Summary
Wir bieten Protokolle zur Evaluation von mesenchymalen Stammzellen isoliert von Zahnpulpa und Prostata-Krebs-Zell-Interaktionen basierend auf direkten und indirekten Co Kulturmethoden. Zustand Medium und Trans-gut Membranen eignen sich zur indirekten parakrine Aktivität zu analysieren. Seeding differentiell ist gefärbten Zellen zusammen ein geeignetes Modell für direkten Zell-Zell-Interaktion.
Abstract
Krebs als mehrstufiger Prozess und komplizierte Krankheit ist nicht nur von einzelnen Zellproliferation und Wachstum reguliert aber auch Tumor-Umgebung und Zell-Zell-Interaktionen gesteuert. Identifizierung von Krebs und Stammzell-Interaktionen, einschließlich Änderungen der extrazellulären Umgebung, physikalischen Wechselwirkungen und sezernierten Faktoren, könnte die Entdeckung von neuen Therapieoptionen ermöglichen. Wir kombinieren bekannte Kokultur Techniken um ein Modellsystem zur mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Krebs Zell-Interaktionen zu erstellen. In der aktuellen Studie wurden durch direkte und indirekte Co Kulturtechniken Zahnpulpa Stammzellen (DPSCs) und PC-3-Prostata-Krebs-Zell-Interaktionen untersucht. Zustand-Medium (CM) aus DPSCs und 0,4 µm Größe Pore Trans-gut Membranen wurden verwendet, um parakrine Aktivität zu studieren. Kokultur verschiedener Zelltypen wurde gemeinsam durchgeführt, um direkten Zell-Zell-Interaktion zu studieren. Die Ergebnisse zeigten, dass CM Zellproliferation erhöht und Apoptose in Zellkulturen Prostatakrebs verringert. CM und Trans-gut System Kapazitätssteigerung Zelle Migration von PC-3 Zellen. Zellen mit verschiedenen Membran Farbstoffen gefärbt wurden in der gleichen Kulturgefäße entkernt und DPSCs nahmen an einer selbstorganisierten Struktur mit PC-3 Zellen unter diesen direkten Kokultur Zustand. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass Kokultur Techniken als Modellsystem für Krebs und MSC Interaktionen nützlich sein könnten.
Introduction
Mesenchymaler Stammzellen (MSCs), mit der Möglichkeit der Differenzierung und Beitrag zur Regeneration von mesenchymalen Geweben wie Knochen, Knorpel, Muskeln, Bänder, Sehnen und Fettgewebe, wurden von fast allen Geweben im Körper eines Erwachsenen1 isoliert , 2. außer Bereitstellung von Gewebe Homöostase von produzierenden residente Zellen im Falle einer chronischen Entzündung oder einer Verletzung, sie produzieren lebenswichtige Zytokine und Wachstumsfaktoren, Angiogenese, Immunsystem und Gewebe Umbau3zu orchestrieren. Das Zusammenspiel von MSCs mit Krebsgewebe ist nicht gut verstanden, aber sammeln Hinweise darauf, dass MSCs Tumor Einleitung, Progression und Metastasierung4fördern könnte.
Die zielsuchende Fähigkeit der MSCs auf den verletzten oder chronisch entzündeten Bereich macht sie eine wertvolle Kandidat für stammzellbasierte Therapien. Jedoch frei Krebsgewebe, "niemals Wunden zu heilen", auch inflammatorischen Zytokinen, Pro-angiogenen Moleküle und wichtige Wachstumsfaktoren, die MSCs auf Cancerogenous Gebiet5zu gewinnen. Zwar gibt es begrenzte berichtet Berichte zeigen hemmende Wirkung von MSCs auf Krebs Wachstum6,7, Tumorprogression und deren Metastasen Förderung Effekte ausgiebig gewesen8. MSCs beeinflussen direkt oder indirekt Karzinogenese auf unterschiedliche Weise einschließlich Unterdrückung von Immunzellen, die Sekretion von Wachstumsfaktoren/Zytokine, die Krebs-Zell-Proliferation und Migration, Verbesserung angiogene Aktivität und Regulierung unterstützen epitheliale-mesenchymale Transition (EMT)9,10. Tumor-Umgebung besteht aus mehreren Zelltypen, einschließlich Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) und/oder Myofibroblasts, Endothelzellen, Adipozyten und Immunzellen11. CAFs sind diejenigen die am häufigsten vorkommenden Zelltyp im Bereich Tumor, die verschiedenen Chemokine fördern Krebs Wachstum und Metastasierung8absondern. Es hat sich gezeigt, dass Knochenmark stammenden MSCs in CAFs in der Tumor-Stroma-12differenzieren können.
Zahnpulpa Stammzellen (DPSCs), als die ersten dental Gewebe abgeleitet MSCs zeichnet sich durch Gronthos Et al. 13 im Jahr 2000 und dann weit von anderen untersuchten14,15, express Pluripotenz Markierungen wie Oct4, Sox2und Nanog16 und kann in verschiedenen Zelle Linages17unterscheiden. Gen und Protein Expressionsanalyse bewiesen, dass DPSCs vergleichbarem Wachstumsfaktoren/Zytokine mit anderen MSCs wie vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Angiogenin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2), Interleukin-4 (IL-4), produzieren IL-6, IL-10, und Stammzell-Faktor (SCF) sowie Fms-wie Tyrosin-Kinase-3 Liganden (Flt - 3L), die Förderung der Angiogenese, modulieren Immunzellen, und unterstützen Krebs-Zell-Proliferation und Migration18,19,20 . Während die Wechselwirkungen von MSCs mit Krebs-Umgebung in der Literatur gut dokumentiert wurden, wurde die Beziehung zwischen DPSCs und Krebszellen noch nicht ausgewertet. In der vorliegenden Studie haben wir Kokulturen und Zustand mittlerer Behandlungsstrategien für eine höchst metastasierendem Prostatakrebs-Zelllinie, PC-3 und DPSCs, mögliche Maßnahmen des Mechanismus der zahnärztlichen MSCs Tumorprogression und Metastasierung.
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Protocol
Schriftliche Einwilligung der Patienten war der institutionellen Ethik-Kommission nach der Genehmigung eingeholt.
1. DPSC Isolation und Kultur
- Weisheitszähne, die von jungen Erwachsenen im Alter zwischen 17 und 20 bis 15 mL Röhrchen mit kompletten Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) erhalten zu übertragen [niedrige Glukose DMEM Medien, ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin / Amphotericin (PSA) Lösung], innerhalb von 8 Stunden nach der Resektion. Halten Sie das Gewebematerial kalt (4 ° C) während der Übertragung zu potenziellen Zelltod zu vermeiden.
- Entfernen Sie das Pulpagewebe durch sterile Gewinnung Zange aus der Mitte des Zahnes sorgfältig zu, legen Sie das Pulpagewebe im kalten komplette DMEM Medium in 10 cm Gewebekultur Gerichte und hacken sie in kleine Stücke (2-3 mm) mit Skalpell.
Hinweis: Alle experimentelle Verfahren sollte unter sterilen Bedingungen in Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Diese nicht-enzymatische Technik wurde bisher verwendeten21,22,23. - Ort kleine Zellstoff Gewebe im Inneren der Gewebekultur behandelt 6-Well Platten und fügen Sie 200 µL der komplette DMEM Medien um jeden kleinen Zellstoff Gewebe Stücke zu decken.
- Inkubieren Sie die Gewebekultur Brunnen bei 37 ° C in eine befeuchtete Luftatmosphäre (80 % Luftfeuchtigkeit) mit 5 % CO2 für 2 h um Gewebe Anhang bereitzustellen.
Hinweis: Dieser Schritt konnte bis ca. 3-4 h verlängert werden, durch die Verdunstung der Medien zu kontrollieren. - Fügen Sie entsprechende Volumen (2-2,5 mL) des kompletten DMEM Medium in die Vertiefungen und Inkubation bei 37 ° C in eine befeuchtete Luftatmosphäre mit 5 % CO2 Zellen aus dem Gewebe zu verbreiten.
Hinweis: Zellen werden nach ca. 4 Tagen sichtbar und Konfluenz nach 8-9 Tagen zu erreichen. - Wenn Zellen 80 % Konfluenz erreichen, Medien aus 6-Well Platten entfernen, waschen mit 2 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), und 2 mL Trypsin. 2 min in einem Inkubator bei 37 ° C mit befeuchtete Luft-Atmosphäre und 5 % CO2inkubieren. Fügen Sie dann 2 mL des kompletten DMEM Medium, gefolgt von 2 min Inkubation, Trypsin zu hemmen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g für 5 min zum pellet-Zellen.
- Durchgang Zellen die Fläschchen im kompletten DMEM Medien und Store für weitere Experimente. Hinzu 15 mL komplette DMEM Media, T-75 Kolben und Transfer Zellen aus zwei Brunnen der 6-Well-Platte auf einer T-75 Flaschen und Inkubation bei 37 ° C mit befeuchtete Luft-Atmosphäre und 5 % CO2.
2. Charakterisierung von DPSCs
- Durchzuführen Sie morphologische Analysen.
- Samenzellen (Schritt 1.6) in der Gewebekultur beschichtet Flaschen (oder 6-Well Platten) in kompletten DMEM Medium für mindestens 8 Passagen Zellmorphologie beobachten.
- Zellen durch Lichtmikroskop visualisieren und Fibroblasten-wie Zellmorphologie definieren. Zellen sollten die Kultur Gerichte beimessen und Spindel-wie Zellmorphologie haben.
Hinweis: Alternativ können Zellen kultiviert werden als Einzelzellen bis zu 14 Tage im Well-Platten, Kolonie Bildung Kapazität zu beobachten, die ein bestimmtes Merkmal von Fibroblasten und MSCs ist.
- Durchzuführen Sie Surface Marker Analysen.
- Trypsinize der Zellen aus Schritt 1,7. Entfernen Sie Medien aus der T-75-Gewebekultur-Flasche, mit 2 mL PBS waschen Sie, und 2 mL Trypsin. 2 min in einem Inkubator bei 37 ° C mit befeuchtete Luft-Atmosphäre und 5 % CO2inkubieren. Fügen Sie dann 2 mL des kompletten DMEM Medium, gefolgt von 2 min Inkubation, Trypsin zu hemmen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g für 5 min zum pellet-Zellen.
- Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur in 1,5 mL Tuben und dann waschen Sie sie mit 500 µL PBS 3mal Paraformaldehyd entfernen.
- Inkubieren Sie fixe Zellen mit Antikörpern gegen CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 und CD73 für 1 h bei 4 ° C in 100 µL PBS.
Hinweis: 0,5 µg/mL ist die Konzentration der Antikörper verwendet. CD34, CD14 und CD45 sind als negative Marker verwendet, während CD29, CD90, CD105, CD166 und CD73 als positive Zelle Oberflächenmarker für MSCs verwendet werden. - Zellen 3 Mal mit PBS waschen und jeweiligen Sekundärantikörper wie Fluorescein erfolgt (FITC), Phycoerythrin (PE), etc. für die Kennzeichnung zu verwenden. Inkubieren Sie Zellen mit 1: 500 verdünnt Sekundärantikörper in 100 µL PBS für 30 min bei 4 ° C und 3 Mal mit PBS waschen.
- Halten Sie Proben in der Dunkelheit für Flow-Zytometrie-Analyse und erkennen Sie positive und negative Färbung durch Durchflusszytometrie zu.
Hinweis: Verwenden Sie ungefärbten Kontrollzellen, um nach vorn und seitliche Streuung zu arrangieren. Ordnen Sie positiv Anspritzung Populationen befleckt durch tote Zellen, Schmutz und UN-gefärbten Bevölkerung ausschließen. Verwenden Sie 100 µm-Düse mit 45 Psi Scheide Druck und sammeln Sie 10.000 Veranstaltungen um positive DPSCs zu bestimmen, durch die Anordnung der Kanäle.
- Führen Sie Differenzierung der DPSCs.
- 1 × 104 Samenzellen auf 24-Well-Platten in DMEM Medien füllen und 24 h bei 37 ° C in eine befeuchtete Luftatmosphäre mit 5 % CO2inkubieren.
- Differenzierung zu formulieren Medien mit konkurrieren DMEM Medium als Basis Medien. Bereiten Sie durch Mischen von 100 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat und 0,2 mM Ascorbinsäure osteogene Medien vor. Bereiten Sie Chondrogenic Medien durch Mischen von 1 × Insulin-Transferrin-Selen (ITS-G), 100 nM Dexamethason, 100 ng/mL transformierenden Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β), 14 μg/mL Ascorbinsäure und 1 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA vor). Bereiten Sie durch Mischen von 100 nM Dexamethason, 5 μg/mL Insulin, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) und 60 μM Indometacin adipogenen Medien vor.
Hinweis: Differenzierung Medien können für mindestens eine Woche bei 4 ° C gehalten werden. - Ändern Sie Wachstum, Osteo, Knorpel oder Adipo-genetische Differenzierung Medien und Refresh-Medien zweimal pro Woche für zwei Wochen.
- Differenzierung von Kossa und Alcian Blaufärbung, Enzym-Aktivität (Aktivität der alkalischen Phosphatase), Immunocytochemistry und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Analysen gemäß den Protokollen beschriebenen21zu bestätigen.
- Durchführen von Kossa und Alcian blau Färbungen auf Zellen, die mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 10 min. befestigt sind die festen Zellen mit PBS waschen und färben sie mit dem VonKossa Kit entsprechend den Empfehlungen des Herstellers um Kalkablagerungen zu beobachten .
- Vorbereiten der Alcian blau Färbelösung durch Auflösung 1,00 g Alcian blau färben in 100 mL 3 % (V/V) Essigsäure für weitere Färbung. Waschen Sie die festen Zellen mit PBS und Flecken Sie Zellen für 30 min mit Alcian blau Lösung. Visualisieren Sie die gefärbten Proben durch ein Lichtmikroskop.
3. Vorbereitung der Zustand Medium (CM)
- Medien von Zellen aus Schritt 1,7 mit frischen komplette DMEM 24 h vor der CM Abholung zu ersetzen.
Hinweis: Passage 2-4 wird empfohlen. - Sammeln Sie Zustand Medium (CM) von kultivierten DPSCs, wenn Zellen 80 % Konfluenz zu erreichen. Zentrifugieren Sie gesammelten Medien bei 300 X g für 5 min, überflüssige Gewebe Material und Zelle Ablagerungen zu entfernen.
Hinweis: Alternativ verwenden Sie 0,2 µm Spritze Filter, um Schmutz aus dem Zustand Medium. - Überstand erheben und speichern bei-20 ° C für weitere Experimente.
Hinweis: Bewahren Sie den Überstand bei-80 ° C für die langfristige Lagerung.
4. Behandlung von Krebszellen mit CM
- Durchzuführen Sie Zelle Lebensfähigkeit Analysen.
- Samen PC-3 Zellen (menschliche Prostatakrebszellen) auf 96-Well-Platten in einer Zelle Dichte von 5 × 103 Zellen/Brunnen in DMEM füllen und in eine feuchte Kammer bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h inkubieren.
- Zellen mit 10, 20, 30, 40 und 50 % (V/V) cm gemischt mit kompletten DMEM für 24 h zu behandeln.
- Messen der Zellviabilität mithilfe von 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (MTS)-assay bereits24beschrieben.
- Durchführen Sie Klemme Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick Ende Kennzeichnung (TUNEL) Analysen.
- PC-3 Samenzellen auf 6-Well-Zellkultur Platten in einer Zelle Dichte von 2 × 105 Zellen/gut und inkubieren Sie über Nacht in eine feuchte Kammer bei 37 ° C und 5 % CO2 .
- Mischen Sie 20 % (V/V) CM mit komplett DMEM Medium und gelten für die Zellen für 24 h.
- Trypsinize Zellen und in 50 μL der TUNEL Reaktionsgemisch (Kennzeichnung Lösung + Enzymlösung, mit dem Kit geliefert) und Inkubation bei 37 ° C für 60 min in eine befeuchtete und 5 % CO2 -Atmosphäre.
Hinweis: Für Trypsinization, 6-Well Zellplatten Kultur Medien entfernen, mit 1 mL PBS waschen und 500 µL von Trypsin. 2 min in einem Inkubator bei 37 ° C mit befeuchtete Luft-Atmosphäre und 5 % CO2inkubieren. Fügen Sie 1 mL der kompletten DMEM Medium, gefolgt von 2 min Inkubation, Trypsin zu hemmen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g für 5 min zum pellet-Zellen. - Spülen mit PBS und Zellen mit PBS-Puffer mittels Durchflusszytometrie zu analysieren.
- Durchzuführen Sie qPCR Analysen.
- PC-3 Samenzellen auf 6-Well-Zellkultur Platten in einer Zelle Dichte von 2 × 105 Zellen/gut und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 über Nacht inkubieren.
- Mischen Sie 20 % (V/V) CM mit komplett DMEM Medium und gelten für die Zellen für 24 h.
- Trypsinize Zellen und Zelle Pellet für RNA-Isolation und cDNA Synthese zu sammeln.
Hinweis: Entfernen Sie Medien aus 6-Well Zellplatten Kultur, mit 1 mL PBS waschen und 500 µL von Trypsin hinzufügen. Inkubieren Sie 2 min. im Inkubator bei 37 ° C mit befeuchtete Luft-Atmosphäre und 5 % CO2. Fügen Sie 1 mL der kompletten DMEM Medium, gefolgt von 2 min Inkubation, Trypsin zu hemmen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g für 5 min zum pellet-Zellen. - Durchführen Sie qPCR Experimente nach den zuvor beschriebenen Protokoll25.
- Führen Sie Zelle Migration von Krebszellen.
- Samen 1 × 105 PC-3 Zellen auf 12-Well-Platten und in einem befeuchteten Inkubator über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.
- Zellen mit einer sterilen 200 μL Spitze kratzen und Medium sofort mit frischem Medium mit verschiedenen Konzentrationen von CM verändern [z. B.10, 20, 30, 40 und 50 % der CM (V/V) gemischt mit kompletten DMEM].
- Kratzer unter einem inversen Mikroskop beobachten und Fotografieren in unterschiedlichen Zeitabständen (0 bis 24 Uhr).
- Messen Sie die Scratch Verschluss mittels Bild J-Software mit Hilfe der Formel:
Hinweis: Öffnen Sie das Kratzen Bild mit Bild J Software. Zeichnen Sie eine Linie mit der gleichen Größenordnung wie die Maßstabsleiste, die bereits im Bild vorhanden ist. Klicken Sie auf analysieren, Maßstab und Abstand in Pixel als die Vergrößerung der gezeichneten Linie zu beobachten. Schreiben Sie die Größe des Maßstabs auf der bekannten Strecke Teil, arrangieren Sie Einheit (Pixel, cm usw.)und klicken Sie auf ok. Wieder in den Bereich "analysieren" und klicken Sie auf Messungen. Dies wird zuerst die Größe des Maßstabs als die gewählte Einheit geben. Klicken Sie auf eine Kante von Grund auf und ziehen Sie bis zum anderen Ende des Kratzers erreichen. Notieren Sie den Wert für jeden Zeitpunkt (0 h und 24 h). Stecken Sie diese Werte in der obigen Formel und berechnen Sie die Kratzer Schließung zu.
5. die Zellwanderung durch indirekten Kontakt von Krebszellen und DPSCs
- Samen 3 × 104 DPSCs auf 24-Well-Platte Einsätze mit 0,4 μm Porengröße und in einem befeuchteten Inkubator über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- PC-3 Samenzellen auf 24-Well-Platten in einer Zelle Dichte von 5 × 104 und in einem befeuchteten Inkubator über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.
- Kratzen Sie PC-3 Zellen mit einer sterilen 200 μL Spitze, verändern Sie Medium mit frischem Medium und platzieren Sie Einsätze mit DPSCs auf PC-3 Zellen.
- Zellen, die unter einem inversen Mikroskop beobachten und Fotografieren in unterschiedlichen Zeitabständen (0 bis 24 h), Zellwanderung zu analysieren.
(6) Co-Kultur-Assay und Flow Cytometry Analysis
- Beschriften Sie PC-3 Zellen und DPSCs mithilfe von PKH67 (grün) und PKH26 (rot) fluoreszierende Zelle Linker Farbstoffe, bzw.26.
- PC-3 und DPSCs Zellen, bzw. trypsinize. Entfernen Sie Medien aus T-75 Gewebekultur Kolben, mit 2 mL PBS waschen Sie, und 2 mL Trypsin. 2 min in einem Inkubator bei 37 ° C mit befeuchtete Luft-Atmosphäre und 5 % CO2inkubieren. Fügen Sie 2 mL des kompletten DMEM Medium, gefolgt von 2 min Inkubation, Trypsin zu hemmen.
- Zellen bei 300 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen Zelle Pellets in die Farbstofflösung in Verdünnungsmittel-C Puffer vom Kit vorbereitet (siehe Tabelle der Materialien).
- Zellen in der Farbstofflösung für 10 min inkubieren und die Färbung Reaktion durch Zugabe von 100 µL der FBS zu kündigen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g für 5 min, verwerfen Sie überstand, und waschen Sie die Zellen mit vollständigen Wachstumsmedium vor Co Kultivierung.
- Platte mit der Bezeichnung Zellen (5 × 10-4/Na) auf 6-Well-Platten im Verhältnis 1:1 (DPSCs: PC3). Pflegen Sie Co kultivierte Zellen in kompletten DMEM.
- Sammeln Sie Zellen nach 24 h oder 48 h Inkubationszeiten durch Zentrifugation von Zellen bei 300 X g für 5 min und waschen mit PBS.
- Aufzuwirbeln Sie Zellen in 300 µL der Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Puffer in 5 mL Rundrohre unten Flow Cytometry. Wirbel, Zelle Aggregate vor der Analyse von Proben zu verteilen.
- Verwenden Sie eine Düse 100 µm mit 45 Psi Scheide Druck.
Anmerkung: Extrem hohe Durchflussmenge kann die Nachweisempfindlichkeit Fluoreszenz verringern. - Verwenden Sie ungefärbten Kontrollzellen und farbigen Einzelzellen entsprechenden Forward und Side Scatter Laser Spannung Zelltypen und Entschädigung, wie bereits erwähnt27anpassen.
Hinweis: Verwenden Sie gating für lebende Zellen, um Zelle Trümmer, tote Zellen oder Aggregate auszuschließen. - Sammeln Sie 10.000 Veranstaltungen (100.000 ist vorzuziehen) um Prozent positive grüne DPSCs und rote PC-3 Zellen zu bestimmen, durch Vermittlung von FL-1 (grün) und FL-2 (rot) Kanäle.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die allgemeinen Merkmale der MSC der DPSCs unter Kulturbedingungen. DPSCs üben Fibroblasten-wie Zellmorphologie nach Beschichtung (Abbildung 1 b). MSC Oberflächenantigenen (CD29, CD73, CD90, CD105 und CD166) sind hoch während der hämatopoetischen Marker (CD34, CD45 und CD14) ausgedrückt sind negativ (Abbildung 1). Änderungen auf der morphologischen und molekularen Ebene im Zusammenhang mit Osteo-protektiven und Adipo-genetische Differenzierung in DPSCs Kultur, gefolgt von der Differenzierung cocktail Anwendung (Abbildung 1)beobachtet werden.
Um die Aktivität der sekretierten Moleküle aus DPSCs auf Prostata-Krebs-Zell-Proliferation und Migration zu ermitteln, haben wir CM, die von kultivierten zahnmedizinische Stammzellen gesammelt und analysiert Krebs Zellproliferation und Wanderungsverhalten angewandt. CM-Behandlung (20 % V/V) wurde basierend auf MTS Zelle Lebensfähigkeit Analysen ausgewählt. PC-3 Zellen mit Stammzellen CM behandelt wurden die TUNEL Assay und qPCR Analysen zu Tod und Apoptotic Zellregulation unter Kontrolle und experimentellen Bedingungen bestimmen unterzogen. Wir festgestellt, dass CM Behandlung Zellviabilität erhöht und Zelltod in der Zellkultur PC-3 reduziert. Ex Vivo Zelle Migration Assay (Scratch Assay) wurde durchgeführt, um festzustellen, ob CM DPSCs PC-3 Krebs Zellwanderung beeinflusst. Behandlung mit der Konzentrationen von 10 % und 20 % CM (V/V) erhöht Scratch Verschluss deutlich im Vergleich zur Kontrollgruppe um 24 Uhr (Abbildung 2). Ebenso induzierte 20 % CM (V/V) Behandlung Hochregulation der extrazellulären Matrix-Protein-gen Ausdrücke wie Kollagen I, Fibronektin und Laminin, die Zellwanderung bedeutende Rollen spielen.
Wir verwendet zwei verschiedene Kulturtechniken, um direkte und indirekte Co Kulturen von PC-3 Zellen und DPSCs unter ex-Vivo -Bedingungen zu etablieren. Trans-gut System wurde ausgewählt, um eine indirekte Wechselwirkung Umgebung für PC-3 Krebszellen zu schaffen. PC-3 Zellen wurden auf der Unterseite der Platte gut ausgesät und Einsätze mit DPSCs auf der Oberseite platziert wurden. Weil es unser eine in direkte Interaktion zu erzeugen Ziel, wurden Trans-gut Membranen mit 0,4 μm Porengröße verwendet, um physische Zelle Bewegung der DPSCs vom Oberteil, Unterteil durch die Membran zu verhindern. Sekretierten Moleküle aus DPSCs erhöht kratzfest Schließung des PC-3 Zellen signifikant im Vergleich zu Kontrollzellen. PC-3 Zellen mit DPSCs Co kultiviert demonstriert einen 51 % Scratch Verschluss während Kontrollzellen einen Verschluss 38 % nach 24 h (Abb. 3A hatte). Direkte Co Kulturen mit 1:1 Verhältnis von DPSCs und PC-3 Zellen wurden zur Selbstorganisation von Stammzellen und Krebszellen zu analysieren. Zellen waren voller Flecken mit roten und grünen Membran Farbstoffe, verschiedene Zelltypen unter Mikroskop zu unterscheiden. PC-3 Zellen mit rote Fluoreszenz-Farbstoff gefärbt waren nach einer Inkubationszeit von 24 h in einer röhrenförmigen Struktur von DPSCs umgeben. Co kultivierte Zellen mit Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt analysiert wurden durch Durchflusszytometrie basierend auf Fluoreszenz Färbung und Zelle-Verhältnisse wurden erkannt. DPSCs und PC-3 Zellen erstellt eine übersichtliche Struktur in die PC-3 Zellen rasch nach 48 h (Abb. 3 b)stark vermehrt. Obwohl die Zellen zu einem gleichberechtigten Verhältnis (1:1) für direkte Kokultur ausgesät wurden, wurden 62.22 % der PC-3 Zellen nach 48 h Inkubation, unter Angabe der höheren Proliferationsrate von PC-3 Zellen bestimmt.
Abbildung 1: Charakterisierung der Zahnpulpa Stammzellen (DPSCs). (A) Zellstoff Gewebe aus der Mitte des Zahnes gewonnen. (B) Fibroblast-wie Zellmorphologie DPSCs. Skala Bar: 100 μm. (C) Flow Cytometry Analysen von DPSCs. CD29 CD73, CD90, CD105 und CD 166 sind positive Oberflächenmarker, während CD14, CD34, und CD45 sind negative Oberflächenmarker. NC: negative Kontrolle (Wachstumsmedium behandelten Zellen). (D) Differenzierung des DPSCs, Arten von mesenchymalen Zellen wurde bestätigt von Kossa Färbung, Alcian blau Färbung, mit Lipid-Tröpfchen (Maßstabsleiste: 200 μm). Osteocalcin, Kollagen Typ II (Col II) und Fettsäure-bindendes Protein 4 (FABP4) Immunostainings zeigte die Osteo, protektiven und adipogenen Differenzierung der DPSCs Skala: 200 μm. Diese Zahl ist von Dogan Et al. 34. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Sammlung von Zustand Medium (CM) von DPSCs für die Zelle Entwicklungsfähigkeit und Kratzer Analysen. TUNEL positive Zellen wurden um 20 % (V/V) CM Anwendung verringert. Quantitative Messung der Kratzer Schließung zeigte, dass CM PC-3 Zellwanderung erhöht. CM: konditionierten Medium; NC: negative Kontrolle (Wachstumsmedium behandelten Zellen). * P < 0,05. Diese Zahl ist von Dogan Et al. 34. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Methodik für Trans-Brunnen Zelle Migration Assay und Kokultur. (A) PC-3 Zelle, Scratch Verschluss in der Trans-Brunnen Kokulturen-System. (B) Interaktionsmuster der befleckten DPSCs (grüne Fluoreszenz) und PC-3 Zellen (rote Fluoreszenz) nach 24 h und 48 h von Kokulturen (Aussaat Verhältnis 1:1). Höhere Anzahl von Zellen PC-3 wurde in Bezug auf DPSCs. Maßstabsleiste erkannt: 200 μm. Diese Zahl ist von Dogan Et al. 34. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Beitrag von MSCs zur Tumor-Umgebung ist durch mehrere Interaktionen einschließlich Hybrid Zelle Generation über Zelle Fusionen, Entosis oder Cytokine und Chemokin Aktivitäten zwischen Stammzellen und Krebs Zellen28geregelt. Aufbauorganisation, Zell-Zell-Interaktionen und sezernierten Faktoren bestimmen Krebs Zelle Verhalten in Bezug auf die Tumor-Promotion, Progression und Metastasierung in die umliegenden Gewebe. Richtige ex Vivo Modellsysteme untersuchen die Mechanismen hinter der Wechselwirkungen von resident Zellpopulationen sind verpflichtet, Mobilfunk für Tumorprogression und Metastasierung zu verstehen.
Wir DPSCs ein Modellsystem für Prostatakrebs und zahnmedizinische Stammzellen Interaktionen zum Erstellen verwendet. Der Vorteil dieser Art von adulten Stammzellen ist die Zugänglichkeit der Gewebe Quelle und einfache Isolierung Schritte. Auf der anderen Seite ist mit nur DPSCs ohne Vergleich mit bekannten adulten Stammzellen Arten eine Einschränkung dieses Protokolls. Aktuelle Kokultur Methoden werden in direkte und indirekte Techniken eingeteilt, darunter parakrine Signalisierung des sekretierten lösliche Moleküle und direkte Kultur unterschiedliche Zellpopulationen in der gleichen Umgebung29,30, 31. CM der voll gekennzeichnete DPSCs wurde verwendet, um parakrine Signalisierung vermittelten Wachstum von Krebszellen in Kultur zu bewerten. CM-Anwendung ist die einfachste Methode für Zelle Studien zu Wechselwirkungen und Beobachtung der löslichen Mediator Tätigkeiten im Kultursystem ermöglicht. CM ist, zwar nicht völlig ausreichend Modellsystem ist CM Anwendung als Kokultur Methode sehr effizient, Zell-Zell-Interaktionen ex Vivozu beobachten. CM DPSCs erhöht die Zell-Proliferation und Migration von Prostata-Krebszellen, unter Angabe des Erwerbs von metastasierendem Phänotyp bedingt von DPSCs abgesondert.
Ein weiteres Modell der Zell-Zell-Interaktion ist die Einrichtung einer physischen Barriere wie eine Trans-Brunnen-Membran zwischen Zelle Bevölkerungen30. Trans-Brunnen-Systeme sind in zwei Typen unterteilt: die Zelle Bewegung durch die Poren zu ermöglichen, und ermöglicht Übertragung von sezernierten Faktoren beim Kontakt der Zelle durch die Membran sowie zu behindern. Wir zum Trans-Brunnen mit 0,4 μm Porengröße die Schließung des PC-3 Kratzer, analysieren der höheren Krebs Zelle Migrationsrate in der DPSC-Gruppe im Vergleich zu der Kontrollzellen enthüllt.
Obwohl CM und Trans-Brunnen-basierte Systeme zur Analyse einfach Beiträge von einer bestimmten Zelle Typ32vorteilhaft sind, ist die direkte Kultivierung von verschiedenen Subpopulationen in der gleichen Umgebung parallel zu indirekten Co Kulturmethoden notwendig. Seeding Verhältnis gesteuert werden und strukturellen Organisation der verschiedenen Populationen kann leicht durch direkte Kokulturen von MSC mit Krebszellen analysiert werden. Wir haben 1:1 Verhältnis von DPSCs und PC-3 Zellen befleckt mit grünen und roten Fluoreszenz Membran Farbstoffe, beziehungsweise. DPSCs PC-3 Zellen umgeben und eine schlauchartige Struktur in Kultur Brunnen erstellt. PC-3 Zellen gebildet Cluster in Form von kleinen Inseln umgeben von kanalartigen Strukturen durch DPSCs erzeugt.
Vor kurzem zeigte Brunetti Et Al. , dass DPSCs TNF-related Apoptose induzierenden Liganden (TRAIL) während osteogene Differenzierung und Affekt Myelom Krebs Zellviabilität, sezernieren unter Angabe der möglichen Interaktionen zahnmedizinische Stammzellen mit Krebs Zellen-33. Unsere Studie ist der erste Bericht, der Wechselwirkungen zwischen dental abgeleiteten MSCs und Prostata-Krebszellen als ex Vivo Modell auswertet. Wir haben drei verschiedene direkte/indirekte Ansätze in unseren Experimenten. Vermehrung von Krebszellen und hohe Migration Preise wurden erkannt, oder CM und Trans-Brunnen-Assays mit Co Kultivierung differentiell gefärbten Zellen, die für mehrere Interaktionen ermöglicht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch Yeditepe Universität. Alle Daten und Zahlen in diesem Artikel verwendeten waren zuvor veröffentlichten34.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. Dental Stem Cells. , Springer. 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -r, et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -S., Lee, H. -Y., Kang, K. -S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Biomimetics and Stem Cells. , Springer. 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
