Summary
Wij bieden protocollen voor evaluatie van mesenchymale stamcellen van tandmerg geïsoleerd en prostaatkanker cel interacties op basis van directe en indirecte co kweekmethoden. Voorwaarde medium en trans-well membranen zijn geschikt voor het analyseren van indirecte paracrine activiteit. Zaaien differentieel is gekleurd cellen samen een passend model voor directe cel-cel interactie.
Abstract
Kanker als meerstaps proces en gecompliceerde ziekte is niet alleen geregeld door individuele celproliferatie en groei maar ook gecontroleerd door tumor milieu en cel interacties. Identificatie van kanker- en stamcellen interacties, met inbegrip van wijzigingen in de extracellulaire omgeving, fysieke interactie en secreted factoren, kan de ontdekking van nieuwe therapie opties inschakelen. Wij combineren de bekende co cultuur technieken om een modelsysteem voor mesenchymale stamcellen (MSCs) en kanker cel interacties maken. In de huidige studie, werden tandmerg stamcellen (DPSCs) en PC-3 prostaatkanker cel interacties onderzocht door directe en indirecte samenwerking cultuur technieken. Voorwaarde medium (CM) verkregen uit DPSCs en 0.4 µm porie formaat trans-well membranen werden gebruikt bij het bestuderen van de paracrine activiteit. Co cultuur van verschillende celtypes werd samen uitgevoerd om te bestuderen van directe cel-cel interactie. De resultaten bleek dat CM verhoogd celproliferatie en daalde van apoptosis in celculturen van prostaatkanker. Zowel CM en trans-well systeem verhoogd cel migratie capaciteit van PC-3 cellen. Cellen met verschillende membraan kleurstoffen gekleurd werden zaadjes in de dezelfde kweekvat, en DPSCs deelgenomen aan een zelf-georganiseerde structuur met PC-3 cellen onder de voorwaarde van deze directe co cultuur. Over het geheel genomen de resultaten aangegeven dat mede cultuur technieken nuttig voor kanker en MSC interacties als een modelsysteem zijn kunnen.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSCs), met de mogelijkheid van differentiatie en bijdrage aan de regeneratie van mesenchymale weefsels zoals botten, kraakbeen, spier, ligament, pees en adipeus, werden geïsoleerd van bijna alle weefsels in het volwassen lichaam1 , 2. dan ter verstrekking van weefsel homeostase door overlegging van de resident cellen in het geval van chronische ontsteking of een letsel, produceren ze vitaal cytokines en groeifactoren te orkestreren angiogenese, immuunsysteem en weefsel remodeling3. De interactie van MSCs met kanker weefsel is niet goed begrepen, maar accumuleren bewijs suggereert dat MSCs tumor initiatie, progressie en metastase4kunnen bevorderen.
Het homing vermogen van MSCs naar de gewonde of chronisch ontstoken gebied maakt hen een waardevolle kandidaat voor stamcel gebaseerde therapieën. Kanker weefsels, "nooit helende wonden", laat echter ook ontsteking cytokinen, pro-angiogenic moleculen en vitale groeifactoren, die MSCs naar de cancerogenous gebied5 aantrekken. Hoewel er beperkte rapporten waarop remmende effecten van MSCs kanker groei6,7, hun progressie van kanker en metastase bevorderende effecten uitgebreid zijn gemeld8. MSCs direct of indirect van invloed zijn op carcinogenese op verschillende manieren met inbegrip van onderdrukken van immune cellen, afscheidende groeifactoren/cytokines die ondersteuning bieden voor kanker celproliferatie en migratie, verbetering van de angiogenic activiteit en regulering epitheliale-mesenchymale overgang (EMT)9,10. Omgeving van de tumor bestaat uit verschillende celtypen, met inbegrip van kanker-geassocieerde fibroblasten (IGFA) en/of myofibroblasts, endotheliale cellen, adipocytes en immuuncellen11. Voor degenen zijn IGFA het meest voorkomende celtype in het gebied van de tumor die verschillende chemokines bevordering van groei en uitzaaiing van de kanker8afscheiden. Het is aangetoond dat het beenmerg-afgeleide MSCs in IGFA in het stroma tumor12 onderscheiden kunnen.
Tandmerg stamcellen (DPSCs), als de eerste tandheelkundige weefsel afkomstige MSCs gekenmerkt door Gronthos et al. 13 in 2000 en vervolgens grote schaal onderzocht door anderen14,15, express pluripotent markeringen zoals Oct4, Sox2en Nanog16 en kan onderscheid worden gemaakt in verschillende cel linages17. Gen- en eiwit expressie analyse bleek dat DPSCs produceren vergelijkbaar niveau van groeifactoren/cytokinen met andere MSCs zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), de angiogenin, de fibroblast groeifactor 2 (FGF2), interleukine-4 (IL-4), IL-6, IL-10, stamcel factor (SCF), alsmede fms-achtige tyrosine kinase-3 ligand (Flt - 3L) die mogelijk bevorderen van angiogenese, immune cellen moduleren en ondersteunen van kanker cel proliferatie en migratie18,19,20 . Hoewel de interacties van MSCs met kanker milieu goed gedocumenteerd in de literatuur geweest, is de relatie tussen DPSCs en kankercellen niet geëvalueerd nog. In de huidige studie, wij opgericht co cultuur en voorwaarde middellange behandelingsstrategieën voor een zeer uitgezaaide prostaatkanker cellijn, PC-3 en DPSCs voor te stellen van potentiële actie van mechanisme van tandheelkundige MSCs in kanker progressie en metastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Schriftelijke toestemming van de patiënten werd verkregen na de goedkeuring van de institutionele ethiek Commissie.
1. DPSC isolatie en cultuur
- Overdracht van verstandskiezen verkregen jongvolwassenen tussen 17 en 20 tot en met 15 mL tubes met de volledige Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) [lage glucose DMEM media, aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine / Amfotericine (PSA) oplossing], binnen 8 uur na resectie. Houd het weefsel materiaal koud (4 ° C) tijdens de overdracht naar het voorkomen van potentiële celdood.
- Verwijderen van de pulp weefsel door steriele extractie pincet vanuit het midden van de tand zorgvuldig, plaatst u het pulp weefsel in het koude volledige DMEM medium in 10 cm weefselkweek gerechten, en gehakt ze in kleine stukjes (2-3 mm) door scalpel.
Opmerking: Alle experimentele procedures moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden laminaire flow Hood. Deze niet-enzymatische techniek al eerder gebruikte21,22,23. - Plaats kleine pulp weefsels binnen de Weefselkweek behandeld 6-Wells-platen en voeg 200 µL van volledige DMEM media ter dekking van elke kleine pulp weefsel stukken.
- Incubeer de weefselkweek putten bij 37 ° C in een atmosfeer van bevochtigde lucht (80% vocht) met 5% CO2 gedurende 2 uur om weefsel bijlage.
Opmerking: Deze stap kan worden verlengd tot en met 3-4 h door het beheersen van de verdamping van de media. - Voeg passende omvang (2-2,5 mL) van volledige DMEM medium de putjes en Incubeer bij 37 ° C in een atmosfeer van bevochtigde lucht met 5% CO2 voor cellen te verspreiden van het weefsel.
Opmerking: De cellen worden zichtbaar na ongeveer 4 dagen en confluentie bereiken na 8-9 dagen. - Wanneer cellen 80% confluentie bereiken, media verwijderen uit 6-Wells-platen, wassen met 2 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg toe 2 mL trypsine. Incubeer gedurende 2 min in een incubator bij 37 ° C met bevochtigde lucht sfeer en 5% CO2. Klik Voeg toe 2 mL van volledige DMEM medium gevolgd door 2 min incubatie voor de remming van de trypsine. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 min naar pellet cellen.
- De cellen van de passage naar de kolven in volledige DMEM media en winkel voor verdere experimenten. Voeg toe 15 mL volledige DMEM media aan de T-75 kolven en overdracht cellen van twee putjes van de plaat van de 6-well aan één T-75 kolven en Incubeer bij 37 ° C met bevochtigde lucht sfeer en 5% CO2.
2. karakterisering van DPSCs
- Morfologische analyses uitvoeren.
- Zaad-cellen (stap 1.6) in weefselkweek bekleed kolven (of 6-Wells-platen) in volledige DMEM medium voor ten minste 8 doorgangen naar het observeren van de morfologie van de cel.
- Visualiseer cellen door lichte Microscoop en morfologie van de fibroblast-achtige cel definiëren. Cellen moeten hechten aan de cultuur-gerechten en morfologie van de spindel-achtige cel.
Opmerking: U kunt ook cellen kunnen worden gekweekt als afzonderlijke cellen voor maximaal 14 dagen in goed-platen te observeren van de kolonie vorming capaciteit die is een specifiek kenmerk van fibroblasten en MSCs.
- Oppervlakte marker-analyses uitvoeren.
- Trypsinize van de cellen vanaf stap 1.7. Media verwijderen uit de T-75 weefselkweek kolf, wassen met PBS 2 mL en voeg toe 2 mL trypsine. Incubeer gedurende 2 min in een incubator bij 37 ° C met bevochtigde lucht sfeer en 5% CO2. Klik Voeg toe 2 mL van volledige DMEM medium gevolgd door 2 min incubatie voor de remming van de trypsine. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 min naar pellet cellen.
- Herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in 1,5 mL buizen en daarna wassen hen met 500 µL van PBS 3 keer paraformaldehyde verwijderen.
- Incubeer vaste cellen met de antilichamen tegen CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 en CD73 gedurende 1 uur bij 4 ° C in 100 µL van PBS.
Opmerking: De concentratie van antilichaam gebruikt is 0,5 µg/mL. CD34, CD14 en CD45 worden gebruikt als negatieve markeringen, terwijl CD29, CD90, CD105, CD166 en CD73 worden gebruikt als positieve cel oppervlakte markeringen voor MSCs. - Wassen van cellen 3 keer met PBS en gebruik van de respectieve secundaire antilichamen zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), phycoerythrin (PE), etc. voor etikettering. Incubeer de cellen met de secundaire antilichamen 1:500 verdund in 100 µL van PBS gedurende 30 minuten bij 4 ° C en wassen 3 keer met PBS.
- Monsters in het donker voor stroom cytometry analyse houden en detecteren van positieve en negatieve kleuring door stroom cytometry.
Opmerking: Gebruik onbevlekt cellen te regelen van de voorwaartse en zijdelingse scatter. Regelen populaties gating van positief gekleurd door met uitzondering van dode cellen, puin en un-gekleurde bevolking. Gebruik van 100 µm-mondstuk met 45 psi schede druk en 10.000 gebeurtenissen om positieve DPSCs vast door het organiseren van kanalen te verzamelen.
- Differentiatie van DPSCs uit te voeren.
- Zaad 1 × 104 cellen op 24-Wells-platen in DMEM media voltooien en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C in een atmosfeer van bevochtigde lucht met 5% CO2.
- Formuleren van differentiatie media met behulp van concurreren DMEM medium als base media. Bereid osteogenic media door het mengen van 100 nM dexamethason, 10 mM β-glycerophosphate en 0,2 mM ascorbinezuur. Bereid chondrogenic media door het mengen van 1 × insuline-transferrine-selenium (ITS-G), 100 nM dexamethason 100 ng/mL transformerende groeifactor bèta (TGF-β), 14 μg/mL ascorbinezuur en 1 mg/mL bovien serumalbumine (BSA). Bereid adipogenic media door het mengen van 100 nM dexamethason, 5 μg/mL insuline, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) en 60 μM indomethacin.
Opmerking: Differentiatie media kan bij 4 ° C gedurende ten minste één week worden bewaard. - Wijzigen groei media osteo-, chondro-of adipo-genenreservoir differentiatie media en vernieuwen tweemaal per week gedurende twee weken.
- Bevestigen van differentiatie door von Kossa en Alcian blauw kleuring, enzymactiviteit (alkalische fosfatase activiteit), immunocytochemie en kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) analyses volgens de protocollen beschreven21.
- Uitvoeren van von Kossa en Alcian blauwe technieken op cellen die worden opgelost met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten wassen de vaste cellen met PBS en vlekken hen met de vonKossa kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant te observeren van kalkaanslag .
- De Alcian blauwe kleurstofoplossing door het oplossen van 1.00 g Alcian blauwe kleurstof in 100 mL azijnzuur 3% (v/v) voor verdere kleuring voor te bereiden. Wassen van de vaste cellen met PBS en vlek cellen voor 30 min met Alcian blauwe oplossing. Visualiseer de gebeitst monsters door een lichte Microscoop.
3. bereiding van voorwaarde Medium (CM)
- Media van cellen uit stap 1.7 vervangen door verse volledige DMEM 24 h vóór CM collectie.
Opmerking: Passage 2-4 is aanbevolen. - Verzamelen voorwaarde medium (CM) van gekweekte DPSCs wanneer cellen 80% confluentie bereiken. Centrifugeer verzamelde media bij 300 x g gedurende 5 min te verwijderen afval weefsel materiaal en cel puin.
Opmerking: Gebruik als alternatief, 0,2 µm spuit filters om puin verwijderen uit het medium van de voorwaarde. - Supernatant verzamelen en opslaan bij-20 ° C voor verdere experimenten.
Opmerking: Houd het supernatant bij-80 ° C voor langdurige opslag.
4. behandeling van kanker cellen met CM
- Cel levensvatbaarheid analyses uitvoeren.
- Zaad PC-3 cellen (menselijke prostaat kankercellen) op 96-wells-platen op een celdichtheid van 5 × 103 cellen per putje in DMEM voltooien en broeden in een bevochtigde ruimte bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Cellen met 10, 20, 30, 40 en 50% van de CM (v/v) gemengd met volledige DMEM gedurende 24 uur behandelen.
- Meten van de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (MTS)-assay zoals eerder beschreven24.
- Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick einde labeling (TUNEL) analyses uitvoeren
- Zaad PC-3 cellen op 6-well celkweek platen op een celdichtheid van 2 × 105 cellen/goed en na een nacht bebroeden in een bevochtigde ruimte bij 37 ° C en 5% CO2 .
- Meng 20% CM (v/v) met volledige DMEM medium en toepassen op de cellen gedurende 24 uur.
- Trypsinize cellen en schorten in 50 μl van TUNEL reactiemengsel (labeling oplossing + enzym solution, voorzien van de kit) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten in een bevochtigde en 5% CO2 -sfeer.
Opmerking: Voor trypsinebehandeling, Verwijder media van 6-well cel cultuur platen, wassen met 1 mL PBS en voeg 500 µL van trypsine. Incubeer gedurende 2 min in een incubator bij 37 ° C met bevochtigde lucht sfeer en 5% CO2. Voeg vervolgens 1 mL van volledige DMEM medium gevolgd door 2 min incubatie voor de remming van de trypsine. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 min naar pellet cellen. - Spoelen met PBS en analyseren van cellen in PBS met behulp van stroom cytometry.
- QPCR-analyses uitvoeren.
- Zaad PC-3 cellen op 6-well celkweek platen op een celdichtheid van 2 × 105 cellen/goed en na een nacht bebroeden in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 .
- Meng 20% CM (v/v) met volledige DMEM medium en toepassen op de cellen gedurende 24 uur.
- Trypsinize cellen en cel pellet voor isolatie en cDNA synthese van RNA te verzamelen.
Opmerking: Verwijder medium van 6-well cel cultuur platen, wassen met 1 mL PBS en voeg 500 µL van trypsine. Incubeer 2 min in een incubator bij 37 ° C met bevochtigde lucht sfeer en 5% CO2. Voeg vervolgens 1 mL van volledige DMEM medium gevolgd door 2 min incubatie voor de remming van de trypsine. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 min naar pellet cellen. - QPCR volgens de eerder beschreven protocol25experimenten uitvoeren
- Cel migratie van kankercellen uit te voeren.
- Zaad 1 × 105 PC-3 cellen op 12-Wells-platen en broeden in een bevochtigde incubator's nachts bij 37 ° C en 5% CO2.
- Kladcellen met een steriele 200 μl tip en wijzigen van middellange onmiddellijk met het verse medium met verschillende concentraties van CM [bijvoorbeeld10, 20, 30, 40 en 50% van de CM (v/v) gemengd met volledige DMEM].
- Observeren van krassen onder een omgekeerde Microscoop en foto's nemen op verschillende tijdsintervallen (0 en 24 h).
- Het meten van de kras sluiting met behulp van Image J software met behulp van de formule:
Opmerking: Open de kras afbeelding met Image J software. Teken een lijn die heeft dezelfde grootte als de balk van de schaal die al in de afbeelding bestaat. Klik op analyseren, stel schaal en observeren van de afstand in pixels als de vergroting van de getekende lijn. Schrijven van de grootte van de bar van de schaal naar het bekende afstand deel regelen eenheid (cm, pixels, enz.) en klik op ok. Ga naar de sectie analyseren opnieuw en klik op metingen. Dit zal eerst de grootte van de schaal-bar als de geselecteerde eenheid geven. Klik op een van de randen van kras en sleep tot het bereiken van het andere uiteinde van de kras. Noteer de waarde voor elk punt van de tijd (0 uur en 24 uur). Steek deze waarden in bovenstaande formule en bereken de kras sluiting.
5. cel migratie door Indirect Contact van kankercellen en DPSCs
- Zaad 3 × 104 DPSCs op 24-well plaat inzetstukken met 0.4 μm porie en broeden in een bevochtigde incubator's nachts bij 37 ° C.
- Zaad PC-3 cellen op 24-well op een celdichtheid van 5 × 10-4 platen en broeden in een bevochtigde incubator's nachts bij 37 ° C en 5% CO2.
- Kladcellen PC-3 met een steriele 200 μl tip, medium met verse medium wijzigen en inzetstukken uitvoering DPSCs naar PC-3 cellen te plaatsen.
- Observeren van cellen onder een omgekeerde Microscoop en foto's nemen op verschillende tijdsintervallen (0 en 24 h) voor het analyseren van cel migratie.
6. samen cultuur Assay en Stroom Cytometry analyse
- Label PC-3 cellen en DPSCs met behulp van PKH67 (groen) en PKH26 (rood) TL cel linker kleurstoffen, respectievelijk26.
- Trypsinize PC-3 en DPSCs cellen, respectievelijk. Media verwijderen uit T-75 weefselkweek kolf, wassen met PBS 2 mL en voeg toe 2 mL trypsine. Incubeer gedurende 2 min in een incubator bij 37 ° C met bevochtigde lucht sfeer en 5% CO2. Voeg toe 2 mL van volledige DMEM medium gevolgd door 2 min incubatie voor de remming van de trypsine.
- Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 min, verwijder supernatant en resuspendeer cel pellets in de oplossing van de kleurstof bereid in verdunningsmiddel-C buffer geleverd door de kit (Zie Tabel van materialen).
- Incubeer de cellen in de oplossing van de kleurstof voor 10 min en beëindigen van de kleuring reactie door 100 µL van FBS toe te voegen. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en wassen van de cellen met volledige groeimedium voor co kweken.
- Plaat met het label cellen (5 × 10-4/goed) naar 6-Wells-platen op 1:1 verhouding (DPSCs: PC3). Handhaven mede gekweekte cellen in volledige DMEM.
- Verzamelen cellen na 24 uur of 48 uur incubatie periodes door centrifugeren van cellen bij 300 x g gedurende 5 min en wassen met PBS.
- Resuspendeer de cellen in 300 µL van fluorescentie-activated cell sorting (FACS) buffer in 5 mL ronde onder stroom cytometry buizen. Vortex te verspreiden van cel aggregaten vlak voor de analyse van het monster.
- Gebruik een spuitmond 100 µm met 45 psi schede druk.
Opmerking: Zeer hoog stroomtarief kan verlagen de gevoeligheid van de fluorescentie detectie. - Gebruik onbevlekt controle cellen en afzonderlijke gekleurde cellen om te passen passende vooruit en scatter laser gelijkspanning voor celtypes en compensatie zoals eerder vermeld27.
Opmerking: Gebruik gating voor levende cellen uitsluiten cel puin, dode cellen, of aggregaten. - 10.000 gebeurtenissen (100.000 is beter) verzamelen om te bepalen percentage positieve groene DPSCs en rode PC-3 cellen door het organiseren van FL-1 (groen) en FL-2 (rood) kanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de algemene kenmerken van het MSC van DPSCs onder de kweekomstandigheden. DPSCs oefenen fibroblast-achtige cel morfologie na plating (figuur 1B). MSC oppervlakte antigenen (CD29, CD73, CD90, CD105 en CD166) zijn zeer uitgesproken terwijl hematopoietische markeringen (CD34, CD45 en CD14) zijn negatieve (Figuur 1 c). Wijzigingen op de morfologische en moleculair niveau aan osteo-, gerelateerde chondro- en adipo-genenreservoir differentiatie worden waargenomen in de DPSCs cultuur gevolgd door differentiatie cocktail aanvraag (Figuur 1 d).
Om te bepalen van de activiteit van secreted moleculen van DPSCs over prostaatkanker celproliferatie en -migratie, pasten we CM die wordt verzameld uit gekweekte tandheelkundige stamcellen en kanker celproliferatie en trekgedrag geanalyseerd. CM behandeling (20% v/v) werd geselecteerd op basis van MTS cel levensvatbaarheid analyses. PC-3 cellen stamcellen CM behandeld werden onderworpen aan de TUNEL assay en qPCR analyses om te bepalen van de verordening van cel dood en de apoptotic onder controle en experimentele omstandigheden. Wij geconcludeerd dat CM behandeling steeg van de levensvatbaarheid van de cellen en celdood in de cultuur van de cel van de PC-3 verminderde. Ex vivo cel migratie assay (kras assay) werd uitgevoerd om te beoordelen of CM van DPSCs is van invloed op PC-3 kanker cel migratie. Behandeling met de concentraties van 10% en 20% CM (v/v) verhoogd kras sluiting aanzienlijk in vergelijking met de controlegroep op 24 h (Figuur 2). Ook geïnduceerde 20% CM (v/v) behandeling opregulatie van extracellulaire matrix eiwitten gene uitdrukkingen zoals collageen I, fibronectin en laminin, die spelen een belangrijke rol in de cel migratie.
Wij twee verschillende cultuur technieken gebruikt om directe en indirecte co culturen van PC-3 cellen en DPSCs ex vivo omstandigheden. Trans-well systeem werd geselecteerd voor het maken van een indirecte interactie omgeving voor PC-3 kankercellen. PC-3 cellen werden geplaatst op de bodem van de goed plaat en inzetstukken die DPSCs werden geplaatst op de top. Omdat we gericht voor het genereren van een in-directe interactie, werden trans-well membranen met 0.4 μm poriegrootte gebruikt om te voorkomen dat de beweging van de fysieke cel van DPSCs van het bovenste deel naar onderste deel via het membraan. Secreted moleculen van DPSCs verhoogd kras sluiting van PC-3 cellen aanzienlijk in vergelijking met cellen. PC-3 cellen samen gekweekt met DPSCs aangetoond een kras sluiting van 51%, terwijl de controle cellen had een 38%-sluiting na 24u (figuur 3A). Directe culturen samen met 1:1 verhouding van DPSCs en PC-3 cellen werden gebruikt voor het analyseren van zelforganisatie van stamcellen en kankercellen. Cellen werden gekleurd met rode en groene membraan kleurstoffen te onderscheiden van de verschillende soorten cellen onder de Microscoop. PC-3 cellen gekleurd met rode fluorescentie kleurstof werden omringd door DPSCs in een buis-achtige structuur na een incubatieperiode van 24 h. Co gekweekte cellen gekleurd met fluorescente kleurstoffen werden geanalyseerd door stroom cytometry op basis van de fluorescentie kleuring en cel verhoudingen werden ontdekt. DPSCs en PC-3 cellen gemaakt een overzichtelijke structuur waarin PC-3 cellen zich verspreid snel na 48u (figuur 3B). Hoewel cellen werden zaadjes op een gelijke verhouding (1:1) voor directe co cultuur, waren 62.22% van de PC-3 cellen vastbesloten na 48 uur incubatie, die het hogere tarief van de proliferatie van PC-3 cellen aangeeft.
Figuur 1: karakterisering van tandmerg stamcellen (DPSCs). (A) Pulp weefsel verkregen vanuit het midden van de tand. (B) Fibroblast-achtige cel morfologie schaalvoordelen DPSCs. bar: 100 μm. (C) stroom cytometry analyses van DPSCs. CD29, CD73, CD90, CD105 en CD 166 zijn positieve oppervlakte markeringen, terwijl CD14, CD34, en CD45 zijn negatieve oppervlakte markeringen. NC: negatieve controle (groeimedium behandeld cellen). (D) differentiatie van DPSCs naar mesenchymale celtypes werd bevestigd met von Kossa kleuring, Alcian blauw kleuring, en lipide druppels (schaal bar: 200 μm). Osteocalcin, collageen type II (Col II), en vetzuur bindend-proteïne 4 (FABP4) immunostainings toonde de differentiatie van het osteo - chondro- en adipogenic van DPSCs. schaal bar: 200 μm. Dit percentage is aangepast van Dogan et al. 34. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: verzameling van voorwaarde medium (CM) uit DPSCs voor cel levensvatbaarheid en kras analyses. TUNEL positieve cellen werden verlaagd door 20% CM (v/v) toepassing. Kwantitatieve meting van kras sluiting toonde aan dat CM verhoogd PC-3 cel migratie. CM: geconditioneerde medium; NC: negatieve controle (groeimedium behandeld cellen). * P < 0.05. Dit percentage is aangepast van Dogan et al. 34. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: methodologie voor trans-well cel migratie assay en co cultuur. (A) PC-3 cel kras sluiting in de trans-well co cultuur-systeem. (B) interactie patroon van gekleurd DPSCs (groene fluorescentie) en PC-3 cellen (rode fluorescentie) na 24 uur en 48 uur van co cultuur (seeding verhouding 1:1). Hogere PC-3 cel nummer werd ontdekt met betrekking tot DPSCs. schaal bar: 200 μm. Dit percentage is aangepast van Dogan et al. 34. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bijdrage van MSCs tumor milieu wordt geregeld door verschillende interacties met inbegrip van hybride cel generatie via cel fusies, entosis of cytokine en chemokinereceptoren activiteiten tussen stamcellen en kanker cellen28. Structurele organisatie, cel-cel interacties en secreted factoren bepalen kanker cel gedrag op het gebied van de bevordering van de tumor, progressie en metastase aan het omliggende weefsel. Goede ex vivo modelsystemen te onderzoeken van de mechanismen achter de interacties van resident cel populaties moeten begrijpen van mobiele communicatie voor kanker progressie en metastase.
We DPSCs gebruikt voor het maken van een modelsysteem voor prostaatkanker en de cel van de stam van de tandheelkundige interacties. Het voordeel van dit soort volwassen stamcel is de toegankelijkheid van weefsel bron en gemakkelijk isolatie stappen. Aan de andere kant, is met behulp van alleen de DPSCs zonder vergelijking met bekende volwassen stamcel typen een beperking van dit protocol. Huidige co kweekmethoden zijn gecategoriseerd in directe en indirecte technieken waaronder paracrine signalering van oplosbare secreted moleculen en directe cultuur van verschillende cel populaties in de zelfde omgeving29,30, 31. CM van volledig gekenmerkt DPSCs werd gebruikt voor het evalueren van paracrine signalering gemedieerde kanker celgroei in cultuur. CM toepassing is de eenvoudigste methode voor cel interactie studies en zorgt voor waarneming van oplosbare bemiddelaar activiteiten in het systeem van de cultuur. Hoewel CM niet een modelsysteem volledig adequaat is, is CM toepassing als een co cultuur-methode zeer efficiënt om te observeren cel interacties ex vivo. CM van DPSCs stegen de celproliferatie en -migratie van de cellen van de prostaat kanker, die aangeeft van de verwerving van metastatische fenotype als gevolg van de factoren die uitgescheiden door DPSCs.
Een ander model van cel-cel interactie is de oprichting van een fysieke barrière zoals een trans-well membraan tussen cel bevolking30. Trans-well systemen zijn onderverdeeld in twee soorten: die cel verkeer via de poriën, en die overdracht van secreted factoren inschakelen terwijl cel contact via het membraan ook belemmeren. Wij gewend trans-putten met 0.4 μm poriegrootte analyseren de sluiting van PC-3 krassen, hogere kanker cel migratie percentage in de DPSC groep in vergelijking met de controle cellen te onthullen.
Hoewel CM en trans-well gebaseerde systemen voordelig zijn voor het eenvoudigweg analyseren van de bijdragen van een bepaalde cel type32, is het nodig parallel met indirecte co kweekmethoden om directe kweken van verschillende subpopulaties in dezelfde omgeving. Seeding verhouding kan worden gecontroleerd en structurele organisatie van verschillende populaties kan gemakkelijk door directe samenwerking cultuur van MSC met kankercellen worden geanalyseerd. We gebruikten 1:1 verhouding van DPSCs en PC-3 cellen gekleurd met groene en rode fluorescentie membraan kleurstoffen, respectievelijk. DPSCs PC-3 cellen omcirkeld en gemaakt van een buis-achtige structuur in cultuur wells. PC-3 cellen gevormd clusters in de vorm van eilandjes omgeven door kanaal-achtige structuren gegenereerd door DPSCs.
Onlangs, Brunetti et al. toonde dat DPSCs TNF-gerelateerde apoptose-inducerende ligand (TRAIL) tijdens osteogenic differentiatie en invloed myeloma kanker levensvatbaarheid van de cellen afscheiden, met vermelding van de mogelijke interacties van tandheelkundige stamcellen met kanker cellen33. Onze studie is het eerste verslag dat interacties van tandheelkundige afgeleide MSCs- en prostaatkanker cellen als een ex vivo model evalueert. We hebben drie verschillende directe/indirecte benaderingen gebruikt in onze experimenten. Verspreiding van de kankercellen en hoge migratie tarieven werden ontdekt door CM en trans-well vitrotests of door mede culturing differentieel gekleurd cellen die het mogelijk maakt voor meerdere interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door Yeditepe Universiteit. Alle gegevens en cijfers gebruikt in dit artikel werden eerder gepubliceerde34.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. Dental Stem Cells. , Springer. 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -r, et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -S., Lee, H. -Y., Kang, K. -S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Biomimetics and Stem Cells. , Springer. 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
