圧力を減らします。10 分測定動脈径の平衡に MCA セグメントを許可します。
- 20 mmHg に 40 mmHg から血管内の圧力を減らします。10 分測定動脈径の平衡に MCA セグメントを許可します。
Representative Results
研究のすべての動物の平均 bTBI 重圧は 20.9 psi ±1.14 (138 kPa ±7.9) だった。立ち直り反射 (RR) 抑制ラット ABS bTBI 衝撃波露出 (5.37 分 ±2.1) を受けるための平均期間は大幅に長くなかった (p = 0.36、シャム対 bTBI) よりも偽のグループ (5.10 分ハーフブリッジコンバーター) で。
30 と 60 分偽グループの両方、内圧が 20 mmHg に 100 から減少したように、ベースラインより上 MCA 直径が増加しました。対応する偽グループと比較して、連続する MCA 引き延ばし応答観測 30 分で血管内の圧力の減少を課された (p = 0.01、シャム対 bTBI)、60 分 (p = 0.02、シャム対 bTBI) ABS bTBI グループは、後爆発の露出 (図 5) を大幅に削減。これらの結果の詳細については、参照してくださいロドリゲスら39。
これらの研究は、その穏やかな bTBI 著しく損なわれた脳の代償散大 MCA セグメントの期間で起因したこれらの研究で使用される穏やかな衝撃波レベルながら穏やかな bTBI 後 30 〜 60 分で血管内減圧レスポンス明らかにRR の抑制 (< 30 s) 偽外傷後のラットと同様。
ソフトウェアの統計分析を行った。筋原性血管内の圧力の変化に対する内圧 (80、60、40、20 mmHg) の各レベルの (100 mmHg) のベースラインからの変化率を計算することによって評価されました。対になっていない学生の t テスト基準を bTBI と偽グループ間の違いを評価する使用されました。MCA 散大反応における bTBI と偽のグループ間の差は、等分散の繰り返された一方向の分散分析 (ANOVA) Dunnett の多重比較検定やバートレットのテストを使用して評価されました。
繰り返しのテスト結果統計的検出力の減少、による MCA の各特定の圧力ポイントで比較実験 (例えば, 100 と 80 の mmHg の間または 60 と 40 mmHg の間、等) 行われました。意義はp ≦ 0.05 で受け入れられたレベル。テキスト、表、および図のすべてのデータは、手段 (SEM) の ± 標準誤差を手段として表されます。
図 5: 血管内減圧に中間の大脳動脈 (MCA) 応答に及ぼす bTBI.血管内圧のプログレッシブ削減に散大応答障害血管拡張反応を展示、30 分が大幅に削減された (p 0.01、bTBI対偽)、60 分 (p = 0.02、シャム対bTBI) bTBIグループ (n = 6/グループ) 両方の偽のグループと比較して爆発の露出後 (n = 12)。30 と 60 分偽グループの両方、内圧が 20 mmHg に 100 から減少したように、ベースラインより上 MCA 直径が増加しました。± SEM. の手段として値をプロット * シャム対p < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
すべてのプロトコルおよび手順と同様、この特定の研究のプロトコルの特定の手順に正確に従って不可欠とできるだけ正確です。ラットの最初の挿管後、着実にかつ容易に呼吸することを確認することが重要です。誤って食道ではなく気管に気管内チューブを挿入すると、ガリガリ、呼吸困難、出血や肺に欠乏麻酔交付によるラットの後続の奮起になります。
ドライバーと膨張室をつなぐ開口部の中央にマイラー膜シートをテーピング、シート中央に配置し、39,41を開く全体をカバーことが不可欠です。開口部にシートを始まると、ドライバー室、バースト電位に必要な圧と爆発傷害の管理の拒否のドロップから空気漏れが発生します。正しく置くことアクセサリー鋼ブロックをしっかりとフィッティング油圧ハンドポンプに対してブロックとドライバー室も油圧手ポンプ ノブを締めては不可欠と加圧リークなしのままドライバー室を確認します。商工会議所のマイラー膜シートとドライバーと膨張室を開く上で必要な必須のシールを作成、チャンバーに対してしっかりと閉じますドライバー室鋼ブロックを適切に配置できます。
MCA 容器抽出する前に、準備で、21% O2と 5% CO2 N2のバランスに必要な混合物と PSS を毒ガス攻撃あるソリューションと容易のために必要必要と中立的な生理学的 pH、PSS ソリューション21,33,34を取り組んでいます。
この手順により、最大拡張時に表示される次の収縮をセグメントとして非常に義務は 60 分21,32,33,34一定の圧力でセグメントを平衡させる彼らの最初のプライマリの加圧。このイベントは、自発的なトーン、健康な動脈の32,33,34の挑発的なプロパティの発生を示します。セグメントの平衡の各種圧力レベルは他研究33,34,42, 本研究とマシューで利用されている、ら21日・ ゴールディングら35・ ゴールディングら43平衡 50 mmHg にセグメント。平衡の収集中 40 mmHg-100 mmHg32間のどこかのセグメントでは、いくつかの柔軟性と、プロトコルのステップの変更時間平衡圧力パラメーター内で最終的に健康なことを確認実験の継続に必要な動脈。
それらの容器をそのままに保ちながら、頭蓋骨とウィリス動脈輪から左と右 MCA セグメントから脳を取り外す際に細心の注意を取ることは、おそらくプロトコル全体の最も重要なステップです。骨 rongeurs と脳を穿刺、引き裂くまたは削除中にセグメントの深刻なストレッチや収穫の破壊で最終的に生じる頭蓋から脳を発掘するとき手術のヘラで誤って血管を引いてMCA のセグメントの使用不能を原因と最終的にその動物の実験全体を排尿動脈のセットの使用を中止します。
インパクト後収集した MCA セグメント前のヴィヴォの引き延ばしや constrictory の刺激に対する脳血管応答を測定または TBI 体内爆発成功をもたらした、方法論はその難しさおよび/または制限ないわけです。おそらく脳血管の循環に TBI の結果を調べることとリンクより識別可能な複雑さの 1 つが様々 な材料により暗黙の影響から血管に TBI の明示的な効果をデタッチし、傷つけられた頭脳44によって生成された要素。この考えの困惑は分析することによって可能性のある回避ができます前のヴィヴォの vasoconstrictory と血管拡張反応収穫、灌流や MCA の加圧します。生体内で脳動脈がローカルで死の前に実質の血管作動性物質を排出にさらされている時間の期間を短縮する努力、TBI 後直接脳動脈のコレクションがこのような長期暴露の程度を減すことができます。効果。生体を隔離された MCA の ex さらに特定の受容体アゴニストおよびアンタゴニストを使用して外傷性血管損傷のメカニズムまたは評判が高い車として精査の余裕がない血管の損傷の分析の見通しを提示します。効率的にまたは生体内で差別的と。その後、この ex vivo 法併用 ex vivo 暴露薬 (血管収縮や血管や血管外薬物曝露による血管の拡張) 結果筋の応答をテストします。
その他の制限は、約またはイライラしたがって排尿の使用船舶の早期断裂になることができます収穫の脳から MCA を削除するがあります。さらに、動物の安楽死間隔よりも数分をさせるため、血管および準備の PSS ソリューションの配置のコレクションも無効にできます、生存。BTBI 開始から終了まで数時間がかかるおよび成功のために必要な時間の長さを縮小する試み後の MCA の筋の反応をテストするためこのプロトコルで記述されている方法が実験的に可能性がときに正しくを実行し、続けて、失敗しました。しかし、このメソッドが実行される体外とより多くの費用対効果の計測と45,46または従来のドップラー超音波イメージング機器より体内の高分解能磁気共鳴 (MR) をかなり利用/velocimetric テクニック47,48,49船研究採用されてもいます。
軽度 bTBI 傷害が血管内減圧に脳障害の引き延ばし応答に関連付けられているこれらの所見に血管攣縮6,7細胞 hyperconstriction50の機能できる可能性がなどの出現に繋がる爆発の露出減少相対的な脳灌流した後に報告しました。さらに、脳血管の正常な緩慢な反応を妨げる爆発ダメージがおそらく促進低血圧、戦闘中に頻発と組み合わせると脳灌流の減少。
これらの結果は、その bTBI 結果、動脈の血管のコントロールを促進するメカニズムに変更を示します。少なくとも時間ポスト傷害のために血管内の圧力の減少動脈筋原性反応の急性期脳血管障害が認められ, も bTBI 後急性期を取り巻く情報のギャップが残っています。脳血管系にどのような物理・生化学的欠陥傷害と bTBI の原因を外傷後かなりすぐに治療やリハビリの成功のレベルを決定する際に支援する脳露出を識別する重要性。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
研究は、橋渡しの外傷性脳損傷研究、陸軍衛生研究と材料コマンド - 国防総省から賞 W81XWH-08-2-0132 ムーディーズ プロジェクトでサポートされているチームの一部として完成しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Blast Simulator (ABS) | Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. | N/A | Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries |
| Adult, male, Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | N/A | Experimental animals |
| Arteriograph | Living Systems Instrumentation, Inc. | Arteriograph | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
| Bone rongeurs, large | FST Fine Science Tools | Friedman Rongeur | Brain extraction from skull |
| Bone rongeurs, small | FST Fine Science Tools | Boynton Rongeur | Brain extraction from skull |
| CaCl2 | Sigma | Calcium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| Ear plugs | 3M | Foam Ear Plugs 1100 Class AL | Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine |
| Glucose | Sigma | D-[+]-Glucose | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | Isoflurane, USP | Anesthetic |
| KCl | Sigma | Potassium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| MgSO4•7H2O | Sigma | Magnesium sulfate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| Microforceps | Buxton Biomedical Inc. | Micro Tying Fcps, 180mm | Brain extraction from skull |
| Mylar sheets | Texas Art Supply | Mylar | Membrane used for compressed air build-up during blasting |
| NaCl | Sigma | Sodium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| NaHCO3 | Sigma | Sodium bicarbonate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
| Nylon suture | Ethicon | 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
| Scalpel blade #10 | Bard-Parker | 10 Stainless Steel Surgical Blade | Brain extraction from skull |
| Surgical spatula | Delmaks Surgico | Cement Spatula | Brain extraction from skull |
| Thermometer | Physitemp Instruments, Inc., | Thermalert Monitoring Thermometer | Monitoring of experimental animal's core body temperature |
| Volume ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | Small Animal Ventilator | Constant and steading breathing of the intubated experimental animal |
| Water blanket | Gaymar Industries, Inc. | Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad | Maintenance of experimental animal's body temperature |
References
- DeWitt, D. S., Prough, D. S. Blast-induced brain injury and posttraumatic hypotension and hypoxemia. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 877-887 (2009).
- Overgaard, J., Tweed, W. A. Cerebral circulation after head injury. Part 1: CBF and its regulation after closed head injury with emphasis on clinical correlations. Journal of Neurosurgery. 41 (5), 531-541 (1974).
- Wei, E. P., Dietrich, W. D., Povlishock, J. T., Navari, R. M., Kontos, H. A. Functional, morphological, and metabolic abnormalities of the cerebral microcirculation after concussive brain injury in cats. Circulation Research. 46 (1), 37-47 (1980).
- Wei, E. P., Kontos, H. A., Patterson, J. L. Dependence of pial arteriolar response to hypercapnia on vessel size. The American Journal of Physiology. 238 (5), 697-703 (1980).
- Lewelt, W., Jenkins, L. W., Miller, J. D. Effects of experimental fluid percussion injury of the brain on cerebrovascular reactivity of hypoxia and to hypercapnia. Journal of Neurosurgery. 56 (3), 332-338 (1982).
- Bauman, R. A., et al. An introductory characterization of a combat-casualty-care relevant swine model of closed head injury resulting from exposure to explosive blast. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 841-860 (2009).
- Armonda, R. A., et al. Wartime traumatic cerebral vasospasm: recent review of combat casualties. Neurosurgery. 59 (6), 1215-1225 (2006).
- Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J.
- Bouma, G. J., Muizelaar, J. P. Relationship between cardiac output and cerebral blood flow in patients with intact and with impaired autoregulation. Journal of Neurosurgery. 73 (3), 368-374 (1990).
- Lewelt, W., Jenkins, L. W., Miller, J. D. Autoregulation of cerebral blood flow after experimental fluid percussion injury of the brain. Journal of Neurosurgery. 53 (4), 500-511 (1980).
- DeWitt, D. S., et al. Effects of fluid-percussion brain injury on regional cerebral blood flow and pial arteriolar diameter. Journal of Neurosurgery. 64 (5), 787-794 (1986).
- Engelborghs, K., et al. Impaired autoregulation of cerebral blood flow in an experimental model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 17 (8), 667-677 (2000).
- Mchedlishvili, G. Physiological mechanisms controlling cerebral blood flow. Stroke. 11 (3), 240-248 (1980).
- Kontos, H. A.
- Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Jr The consequences of traumatic brain injury on cerebral blood flow and autoregulation: a review. Clinical and Experimental Hypertension. 21 (4), 299-332 (1999).
- DeWitt, D. S., Prough, D. S. Traumatic cerebral vascular injury: the effects of concussive brain injury on the cerebral vasculature. Journal of Neurotrauma. 20 (9), 795-825 (2003).
- Paulson, O. B., Strandgaard, S., Edvinsson, L.
- Lang, E. W., Diehl, R. R., Mehdorn, M. Cerebral autoregulation testing after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: the phase relationship between arterial blood pressure and cerebral blood flow velocity. Critical Care Medicine. 29 (1), 158-163 (2001).
- Soehle, M., Czosnyka, M., Pickard, J. D., Kirkpatrick, P. J. Continuous assessment of cerebral autoregulation in subarachnoid hemorrhage. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 1133-1139 (2004).
- Roy, C. S., Sherrington, M. B.
- Mathew, B. P., DeWitt, D. S., Bryan, R. M., Bukoski, R. D., Prough, D. S. Traumatic brain injury reduces myogenic responses in pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Neurotrauma. 16 (12), 177-186 (1999).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Johnson, P. C., Henrich, H. A. Metabolic and myogenic factors in local regulation of the microcirculation. Federation Proceedings. 34 (11), 2020-2024 (1975).
- Johnson, P. C. The myogenic response and the microcirculation. Microvascular Research. 13 (1), 1-18 (1977).
- Atkinson, C. L., et al. Opposing effects of shear-mediated dilation and myogenic constriction on artery diameter in response to handgrip exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 119 (8), 858-864 (1985).
- Johnson, P. C. The myogenic response in the microcirculation and its interaction with other control systems. Journal of Hypertension. 7 (4), Supplement 33-39 (1989).
- Allen, S. P., Wade, S. S., Prewitt, R. L. Myogenic tone attenuates pressure-induced gene expression in isolated small arteries. Hypertension. 30 (2), Pt 1 203-208 (1997).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
- Ahn, D. S., et al. Enhanced stretch-induced myogenic tone in the basilar artery of spontaneously hypertensive rats. Journal of Vascular Research. 44 (3), 182-191 (2007).
- Demay, J. G., Gray, S. D.
- Nilsson, H., Sjöblom, N. Distension-dependent changes in noradrenaline sensitivity in small arteries from the rat. Acta Physiologica Scandinavica. 125, 429-435 (1985).
- Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
- Bryan, R. M., et al. Stimulation of α2 adrenoreceptors dilates the rat middle cerebral artery. Anesthesiology. 85, 82-90 (1996).
- Golding, E. M., et al. Endothelial-mediated dilations following severe controlled cortical impact injury in the rat middle cerebral artery. Journal of Neurotrauma. 15 (8), 635-644 (1998).
- Golding, E. M., Contant, C. F., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Temporal effect of severe controlled cortical impact injury in the rat on the myogenic response of the middle cerebral artery. Journal of Neurotrauma. 15 (11), 973-984 (1998).
- Golding, E. M., et al. Cerebrovascular reactivity to CO(2) and hypotension after mild cortical impact injury. The American Journal of Physiology. 277 (4), Pt 2 1457-1466 (1999).
- Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
- Yu, G. X., et al. Traumatic brain injury in vivo. and in vitro. contributes to cerebral vascular dysfunction through impaired gap junction communication between vascular smooth muscle cells. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 739-748 (2014).
- Rodriguez, U. A., et al. Effects of mild blast traumatic brain injury on cerebral vascular, histopathological and behavioral outcomes in rats. Journal of Neurotrauma. 35 (2), 375-395 (2018).
- Friedlander, F. G. The diffraction of sound pulses; diffraction by a semi-infinite plane. Proceedings of the Royal Society of London. Series A, Mathematical and Physical Sciences. 186 (1006), 322-344 (1946).
- Tompkins, P., et al. Brain injury: neuro-inflammation, cognitive deficit and magnetic resonance imaging in a model of blast induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (22), 1888-1897 (2013).
- Cipolla, M. J., Vitullo, L., McKinnon, J. Cerebral artery reactivity changes during pregnancy and the postpartum period: a role in eclampsia. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2127-2132 (2004).
- Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Jr Comparison of the myogenic response in rat cerebral arteries of different calibers. Brain Research. 785 (2), 293-298 (1998).
- DeWitt, D. S., Prough, D. S. Assessment of cerebral vascular dysfunction after traumatic brain injury. Animal Models of Acute Neurological Injuries II: Injury and Mechanistic Assessments. , Humana Press. New York. (2012).
- Degnan, A. J., et al. MR angiography and imaging for the evaluation of middle cerebral artery atherosclerotic disease. American Journal of Neuroradiology. 33 (8), 1427-1435 (2012).
- Liu, Q., et al. Comparison of high-resolution MRI and CT angiography and digital subtraction angiography for the evaluation of middle cerebral artery atherosclerotic steno-occlusive disease. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 29 (7), 1491-1498 (2013).
- Newell, D. W., Winn, H. R.
- Schenone, M. H., Mari, G. The MCA Doppler and its role in the evaluation of fetal anemia and fetal growth restriction. Clinics in Perinatolgy. 38 (1), 83-102 (2011).
- Morris, R. K., Say, R., Robson, S. C., Kleijnen, J., Khan, K. S. Systemic review and meta-analysis of middle cerebral artery Doppler to predict perinatal wellbeing. European Journal of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology. 165 (2), 141-155 (2012).
- Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12705-12710 (2011).
