Summary
Detta protokoll beskriver processen för immunofärgning rektal sug biopsier för calretinin, S100 protein, och protein gen produkt 9,5. Denna roman adjuvant diagnostisk metod för Hirschsprungs sjukdom har att föredra känslighet och specificitet priser.
Abstract
Hirschsprungs sjukdom (HD) är en medfödd tarm sjukdom som är kliniskt manifesterad som en oförmåga att passera Mekonium hos spädbarn eller som långtids förstoppning hos barn. Rektalsugbiopsi (RSB) för att bestämma frånvaron av ganglionceller och neurala hypertrofi är det mest exakta testet för diagnos av HS för närvarande. Traditionell hematoxylin-eosin färgning saknar känslighet och specificitet. Acetylkolinesteras färgning kan inte användas i stor utsträckning på grund av dess komplexa process. Vårt nya protokoll immuninfärgning för calretinin, S100 protein och protein gen produkt 9,5 (PGP 9.5), som vi genomförde på RSBs, uppvisar hög känslighet och specificitet på 96,49% (95% KONFIDENS intervall, 0,88-0,99) och 100% (95% konfidensgrad intervallet, 0,97-1,00). De HD-drabbade segmenten förekommer ofta som frånvaron av uttrycket av calretinin, S100 protein, och PGP 9.5, som är markörer för neurala hypertrofi i submukosala vävnad. Detta protokoll beskriver den detaljerade processen för denna nya diagnostiska metod.
Introduction
Hirschsprungs sjukdom (HD) är en vanlig medfödd tarm sjukdom som kännetecknas av brist på ganglionceller i olika segment av den distala tarm kanalen1. Det mänskliga enteriska nerv systemet bildas när invasionen av embryonala neurala celler är avslutad. Om det finns en störning av processen och invasionen Miss lyckas med att slutföra, den distala tarmen av nyfödda blir aganglionic2. Detta potentiellt dödliga tillstånd kallas Hirschsprungs sjukdom. Proliferation, motilitet, och gut tillväxt är de tre huvud komponenterna i framgångs rik kolonisering.
Traditionell hematoxylin och eosin (H & E) färgning av en begränsad submukosala biopsi kan inte uppnå så tillfredsställande av ett resultat som H & E färgning av en full-tjocklek vävnad som erhållits från kirurgi. Dessutom, acetylkolinesteras (värk) färgning av rektal sugvävnad är teoretiskt utmanande på grund av dess otillräckliga känslighet, som är 91%, och komplex bearbetning av frysta avsnitt3,4. Flera andra immunhistokemiska markörer av ganglionceller och nerv fibrer som kan färgas i Formalinfixerade och paraffin-inbäddade preparat blir successivt mainstream HD-diagnostik. Calretinin är ett vitamin D-beroende kalcium-bindande protein som inte uttrycks i myenteric och submukosala plexus av HS-drabbade segment5. S100 protein uttrycks i celler som härrör från neurala Crest, såsom nerv fibrer och gliaceller, som ofta närvarande neurala hypertrofi i submukosala vävnad av HS-drabbade segment6. Protein gen produkt 9,5 (PGP 9.5) fläckar tillförlitligt nerv fibrer och ganglionceller; PGP 9.5 färgning fungerar som ett komplement till calretinin färgning, särskilt i fall av isolerad hypoganglionosis. Dubbel färgning med S100 och PGP 9.5 kan minska den falskt negativa hastigheten och öka känsligheten. Som en förutsättning, den aktuella studien syftar till att säkerställa adekvat specificitet och hög känslighet för denna nya diagnostiska metod. Vårt nya protokoll använde alla tre markörer för diskriminering av aganglionic tarm och hypertrofiska nerv fibrer. En prospektiv studie av 318 barn utfördes av vårt labb och tidigare publicerats utan ett detaljerat protokoll7. Det detaljerade protokollet och försiktighets åtgärderna diskuteras i den här artikeln. Alla nyfödda som drabbats av ett allvarligt defekation problem sedan födseln eller barn med kronisk förstoppning exklusive andra vanliga sjukdomar är potentiella kandidater för rektal sugbiopsi (RSB). Vårt nya protokoll lämpar sig för färgning inte bara RSBs utan även full-tjocklek biopsier eller kirurgiska prover för att göra en slutlig diagnos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av forsknings etiska nämnden vid Union Hospital of Huazhong University of Science and Technology.
1. rektal sug biopsi
- Utför rektal sug biopsi av en välutbildad barn kirurg och en assistent med hjälp av en Rbi2 sug rektal biopsi system efter att få informerat samtycke från förmyndaren.
- Utför RSB på patienter som har följande indikationer: oförmåga att passera Mekonium hos spädbarn eller långvarig uppblåsthet med eller utan förstoppning hos barn; barn med långvarig förstoppning som behöver paraffin olja för att slutföra defekation; tarm obstruktion eller tarm perforation med okända orsaker hos barn som genomgår en enterostomi.
Anmärkning: kontraindikationer för RSB är följande: barn som har allvarliga symtom, som är i dåligt fysiskt tillstånd, eller som inte kan toleranta RSB; barn med akut-Stadium enterokolit; barn som genomgår intestinal anastomos utan fullständig läkning.
- Utför RSB på patienter som har följande indikationer: oförmåga att passera Mekonium hos spädbarn eller långvarig uppblåsthet med eller utan förstoppning hos barn; barn med långvarig förstoppning som behöver paraffin olja för att slutföra defekation; tarm obstruktion eller tarm perforation med okända orsaker hos barn som genomgår en enterostomi.
- Utför en normal Kok salt lagring lavemang som tarm beredning 36 h före förfarandet för att undvika lös avföring och överdriven ödem i slem hinnan. Tillsätt magnesiumsulfat lösning om barnet har svår förstoppning. Administrera vitamin K (1 mg/kg) till nyfödda.
Obs: utför inte preoperativa blod prov eller administrera antibiotika, eftersom de inte behövs. - Sätt patienten i Lithotomi position. Täck ytan av röret med paraffin olja. Sätt in den trubbiga röret 4-7 cm i änd tarmen med sido hålet mot den bakre eller laterala väggarna.
- Applicera försiktigt tryck på röret för att under lätta tillräcklig vidhäftning av sido hålet till änd tarmen väggen. Tryck på avtryckaren och dra genast ut verktyget.
- Använd biopsi instrumentet för att få 4 sug biopsier med en diameter på 2 mm vid 3 cm och 6 cm ovanför tand linjen, anteriorly och posteriort. Använd en nål för att placera preparatet på gasväv fuktad med saltlösning.
- Observera patienten tills 2 h efter ingreppet för att utesluta rektal blödning. Undvika ytterligare rektal och anal manipulationer i den första 24 h efter RSB.
2. beredning av RSB-avsnitten
- Placera änd tarms sug biopsier i 4% paraformaldehyd för 6 h för att fixera vävnaden. Använd en fixativ volym 5 gånger mer än vävnads volymen.
- Torka vävnaden med hjälp av patologisk vävnad dehydrator för 11 h. Hela den programmerade processen består av följande 5 steg:
- Placera vävnaden i formaldehyd och fixera för 1 h.
- Placera vävnaden i 75% etanol för 4 h.
- Placera vävnaden i absolut etanol (två förändringar, 1 h vardera).
- Placera vävnaden i absolut etanol (två förändringar, 30 min vardera).
- Placera vävnaden i xylen (tre förändringar, 1 h vardera).
- Placera vävnaden i paraffin vax (58-60 ° c) (tre förändringar, 1 h vardera). Bädda in RSB vävnader i paraffin block.
- Trimma paraffin blocken med en mikrotom tills vävnaden är helt exponerad med en komplett sektion plan.
- Skär blocken i 0,4 μm sektioner med en mikrotom.
- Placera avsnitten i 45-50 ° c vatten i några sekunder vardera för att låta avsnitten att spridas till en platt tallrik.
- Överför paraffin avsnitten till dia bilder.
- Baka glasen i en ugn med 60 ° c för 3-5 h. Undvik bakning för länge, vilket kan leda till förlust av antigener.
- Placera deparaffinized dia bilder i xylen (2 förändringar, 15 min vardera).
- Fukta glasen i absolut etanol, 95%, 80% och 75% etanol i 5 min vardera. Skölj dem sedan i omvänd osmos (RO)-renat vatten i ytterligare 5 min.
3. antigen-hämtning
- Gör arbets utspädningar för calretininhämtning genom att blanda 4 mL EDTA-antigen hämtningsbuffert med 200 mL RO-renat vatten. Gör arbets utspädningar för hämtning av S100 och PGP 9.5 genom att blanda 1 mL citron syra natriumcitratbuffert (100x) med 99 mL RO-renat vatten.
Obs: Calretinin kan hämtas företrädes vis av EDTA-hämtningslösning. Citron syra natriumcitratbuffert är dock lämpligare för hämtning av S100 och PGP 9.5. - Placera bilderna i en Koplin färgburk. Fyll burken med återvinnings lösning och placera den i en förvärmd kokande vatten bad. Efter kokning i 20 min, ta bort burken från vatten badet och låt det svalna till rums temperatur. Kyl processen tar cirka 10 min. ta bort glasen och skölj dem varsamt en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Rita en cirkel med en markör penna runt vävnaden och Förbered en våt låda för följande procedurer.
4. blockering av
- Gör arbets utspädningar genom att blanda 3 mL 30% H2O2 med 27 ml ro-renat vatten.
- Tillsätt två eller tre droppar 3% H2O2 Solution droppvis på vävnaden för att blockera peroxidates. Lägg till H2O2 -lösningen omgående för att säkerställa att lösningen inte flödar över från cirkeln. Utför blockering av peroxidates i en 37 ° c inkubator för 20 min.
- Skölj glasen försiktigt med PBS (tre tvättar, 5 min vardera).
- Blockera glasen i 20 min vid 37 ° c med 5% bovint serumalbumin (BSA, beredd genom att blanda 1,5 g BSA-pulver med 30 mL RO-renat vatten).
Anmärkning: blockering med 3% H2O2 kan förhindra 95% av ospecifik färgning och blockering med 5% BSA kan förhindra de andra 5% av ospecifik färgning. Kombinera de två metoderna för att få ett tillförlitligt resultat.
5. antigen-anti kropps reaktion
- Ta bort 5% BSA och tillsätt 50 μL primär anti kropp (calretinin, S100 eller PGP 9.5) till bilden. Inkubera över natten vid 4 ° c.
- Tvätta bilden med PBS (tre gånger, 3 min vardera).
- Tillsätt 50 μL polymerförstärkare (reagens A; se material tabell) till sektionen och inkubera det i 20 min i en 37 ° c inkubator. Tvätta sedan bilden med PBS (tre gånger, 3 min vardera).
- Tillsätt 50 μL sekundär anti kropp B (sekundär anti kropp av get anti-kanin/mus IgG) till sektionen och inkubera i 30 min i en inkubator på 37 ° c. Tvätta sektionen med PBS (tre gånger, 5 min vardera).
6.3, 3-diaminobenzidin och hematoxylin färgning
- Tillsätt 850 μL RO-renat vatten till ett 1,5 mL-rör och tillsätt färgreagenserna (se material tabell) i ordning a, B och C. Tillsätt 50 μl av varje reagens för att få totalt 1 ml 3, 3-diaminobenzidin (DAB) arbets lösning. Om det finns fällnings partiklar, Använd lösningen efter filtrering.
- Tillsätt en droppe DAB-arbetslösning till vävnads delen och fläcken för 3-10 min. Inkubera glasen i DAB vid rums temperatur tills brun färgning upptäcks. Övervaka noggrant med hjälp av ett brightfield Mikroskop. Håll DAB-arbetslösningen borta från ljus. Tvätta sedan bilden med PBS i 5 minuter.
- Tillsätt en droppe hematoxylin att motfärga kärnor i ca 1 min. Sedan, håll coplin burken och tvätta den under en ränna av vatten för cirka 30-40 s tills överskottet färg tas bort. Var noga med att inte skada vävnads sektionerna.
- Sänk ner RSB-glasen i en coplin-burk som innehåller PBS för 25-30. Sedan differentiera i 1% saltsyra-etanol för 10 s. tvätta glasen med PBS i 1 min.
- Torka av bilderna i omvänd ordning efter hydrering: 75%, 80%, 95% och absolut etanol (5 min vardera).
- Exponera bilderna för xylen (2 förändringar, 5 min vardera).
- Montera täckglasen med hjälp av ultraren-montering. Låt bilderna torka före visualisering med hjälp av Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt inkluderades 318 patienter i vår studie. Alla patienter genomgick RSB, och vävnaderna färgas för calretinin, S100, och PGP 9.5. Diagnosen baserad på vårt nya protokoll var HD i 97 fall, non-HD i 213 fall, och misstänkt HD i 8 fall. Bland de 132 kirurgiska patienterna diagnostiserades 99 patienter med HS genom immuninfärgning av full huds prov efter kirurgi. S100 och PGP 9.5-färgning visade att 92% respektive 93% av de 99 patienterna hade hypertrophied nerv stammar. Den andra 83 av de 186 patienterna genomgick full-tjocklek biopsier och visade ganglionceller. Totalt 103 patienter var kliniskt botade av konservativa terapier, och HS exkluderades. Av de 8 patienter med misstänkt HS, 3 patienter kategoriserades som Short-segmentet HD, och de andra 5 patienterna var kategoriserade som icke-HD.
Enligt våra resultat, 97 patienter diagnostiserades av RSB initialt. Detaljerad information visas i tabell 1. Protokollet för immunhistokemisk färgning för calretinin, S100 och PGP 9.5, som vi genomförde på RSBs, har hög känslighet och specificitet på 96,49% (95% KONFIDENS intervall [CI], 0,88-0,99) och 100% (95% CI, 0,97-1.00) respektive. Det positiva prediktiva värdet är 94,3% (95% CI, 0,87-0,99) och det negativa prediktiva värdet är 99,1% (95% CI, 0,95-1.00).
Figur 1a och 1b representerar typiska resultat efter immunofärgning för calretinin. Många ganglionceller, som uttrycker calretinin, kan hittas i den normala vävnader. Emellertid, inga ganglionceller upptäcktes i något område av vävnaden från HD-segmentet. Som visas i figur 1c-F, S100 och PGP 9.5 immunofärgning visar hypertrophied nerv stammar i submucosa, medan endast granulat färgning av några små nerv kvistar observerades i normalt innerveras tarmen. I vår studie är hypertrofiska nerv stammar nerv fibrer med en diameter på ≥ 40 μm.
Figur 1: immunofärgning av rektala sugbiopsier för calretinin, PGP 9.5 och S100. Immunofärgning för calretinin i HD-påverkad vävnad (a) och i ganglion celler av myenteric plexuses i normalt innerveras vävnad (B). Ingen calretinin färgning upptäcktes i myenteric plexuses av HS-drabbade segmentet. PGP 9.5-färgning i HD-påverkad vävnad visade täta hypertrofiska nerv fibrer i submucosa (C) i motsats till nerv fibrer i den normala vävnader (D). (E) tät och framträdande S100 immunofärgning visade hypertrofiska nerv stammar i submucosa av HS-drabbade vävnad. (F) normala nerv fibrer i submucosa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| protein markörer | HD (99) | Icke-HD (219) | ||
| ganglionceller (+) | Hypertrofiska nerv stammar (+) | ganglionceller (+) | Hypertrofiska nerv stammar (+) | |
| Mer från calretinin | 2 | — | 214 | — |
| S100 | — | 91 | — | 3 |
| PGP 9.5 | — | 92 | — | 4 |
Tabell 1: immunhistokemiska Färgnings resultat för de tre protein markörer i rektala sugbiopsier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrev vi ett förfarande med tre olika immunhistokemiska anti kroppar för att färga RBS-sektioner för diagnos av HS. Känsligheten hos vårt diagnostiska protokoll var 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), och specificiteten var 100% (95% CI, 0,97-1.00).
De mest kritiska stegen i protokollet är RSB och antigen-antikroppsreaktion. Storleken på biopsi bestämmer noggrannheten av färgning. En liten biopsi kommer inte att ge tillräckligt med vävnad för att göra en exakt diagnos, medan en stor biopsi leder till en högre risk för blödning. Som en fråga om erfarenhet, biopsier med en diameter på 2 mm är den optimala storleken. För antigen-antikroppsreaktionen kan inte korrekt bevarande av anti kroppen ignoreras. Efter protokollet steg för steg och försiktigt arbeta behövs. Omvänd osmos-renat vatten rekommenderas i alla steg, vilket ger ett tydligare fält för observation och gör det lättare för patologer att göra en korrekt diagnos.
Kontrast lavemang, Anorektal manometri, och biopsi med histologi är tre preoperativa diagnostiska metoder som har använts under de senaste åren. Enligt Takawira et al. s forskning, biopsi med histologi har högsta känslighet och specificitet8. Meier-Ruge et al. första rapporterade användningen av acetylkolinesteras (Ache) färgning på frysta rektal sugvävnad för att diagnostisera HD i 19729. Denna infärgnings metod detekterar hypertrofiska nerv stammar i submucosa. Efter denna rapport, många institutioner runt om i världen började använda denna metod som ett komplement för diagnos av HS. på grund av dess diagnostiska begränsningar, forskarna började koncentrera sig på andra markörer som också kan färga ganglion celler och nerv fibrer i formalinfasta och paraffin-inbäddade preparat. I 2004, Barshack et al. funnit att förlusten av calretinin uttryck kan hjälpa till att diagnostisera aganglionic segment i HD10. Kapur et al. och Guinard-Samuel et al. upprepade protokollet i 2009 och drog satsen att immunohistokemisk färgning för calretinin var överlägsen färgning för acetylkolinesteras11,12. I 1988, S100 immunofärgning för diagnos av HS introducerades först av Robey et al. 13. Monforte-Muñoz et al. upprepade metoden i 1998 och fann att 90% av deras 20 Hirschsprung fall hade nerv fibrer bredare än 40 μm14. Därför kan S100 immunofärgning fungera som en underordnad diagnostisk metod i fall utan ganglion celler. Dessutom, Bachmann et al. märkte att immunohistokemisk FÄRGNING för MAP2, calretinin, GLUT1, och S100 kunde få ett tillförlitligt resultat så exakt som frysta avsnitt tekniker15. Men i 1992, Sams et al. utvärderade värdet av PGP 9.5 vid diagnosen HD16. Även om S100 kan upptäcka mer lamina propria nerv fibrer, den har en högre falsk negativ hastighet. Därför valde vi att använda PGP 9.5 och S100 tillsammans för immunohistokemisk diagnos av HS, som tidigare studier rekommenderas. Många fall av färgning för neuron-specifika enolase i över gångs zoner visade också positiva ganglion celler i myenteric och submukosala plexus, men dessa celler var glesa och små12. Likaså är calretinin-positiva ganglionceller små och har en klustrad formation. En tidigare studie visade att vissa något förtjockad nerv stammar också kunde upptäckas i över gångs segmenten av HS, men med total kolon aganglionosis, kan nerv stammarna vara inom normala gränser (< 40 μm)17. Vi bör analysera resultaten fall för fall och kombinera dessa resultat med kliniska manifestationer för att undvika fel diagnos.
Detta protokoll kunde inte representera den slutliga patologiska diagnosen, så vi genomförde minst ett år av noggrann klinisk uppföljning för varje barn. Dessutom kräver detta protokoll fler prover för att bevisa dess tillförlitlighet.
Sammanfattnings vis, diagnosen av HD av RSB är en bekväm metod som ger en idealisk histologisk diagnos med acceptabel minimal skada. Känsligheten är nära besläktad med om provtagnings platsen är korrekt. Immunohistokemisk färgning av RSB för calretinin, S100 och PGP 9.5 är känslig och specifik för detektion av ganglionceller och hypertrofiska nerv stammar. Kombinationen av dessa tre markörer ger en tillförlitligare diagnostisk metod för HS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Weibing Tang för hans stora hjälp att tillhandahålla inspelningen labbet. Denna artikel stöds av Public välfärd Research, och särskilda medel mottogs från den nationella hälso-och familje planering i Kina (Grant No. 201402007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
