Summary
Мы предоставляем протоколы для оценки мезенхимальных стволовых клеток, изолированных от пульпы зуба и взаимодействия клеток рака простаты на основе совместного культура прямые и косвенные методы. Состояние среды и транс ну мембраны подходят для анализа косвенных паракринными активности. Заполнение дифференциально окрашенные клетки вместе является подходящей моделью для прямого ячеек взаимодействия.
Abstract
Рак как многоэтапный процесс и сложные болезни не только регулируется отдельными пролиферации и роста, но также контролируется взаимодействия среды и ячейке опухоли. Выявление рака и взаимодействия стволовых клеток, включая изменения в внеклеточных среды, физических взаимодействий и выделяется факторы, может включить обнаружение новых вариантов терапии. Мы объединяем известных совместно культуры методов для создания модель системы мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и рак клеток взаимодействий. В текущем исследовании пульпы зуба стволовых клеток (DPSCs) и PC-3 взаимодействия клеток рака простаты были рассмотрены методы прямого и косвенного Сопредседатель культуры. Состояние среды (CM), полученные из DPSCs и 0,4 мкм размера поры мембраны транс ну были использованы для изучения паракринными активности. Совместное культуры различных типов клеток вместе была выполнена для изучения взаимодействия прямых ячеек. Результаты показали, что см возросла клеточной пролиферации и снижение апоптоза в культурах клеток рака простаты. СМ и транс ну системы повышение потенциала миграции клеток PC-3 клетки. Витражи с красители разные мембраны клетки были посеяны в те же суда культуры, и DPSCs участвовали в самоорганизации структуру с PC-3 клетки при этом условии прямого сотрудничества культуры. В целом результаты показали, что методы сотрудничества культуры могут быть полезными для рака и MSC взаимодействия как модель системы.
Introduction
Мезенхимальных стволовых клеток (МСК), с возможностью дифференциации и вклад регенерации мезенхимальных тканей, таких как кость, хрящ, мышцы, связки, сухожилия и жировой, были изолированы от почти всех тканей взрослого организма1 , 2. Помимо обеспечения гомеостаза ткани, производя резидентов клетки в случае хронического воспаления или травмы, они производят жизненно цитокинов и факторы роста оркестровать ангиогенеза, иммунной системы и тканей ремоделирования3. Взаимодействие MSCs с раком ткани не понятных, но накапливать данные свидетельствуют о том, что MSCs может способствовать посвящения, прогрессии и метастазированием опухоли4.
Самонаведения способность MSCs потерпевшего или хронически воспаленной области делает их ценным кандидата на основе стволовых клеток лечение. Однако рак тканей, «никогда не Исцеление ран», также релиз цитокинов, про ангиогенных молекул и жизненно важных факторов роста, которые привлекают MSCs в cancerogenous районе5. Хотя есть ограниченное отчеты, показывающие тормозящее действие MSCs на рак роста6,7, их прогрессии рака и метастазов, поощрение эффекты были широко сообщили8. MSCs, прямо или косвенно затрагивают канцерогенеза различными способами, включая подавление иммунных клеток, секретирующих факторы роста/цитокины, которые поддерживают рака пролиферации и миграции, ангиогенных активности и регулирования 9,эпителия мезенхимальных перехода (EMT)10. Опухоль среда состоит из нескольких типов клеток, включая рак связанные фибробластов (CAFs) и/или миофибробласты, эндотелиальные клетки, адипоциты и иммунные клетки11. Из них CAFs являются наиболее распространённый тип ячейки в области опухоли секретируют различные chemokines, поощрения роста и метастазирования рака8. Было показано, что производные костного MSCs могут дифференцироваться в CAFs в опухоли стромы12.
Пульпы зуба стволовых клеток (DPSCs), характеризуется как первый зубной ткани производные MSCs Gronthos и др. 13 в 2000 году и затем широко расследованы другие14,15, Экспресс плюрипотентности маркеры как Oct4, Sox2и Nanog16 и могут дифференцироваться в различные ячейки linages17. Анализ выражения генов и белков доказал, что DPSCs производить сопоставимые уровни факторов роста/цитокинов с другими MSCs Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), Ангиогенин, фактор роста фибробластов 2 (FGF2), интерлейкина-4 (Ил-4), IL-6, Ил-10, и фактор стволовых клеток (SCF), а также fms как тирозин киназы-3 лиганда (Flt - 3 Л) которые могли бы способствовать ангиогенезу, модулирует иммунные клетки и поддержки раковых клеток миграции и распространения18,19,20 . В то время как взаимодействия MSCs с раком окружающей среды были хорошо документированы в литературе, отношения между DPSCs и раковые клетки не были оценены еще. В настоящем исследовании мы создали совместно культуру и состояния средство лечения стратегий линии клетки высоко метастатического рака простаты, PC-3 и DPSCs предложить возможные действия механизма стоматологических MSCs в прогрессии рака и метастаз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Письменного согласия пациентов был получен после утверждения от организационного комитета по этике.
1. DPSC изоляции и культура
- Передача зубы мудрости, полученных от молодых людей в возрасте от 17 и 20 до 15 мл пробирки, содержащие полный Дульбекко изменения среднего орла (DMEM) [низкий глюкозы DMEM СМИ, дополненная плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллина/стрептомицина / амфотерицин (PSA) решение], в течение 8 ч после резекции. Держите холодной материал ткани (4 ° C) во время передачи, чтобы избежать потенциальных смерти клетки.
- Осторожно извлеките ткани пульпы, стерильные извлечения щипцы от центра зуба, место ткани пульпы в среде DMEM холодной полный в 10 см культуры ткани блюда и размельчите их на мелкие кусочки (2-3 мм), скальпель.
Примечание: Все экспериментальные процедуры должны осуществляться в стерильных условиях в Ламинарный шкаф. Этот неферментативного техника была ранее использованных21,22,23. - Место небольшой целлюлозы тканей внутри тканевой культуры лечение 6-ну пластины и 200 мкл полного DMEM СМИ освещать каждый куски ткани небольшой пульпы.
- Проинкубируйте культуры ткани скважин при 37 ° C в атмосфере увлажненный воздух (80% влажности) с 5% CO2 2 h предоставлять ткани вложение.
Примечание: Этот шаг может быть продлен до 3-4 ч, контролируя испарения средств массовой информации. - Добавьте соответствующие тома (2-2,5 мл) полный DMEM среды скважин и инкубировать при 37 ° C в атмосфере увлажненный воздух с 5% CO2 для клеток для распространения из ткани.
Примечание: Клетки становятся видимыми после примерно 4 дня и достичь confluency после 8-9 дней. - Когда клетки достигают 80% confluency, извлеките из 6-ну плиты, мыть с 2 мл-фосфатный буфер (PBS) и добавить 2 мл трипсина. Проинкубируйте 2 мин в инкубаторе при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO2. Затем добавьте 2 мл полного среднего DMEM, следуют 2 мин инкубации подавляют трипсина. Центрифуга клетки на 300 x g за 5 мин до Пелле клетки.
- Проход ячейки колбы в полной DMEM СМИ и хранилище для дальнейших экспериментов. Добавить 15 мл полного DMEM СМИ T-75 колб и передачи клетки из двух скважин 6-ну пластины для одной фляги T-75 и инкубировать при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO2.
2. характеристика DPSCs
- Морфологический анализ.
- Клетки (шаг 1.6) семян в культуре ткани с покрытием колбы (или 6-ну пластины) в полной среде DMEM для по крайней мере 8 ходов соблюдать морфологии клеток.
- Визуализировать клетки в световой микроскоп и определить морфологию фибробластоподобных клеток. Клетки должны прикрепить к блюдам культуры и имеют морфологию шпинделя подобных клеток.
Примечание: в качестве альтернативы, клетки могут быть культивировали как отдельные клетки на срок до 14 дней в колодец пластины наблюдать колонии формирования потенциала, который является характеристикой конкретного фибробластов и MSCs.
- Выполнение анализа поверхности маркер.
- Trypsinize клетки от шаге 1.7. Извлеките из T-75 колбу культуры ткани, стирать с 2 мл PBS и добавить 2 мл трипсина. Проинкубируйте 2 мин в инкубаторе при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO2. Затем добавьте 2 мл полного среднего DMEM, следуют 2 мин инкубации подавляют трипсина. Центрифуга клетки на 300 x g за 5 мин до Пелле клетки.
- Исправьте клетки с параформальдегида 4% за 20 мин при комнатной температуре в 1,5 мл пробирок и затем вымыть их с 500 мкл PBS 3 раза для удаления параформальдегида.
- Инкубируйте фиксированные ячейки с антителами против CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 и CD73 за 1 час при температуре 4 ° C в 100 мкл PBS.
Примечание: Концентрация антител используемых-0,5 мкг/мл. CD34, CD14, CD45 используются и как негативные маркеры, а CD29, CD90, CD105, CD166 и CD73 используются как положительный клеточный поверхностных маркеров для MSCs. - Вымыть клетки 3 раза с PBS и использовать соответствующие вторичные антитела флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC), фикоэритрин (PE), и т.д. для маркировки. Инкубируйте клетки с вторичные антитела 1: 500 разбавляют в 100 мкл PBS для 30 мин при температуре 4 ° C и стирка 3 раза с PBS.
- Хранить пробы в темноте для потока cytometry анализ и выявить положительные и отрицательные пятнать подачей cytometry.
Примечание: Используйте клетки неокрашенных управления организовать вперед и боковых скаттер. Расположите стробирования из положительно окрашенных населения, исключая мёртвые клетки, мусора и снимите цветного населения. Использовать 100 мкм сопло с 45 psi оболочка давление и собирать 10000 событий, чтобы определить положительные DPSCs путем организации каналов.
- Выполняют дифференциация DPSCs.
- Семян 1 × 104 клетки на 24-ну пластин в полное DMEM СМИ и инкубировать в течение 24 ч при 37 ° C в атмосфере увлажненный воздух с 5% CO2.
- Сформулировать дифференциация носителей с помощью конкурировать среде DMEM как базового средства массовой информации. Подготовьте Остеогенные СМИ путем смешивания 100 Нм дексаметазон, 10 мм β-метронидазол и аскорбиновой кислоты 0,2 мм. Подготовьте хондрогенном СМИ, смешивая 1 × инсулин трансферрина селен (СТС-G), 100 Нм дексаметазон, 100 нг/мл, преобразовывая фактор роста бета (TGF-β), аскорбиновой кислоты 14 мкг/мл и 1 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА). Подготовьте адипогенном СМИ, смешивая 100 Нм дексаметазон, 5 мкг/мл инсулин, 0.5 мм 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) и 60 мкм индометацином.
Примечание: Дифференциация СМИ могут храниться при температуре 4 ° C для по крайней мере одной недели. - Изменения роста костно-, Хондро-или adipo генной дифференциации СМИ и медиа обновления два раза в неделю в течение двух недель.
- Подтвердите дифференциация по фон Kossa и Альциановый синий окрашивание, активность фермента (активность щелочной фосфатазы), иммуноцитохимии и количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализы согласно ранее описанные протоколы21.
- Фон Kossa и Альциановый синий stainings на клетки, которые крепятся с помощью параформальдегида 4% при комнатной температуре на 10 мин мыть фиксированные ячейки с PBS и выведение их с vonKossa комплект в соответствии с рекомендациями изготовителя наблюдать отложения кальция .
- Подготовьте Альциановый синий окрашивание раствора путем растворения 1.00 g Альциановый синий краситель в 100 мл уксусной кислоты 3% (v/v) для дальнейшего окрашивания. Вымойте фиксированные ячейки с PBS и запятнать клетки для 30 мин раствором Альциановый синий. Визуализируйте окрашенных образцов в световой микроскоп.
3. Подготовка среднего состояния (CM)
- Замените СМИ клеток от шаге 1.7 свежий полный DMEM 24 h до коллекции см.
Примечание: Рекомендуется проход 2-4. - Соберите условие среднего (см) от искусственного DPSCs, когда клетки достигают 80% confluency. Центрифуга собранных средств массовой информации на 300 g x 5 мин для удаления отходов ткани материала и ячейки мусора.
Примечание: в качестве альтернативы используйте 0,2 мкм шприц фильтры для удаления мусора из состояния среды. - Супернатант собирать и хранить при температуре от-20 ° C для дальнейших экспериментов.
Примечание: Держите супернатант в-80 ° C для длительного хранения.
4. лечение раковых клеток с см.
- Выполните анализ жизнеспособности клеток.
- Семя PC-3 клетки (клетки человека рак простаты) на 96-луночных пластин на плотность клеток 5 × 103 клеток/скважины в полное DMEM и инкубировать в камере увлажненной при 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа.
- Лечить клетки с 10, 20, 30, 40 и 50% см (v/v), смешанного с полным DMEM за 24 ч.
- Измерения жизнеспособности клеток с помощью 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (МТС)-проба как описано ранее,24.
- Выполняйте терминала deoxynucleotidyl dUTP трансферазы Ник конце маркировки (TUNEL) анализа.
- PC-3 клетки семян на культуры клеток 6-ну пластины на плотность ячеек 2 × 10-5 клеток/Ну и инкубировать в камере увлажненной при 37 ° C и 5% CO2 на ночь.
- Смешайте 20% CM (v/v) с завершить DMEM среднего и применить к ячейкам на 24 часа.
- Trypsinize клетки и приостановить в 50 мкл реакционной смеси TUNEL (маркировка решения + решение фермента, поставляется с комплектом) и инкубировать при 37 ° C 60 мин в атмосфере CO2 увлажненные и 5%.
Примечание: Для trypsinization, извлеките из 6-ну клетки культуры плиты, мыть с 1 мл раствора PBS и 500 мкл трипсина. Проинкубируйте 2 мин в инкубаторе при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO2. Добавьте 1 mL полного среднего DMEM, следуют 2 мин инкубации подавляют трипсина. Центрифуга клетки на 300 x g за 5 мин до Пелле клетки. - Промойте с PBS и анализа клеток в PBS с помощью проточной цитометрии.
- Анализ ПЦР.
- PC-3 клетки семян на культуры клеток 6-ну пластины на плотность ячеек 2 × 10-5 клеток/Ну и инкубировать в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO2 на ночь.
- Смешайте 20% CM (v/v) с завершить DMEM среднего и применить к ячейкам на 24 часа.
- Trypsinize клетки и собирать Пелле ячейки для изоляции и cDNA синтез РНК.
Примечание: Удалить СМИ от 6-ну клетки культуры плиты, мыть с 1 мл раствора PBS и 500 мкл трипсина. Проинкубируйте 2 мин в инкубаторе при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO2. Добавьте 1 mL полного среднего DMEM, следуют 2 мин инкубации подавляют трипсина. Центрифуга клетки на 300 x g за 5 мин до Пелле клетки. - Выполните ПЦР эксперименты согласно ранее описанных протокол25.
- Выполнение миграции клеток раковых клеток.
- Семян 1 × 10-5 PC-3 клетки на 12-ну пластин и инкубировать в увлажненные инкубатор на ночь при 37 ° C и 5% CO2.
- Поцарапать клетки с наконечником стерильные 200 мкл и изменения среднего сразу с свежей среды, содержащие различные концентрации см [например, 10, 20, 30, 40 и 50% см (v/v), смешанного с полным DMEM].
- Наблюдать за царапин под инвертированным микроскопом и принимать фотографии в разные временные интервалы (0 до 24 ч).
- Мера скретч закрытие с помощью изображений J программного обеспечения, используя формулу:
Примечание: Откройте скретч изображение с изображением J программного обеспечения. Нарисуйте линию, которая имеет ту же величину, как линейки шкалы, которая уже существует в изображении. Нажмите кнопку анализировать, задать масштаб и соблюдать расстояние в пикселях, как увеличение нарисованные линии. Написать размер линейки шкалы в известных расстояние часть, организовать блок (пиксели, см и т.д.) и нажмите кнопку ОК. Перейдите в раздел анализ снова и нажмите на измерениях. Сначала это даст размер линейки шкалы как выбранной единицы. Нажмите на один край нуля и перетащите до достижения другой конец нуля. Обратите внимание на значение для каждой точки времени (0-h и 24 h). Подключите эти значения в формулу выше и рассчитать скретч закрытия.
5. клетки миграции косвенный контакт раковых клеток и DPSCs
- Семенной 3 × 104 DPSCs на 24-ну пластины пластины с 0,4 мкм поры и инкубировать в увлажненные инкубатор на ночь при 37 ° C.
- PC-3 клетки семян на 24-ну плиты на плотность клеток 5 × 104 и инкубировать в увлажненные инкубатор на ночь при 37 ° C и 5% CO2.
- Скретч-PC-3 клетки с наконечником стерильные 200 мкл, изменения среды с свежие среднего и место вставки, перевозящих DPSCs на PC-3 клетки.
- Соблюдать клетки под инвертированным микроскопом и принимать фотографии на различные промежутки времени (0-24 ч) для анализа миграции клеток.
6. совместно культура пробирного и Cytometry анализ потока
- Ярлык PC-3 клетки и DPSCs с помощью PKH67 (зеленый) и PKH26 (красный) люминесцентные клеток компоновщика красители, соответственно26.
- Trypsinize DPSCs и PC-3 клетки, соответственно. Извлеките из T-75 культуры ткани колбу, мыть с 2 мл PBS и добавить 2 мл трипсина. Проинкубируйте 2 мин в инкубаторе при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO2. Добавьте 2 мл полного среднего DMEM, следуют 2 мин инкубации подавляют трипсина.
- Центрифуга клетки на 300 g x 5 минут, удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток окатышей в раствор красителя, подготовленный в буфере разбавителя C поставляется комплект (см. Таблицу материалы).
- Инкубировать клетки в раствор красителя для 10 мин и прекратить окрашивание реакции, добавив 100 мкл FBS. Центрифуга клетки на 300 g x 5 минут, удалить супернатант и вымыть клетки с полный рост среднего до совместного культивирования.
- Плита с надписью клетки (5 × 10-4/также) на 6-ну пластин в соотношении 1:1 (DPSCs: PC3). Поддерживать совместно культивируемых клеток в полной DMEM.
- Соберите клетки после 48 ч или 24 ч инкубационных периодов центрифугированием клеток на 300 x g 5 мин и мытье с PBS.
- Ресуспензируйте клетки в 300 мкл флуоресценции активированный ячейки, сортировка буфера (FACS) в 5 мл вокруг нижней цитометрии расходомерных трубок. Вихрь разойтись агрегаты клеток прямо перед анализа проб.
- Используйте 100 мкм насадку с 45 psi давление оболочкой.
Примечание: Очень высокий расход потока может уменьшить чувствительность флуоресценции обнаружения. - Используйте неокрашенных управления и единого цветные ячейки для настройки соответствующих вперед и стороне точечных лазерных напряжения типов клеток и компенсации, как упоминалось ранее27.
Примечание: Использование стробирования для живых клеток исключить ячейки мусор, мертвые клетки или агрегатов. - Собирать 10 000 событий (100,000 предпочтительно) определить процент положительных DPSCs зеленый и красный PC-3 клетки, устраивая FL-1 (зеленый) и FL-2 (красный) каналы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 изображает общие характеристики MSC DPSCs в условиях культуры. DPSCs оказывают морфология фибробластоподобных клеток после покрытия (Рисунок 1B). MSC поверхностные антигены (CD29, CD73, CD90, CD105 и CD166) очень выражаются во время гемопоэтических маркеры (CD34, CD45 и CD14) являются отрицательные (рис. 1 c). В DPSCs культуре следуют дифференциация коктейль приложения (рис. 1 d)наблюдаются изменения на уровне молекулярных и морфологических связанных с костно-Хондро- и adipo генной дифференциации.
Для определения активности молекул выделяется от DPSCs по миграции и пролиферации клеток рака простаты, мы применили см, который собирается из искусственного Стоматологическая стволовых клеток и проанализированы пролиферации клеток рака и мигрирующих поведение. СМ лечение (20% v/v) был выбран на основе анализа жизнеспособности клеток МТС. PC-3 клетки, получавших стволовых клеток см были подвергнуты TUNEL пробирного и ПЦР анализ для определения регулирования смерти и apoptotic клеток под контролем и экспериментальных условиях. Мы пришли к выводу, что см лечение повышает жизнеспособность клеток и сокращение гибели клеток в культуре PC-3 клетки. Для оценки ли см DPSCs влияет на PC-3 рак клеток миграции был проведен ex vivo миграции assay клетки (царапинам проба). Лечение с концентрацией 10% и 20% CM (v/v) увеличение нуля закрытие значительно по сравнению с контрольной группой на 24 ч (рис. 2). Аналогичным образом 20% CM (v/v) лечения индуцированных upregulation внеклеточная матрица белка гена выражения, такие как коллаген I, фибронектин и Ламинин, которые играют значительную роль в миграции клеток.
Мы использовали два различных культуры методы для установления прямых и косвенных Сопредседатель культур PC-3 клетки и DPSCs условиях ex vivo . Транс ну система была выбрана для создания среды косвенного взаимодействия для PC-3 клетки рака. PC-3 клетки были посеяны на нижней части хорошо пластины и вставок, перевозящих DPSCs были размещены на верхней части. Потому что мы стремились создать в прямое взаимодействие, транс ну мембраны с 0,4 мкм поры были использованы для предотвращения движения физические клетки DPSCs из верхней части в нижней части через мембрану. Выделяется молекул из DPSCs увеличился нуля закрытие PC-3 клетки значительно по сравнению с клетки управления. PC-3 клетки культивировали совместно с DPSCs продемонстрировал 51% нуля закрытия хотя клетки управления закрытия 38% после 24 часов (рис. 3A). Прямого Совместно культур, содержащих соотношение 1:1 DPSCs и PC-3 клетки были использованы для анализа самоорганизации стволовых клеток и клеток рака. Клетки окрашивали красителями красной и зеленой мембраны для различения различных типов клеток под микроскопом. PC-3 клетки, окрашенных с красной флуоресцентной краской были окружены DPSCs ламповую структуры после инкубационного периода 24 h. Совместно культивируемых клеток окрашенных с флуоресцентными красителями были проанализированы проточной цитометрии, основанный на окрашивание флуоресценции, и соотношения ячеек были обнаружены. DPSCs и PC-3 клетки создана хорошо организованная структура, в которой PC-3 клетки распространяются быстро после 48 ч (рис. 3B). Хотя клетки были посеяны в равной пропорции (1:1) для прямого сотрудничества культуры, 62.22% PC-3 клетки были определены после 48 ч инкубации, указав более высокие темпы распространения PC-3 клетки.
Рисунок 1: характеристика пульпы зуба стволовых клеток (DPSCs). (A) целлюлозы ткани, полученные от центра зуба. (B) фибробластоподобных клеток морфология DPSCs. шкалы бар: 100 мкм. (C) потока cytometry анализ DPSCs. CD29, CD73, CD90, CD105 и CD 166 являются позитивные поверхностных маркеров, а CD14, CD34, и CD45 негативные поверхностных маркеров. NC: отрицательный контроль (роста среднего лечения клетки). (D) дифференциация DPSCs для типов мезенхимальных клеток было подтверждено с фон Kossa, окрашивание, Альциановый синий окрашивание и липидного капель (шкалы бар: 200 мкм). Остеокальцин, коллаген типа II (Col II) и белок, связывающий жирные кислоты 4 (FABP4) immunostainings показал костно - Хондро- и адипогенном дифференциация DPSCs. Шкала бар: 200 мкм. Эта цифра приспособлен от Доган и др. 34. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: коллекции состояния среды (CM) от DPSCs для анализа клеток жизнеспособность и нуля. TUNEL позитивные клетки были снижены на 20% CM (v/v) приложения. Количественное измерение скретч закрытия показал, что см ростом миграции PC-3 клетки. СМ: кондиционером среднего; NC: отрицательный контроль (роста среднего лечения клетки). * P < 0,05. Эта цифра приспособлен от Доган и др. 34. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: методология для assay переноса транс ну клетки и Сопредседатель культуры. (A) PC-3 клетки скретч закрытие в системе Транс ну совместно культуры. (B) Взаимодействие Шаблон окрашенных DPSCs (зеленая Флуоресценция) и PC-3 клетки (красной флуоресценцией) после 24 h и 48 h совместно культуры (посева соотношение 1:1). PC-3 клетки больше был обнаружен в отношении DPSCs. Шкала бар: 200 мкм. Эта цифра приспособлен от Доган и др. 34. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вклад MSCs опухоли окружающей среды регулируется ряд взаимодействия включая гибридных клеток поколения через ячейку сплавливания, entosis или цитокинов и хемокиновых деятельности между стволовых клеток и клеток рака28. Структурная организация, ячеек взаимодействий и выделяется факторы определяют поведение клеток рака с точки зрения поощрения опухоли, прогрессии и метастазов в окружающие ткани. Надлежащего ex vivo модель системы для изучения механизмов за взаимодействий резидентов клеточных популяций требуются понять сотовой связи для прогрессии рака и метастаз.
Мы использовали DPSCs для создания модели системы для рака простаты и стоматологическая стволовых клеток взаимодействий. Преимущество этого типа стволовых клеток взрослого человека является доступность источника ткани и легко изоляции шаги. С другой стороны используя только DPSCs без сравнения с типами известных взрослых стволовых клеток является ограничением этого протокола. Нынешние методы совместного культуры делятся на прямые и косвенные методы, которые включают паракринными сигнализации растворимых секретируемые молекул и прямым культура различных клеточных популяций в том же среды29,30, 31. СМ полностью характеризуется DPSCs был использован для оценки паракринными сигнализации рост опосредованной раковых клеток в культуре. СМ приложение является самым простым методом для ячейки исследования взаимодействия и позволяет для наблюдения деятельности растворимых посредника в системе культуры. Хотя см не является полностью адекватной модели системы, см приложение как метод совместного культуры очень эффективно соблюдать ячеек взаимодействия ex vivo. СМ DPSCs возросла клеточной пролиферации и миграции клеток рака простаты, указанием на приобретение метастатическим фенотип вследствие факторов, выделяется из DPSCs.
Другая модель взаимодействия ячейке является создание физического барьера, таких как транс ну мембрану между клеток населения30. Транс ну системы делятся на два типа: те, которые позволяют клеточного движения через поры и те включение передачи секретируемые факторов препятствуя клеток контакт через мембрану, а также. Мы использовали транс скважин с размером пор 0,4 мкм для анализа закрытие PC-3 царапины, показывая высокие темпы миграции клеток рака в группе DPSC, по сравнению с ячейками элемента управления.
Хотя см и транс ну систем, основанных на выгодных для просто анализа вклада в конкретной ячейке тип32, прямой культивирования различных субпопуляций в той же среде необходимо параллельно с косвенным Сопредседатель культуры методами. Коэффициент заполнения может управляться и структурной организации различных групп населения может быть легко проанализирован прямого сотрудничества культуры MSC с раковых клеток. Мы использовали соотношение 1:1 DPSCs и PC-3 клетки окрашивали зеленой и красной флуоресценцией мембраны красители, соответственно. DPSCs окружают PC-3 клетки и создал ламповую структуры в скважинах культуры. PC-3 клетки образуется кластеров в виде островков, окруженный канал как структуры, созданные DPSCs.
Недавно Брунетти et al. показал, что DPSCs выделяют TNF-связанных лигандов индуцировать апоптоз (TRAIL) во время Остеогенные дифференциации и затрагивают миеломы рака жизнеспособность клеток, указав возможные взаимодействия Стоматологическая стволовых клеток с раком клетки33. Наше исследование является первым докладом, который оценивает взаимодействия стоматологических производных MSCs и раковые клетки простаты как модель ex vivo . Три различных прямого/косвенного подхода мы использовали в наших экспериментах. Распространение раковых клеток и высокой миграции ставки были обнаружены см и транс ну анализов или совместного культивирования дифференциально окрашенные клетки, что позволяет несколько взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Университет Yeditepe. Все данные и показатели, используемые в этой статье были ранее опубликованы34.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. Dental Stem Cells. , Springer. 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -r, et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -S., Lee, H. -Y., Kang, K. -S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Biomimetics and Stem Cells. , Springer. 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
