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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Mesenchymal लुगदी ऊतक और सह कैंसर कोशिकाओं के साथ संस्कृति से कोशिका अलगाव स्टेम उनके बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58825
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Genetics and Bioengineering, Yeditepe University, 2National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), Sickle Cell Branch, National Institutes of Health (NIH)

Summary

हम प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष सह संस्कृति के तरीकों पर आधारित दंत लुगदी और प्रोस्टेट कैंसर सेल बातचीत से पृथक mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । स्थिति मध्यम और ट्रांस-वेल झिल्ली अप्रत्यक्ष paracrine गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त हैं । विभेदक रूप से सना हुआ कोशिकाओं बोने के साथ सीधे सेल सेल संपर्क के लिए एक उपयुक्त मॉडल है ।

Abstract

एक multistep प्रक्रिया और जटिल रोग के रूप में कैंसर केवल व्यक्तिगत सेल प्रसार और विकास द्वारा विनियमित नहीं है, लेकिन यह भी ट्यूमर पर्यावरण और सेल सेल बातचीत द्वारा नियंत्रित । कैंसर और स्टेम सेल बातचीत, extracellular वातावरण में परिवर्तन, शारीरिक बातचीत, और स्रावित कारकों सहित की पहचान, नई चिकित्सा विकल्पों की खोज को सक्षम हो सकता है । हम mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) और कैंसर सेल बातचीत के लिए एक मॉडल प्रणाली बनाने के लिए जाना जाता सह संस्कृति तकनीक गठबंधन । वर्तमान अध्ययन में, दंत लुगदी स्टेम सेल (DPSCs) और पीसी-3 प्रोस्टेट कैंसर सेल बातचीत प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष सह संस्कृति तकनीक द्वारा जांच की गई । हालत मध्यम (सेमी) DPSCs से प्राप्त और ०.४ µm ताकना आकार ट्रांस अच्छी तरह से झिल्ली paracrine गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । विभिन्न प्रकार के सेल के सह-कल्चर को एक साथ सीधे सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया गया. परिणाम से पता चला कि मुख्यमंत्री सेल प्रसार में वृद्धि हुई है और प्रोस्टेट कैंसर सेल संस्कृतियों में apoptosis की कमी हुई । दोनों CM और ट्रांस-वेल सिस्टम ने पीसी-3 कोशिकाओं की सेल माइग्रेशन क्षमता बढ़ा दी । विभिन्न झिल्ली रंगों से सना हुआ कक्ष एक ही संस्कृति वाहिकाओं में वरीयता प्राप्त थे, और DPSCs इस प्रत्यक्ष सह संस्कृति हालत के तहत पीसी-3 कोशिकाओं के साथ एक आत्म संगठित संरचना में भाग लिया । कुल मिलाकर, परिणामों का संकेत दिया है कि सह संस्कृति तकनीक एक मॉडल प्रणाली के रूप में कैंसर और एमएससी बातचीत के लिए उपयोगी हो सकता है ।

Introduction

Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (MSCs), भेदभाव और Mesenchymal ऊतकों के उत्थान के लिए योगदान की क्षमता के साथ इस तरह की हड्डी के रूप में, उपास्थि, मांसपेशी, बंध, पट्टा, और वसा, लगभग सभी ऊतकों से अलग किया गया है वयस्क शरीर1 , 2. पुरानी सूजन या एक चोट के मामले में निवासी कोशिकाओं के उत्पादन से ऊतक homeostasis प्रदान करने के अलावा, वे महत्वपूर्ण साइटोकिंस और विकास कारकों angiogenesis, प्रतिरक्षा प्रणाली आर्केस्ट्रा का उत्पादन, और3remodeling ऊतक । कैंसर के ऊतकों के साथ MSCs की बातचीत अच्छी तरह से समझ में नहीं है, लेकिन सबूत जमते कि MSCs ट्यूमर दीक्षा, प्रगति, और मेटास्टेसिस4को बढ़ावा देने सकता है पता चलता है ।

घायल या जीर्ण सूजन क्षेत्र के लिए MSCs की होमिंग क्षमता उंहें स्टेम सेल आधारित चिकित्सा के लिए एक मूल्यवान उंमीदवार बनाता है । हालांकि, कैंसर के ऊतकों, "घाव भरने कभी नहीं", भड़काऊ साइटोकिंस जारी, समर्थक angiogenic अणुओं, और महत्वपूर्ण विकास कारकों, जो cancerogenous क्षेत्र के लिए MSCs को आकर्षित5. जबकि वहां सीमित कैंसर6,7पर MSCs के निरोधात्मक प्रभाव दिखा रिपोर्ट कर रहे हैं, उनके कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस प्रभाव को बढ़ावा देने के बड़े पैमाने पर8की सूचना दी गई है । MSCs प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दबाने सहित विभिन्न तरीकों में कैंसरजनन को प्रभावित, स्रावित विकास कारकों/साइटोकिंस कि कैंसर कोशिका प्रसार और प्रवास का समर्थन, angiogenic गतिविधि बढ़ाने, और विनियमन उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT)9,10. ट्यूमर पर्यावरण कैंसर से जुड़े fibroblasts (CAFs) और/या myofibroblasts, endothelial कोशिकाओं, adipocytes, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं11सहित कई कोशिका प्रकार के होते हैं । उन में से, CAFs ट्यूमर क्षेत्र में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिका प्रकार है कि विभिंन chemokines कैंसर विकास और8मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने के स्रावित कर रहे हैं । यह दिखाया गया है कि अस्थि मज्जा-व्युत्पंन MSCs12स्ट्रोमा ट्यूमर में CAFs में अंतर कर सकते हैं ।

चिकित्सकीय लुगदी स्टेम सेल (DPSCs), पहले दंत ऊतक के रूप में विशेषता-Gronthos एट अल द्वारा MSCs व्युत्पंन । 13 में २००० और फिर व्यापक रूप से दूसरों की जांच14,15, एक्सप्रेस pluripotency मार्करों जैसे Oct4, Sox2, और Nanog16 और विभिंन सेल linages17में अंतर कर सकते हैं । जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण साबित कर दिया कि DPSCs विकास कारकों के तुलनीय स्तर का उत्पादन/संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़), angiogenin, fibroblast वृद्धि कारक 2 (FGF2), interleukin-4 (il-4), आईएल-6, आईएल-10, के रूप में अन्य MSCs के साथ साइटोकिंस और स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ), साथ ही एफएमएस की तरह tyrosine कळेनासे-3 ligand (Flt-3L) है कि angiogenesis को बढ़ावा देने, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मिलाना सकता है, और समर्थन कैंसर सेल प्रसार और प्रवास18,19,20 . जबकि कैंसर पर्यावरण के साथ MSCs की बातचीत अच्छी तरह से साहित्य में प्रलेखित किया गया है, DPSCs और कैंसर कोशिकाओं के बीच संबंध अभी तक मूल्यांकन नहीं किया गया है । वर्तमान अध्ययन में, हम एक अत्यधिक मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइन, पीसी के लिए सह-संस्कृति और हालत मध्यम उपचार रणनीतियों की स्थापना की, और DPSCs को कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस में दंत MSCs के तंत्र की क्षमता कार्रवाई का प्रस्ताव है ।

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Protocol

रोगियों की लिखित सूचित सहमति संस्थागत नैतिकता समिति से अनुमोदन के बाद प्राप्त की गई ।

1. DPSC अलगाव और संस्कृति

  1. स्थानांतरण ज्ञान युवा 17 और 20 के बीच आयु वर्ग के लिए 15 मिलीलीटर पूर्ण Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) युक्त ट्यूबों [कम ग्लूकोज DMEM मीडिया, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक और 1% पेनिसिलिन/streptomycin/ amphotericin (पीएसए) समाधान], के भीतर 8 ज लकीर के बाद । संभावित कोशिका मृत्यु से बचने के लिए स्थानांतरण के दौरान ऊतक सामग्री ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) रखें ।
  2. दांत के केंद्र से बाँझ निष्कर्षण संदंश द्वारा लुगदी ऊतक निकालें ध्यान से, लुगदी ऊतक 10 सेमी ऊतक संस्कृति के बर्तन में ठंडा पूरा DMEM माध्यम में जगह है, और उंहें छोटे टुकड़ों में कीमा (2-3 mm) स्केलपेल द्वारा ।
    नोट: सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं बाहर लामिना फ्लो हूड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए. इस नॉन-एंजाइमी तकनीक का इस्तेमाल पहले21,22,23को किया गया है ।
  3. ऊतक संस्कृति के अंदर छोटे लुगदी ऊतकों प्लेस 6-अच्छी तरह से प्लेटें और प्रत्येक छोटे लुगदी ऊतक टुकड़े को कवर करने के लिए पूरा DMEM मीडिया के २०० µ एल जोड़ने का इलाज किया ।
  4. ऊतक लगाव प्रदान करने के लिए 2 एच के लिए 5% CO2 के साथ एक humidified हवा वातावरण (८०% आर्द्रता) में ३७ ° c में ऊतक संस्कृति कुओं की मशीन ।
    नोट: यह कदम मीडिया के वाष्पीकरण को नियंत्रित करके 3-4 h तक लंबे समय तक हो सकता है ।
  5. कुओं के लिए पूरा DMEM माध्यम की उचित मात्रा (2-2.5 एमएल) जोड़ें और 5% CO2 के साथ एक humidified हवा वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी कोशिकाओं के लिए ऊतक से फैल ।
    नोट: कक्ष लगभग 4 दिनों के बाद दृश्यमान हो जाते हैं और 8-9 दिनों के बाद प्रवाह तक पहुँच जाते हैं.
  6. जब कोशिकाओं ८०% प्रवाह तक पहुंचने, 6-अच्छी तरह से प्लेटों से मीडिया को दूर, फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 2 मिलीलीटर के साथ धो, और trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें । humidified हवा वातावरण और 5% CO2के साथ ३७ ° c में एक मशीन में 2 मिनट के लिए मशीन । फिर trypsin को बाधित करने के लिए 2 मिनट की मशीन द्वारा पीछा पूरा DMEM मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें । ३०० एक्स जी पर कोशिकाओं को गोली कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  7. आगे के प्रयोगों के लिए पूरा DMEM मीडिया और स्टोर में कुप्पी के लिए पारित कोशिकाओं । टी के लिए पूरा DMEM मीडिया के 15 मिलीलीटर जोड़ें-७५ कुप्पी और 6 के दो कुओं से स्थानांतरण कोशिकाओं-अच्छी तरह से एक टी के लिए प्लेट-७५ कुप्पी और humidified हवा वातावरण और 5% सह2के साथ ३७ ° c पर मशीन ।

2. DPSCs का लक्षण वर्णन

  1. प्रदर्शन रूपात्मक िरा.
    1. बीज कोशिकाओं (चरण १.६) में ऊतक संस्कृति लेपित कुप्पी (या 6-अच्छी तरह से प्लेटें) में पूरी DMEM मध्यम से कम 8 मार्ग के लिए कक्ष आकृति विज्ञान का पालन करने के लिए.
    2. प्रकाश माइक्रोस्कोप द्वारा कोशिकाओं कल्पना और fibroblast की तरह सेल आकृति विज्ञान को परिभाषित । कोशिकाओं को संस्कृति व्यंजन को संलग्न करना चाहिए और धुरी की तरह कोशिका आकृति विज्ञान है ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को एक कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से 14 दिनों के लिए-प्लेटों को कॉलोनी निर्माण क्षमता है कि fibroblasts और MSCs की एक विशिष्ट विशेषता है निरीक्षण के लिए किया जा सकता है ।
  2. सतह मार्कर विश्लेषण करते हैं ।
    1. चरण १.७ से कक्षों को Trypsinize । टी-७५ टिशू कल्चर कुप्पी से मीडिया निकालें, पंजाब के 2 मिलीलीटर से धो लें, और trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें । humidified हवा वातावरण और 5% CO2के साथ ३७ ° c में एक मशीन में 2 मिनट के लिए मशीन । फिर trypsin को बाधित करने के लिए 2 मिनट की मशीन द्वारा पीछा पूरा DMEM मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें । ३०० एक्स जी पर कोशिकाओं को गोली कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    2. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और फिर उन्हें paraformaldehyde को दूर करने के लिए 3 बार पंजाब के ५०० µ एल के साथ धो लें ।
    3. CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166, और CD73 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ स्थिर कोशिकाओं की मशीन 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए १०० µ में पंजाब के एल.
      नोट: एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है की एकाग्रता ०.५ µ g/ CD34, CD14, और CD45 नकारात्मक मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है, जबकि CD29, CD90, CD105, CD166, और CD73 सकारात्मक सेल सतह मार्करों MSCs के लिए के रूप में उपयोग किया जाता है ।
    4. पंजाबियों के साथ 3 बार कोशिकाओं को धो और लेबलिंग के लिए fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (पीई), आदि के रूप में संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पंजाब के १०० µ एल में 1:500 पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ गर्मी कोशिकाओं और पंजाबियों के साथ 3 बार धो लो ।
    5. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए अंधेरे में नमूने रखें और प्रवाह cytometry द्वारा सकारात्मक और नकारात्मक धुंधला का पता लगाने ।
      नोट: आगे और साइड स्कैटर की व्यवस्था करने के लिए दाग नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग करें । मृत कोशिकाओं, मलबे, और संयुक्त राष्ट्र के दाग आबादी को छोड़कर द्वारा सकारात्मक दाग आबादी के गेटिंग की व्यवस्था । ४५ साई म्यान दबाव के साथ १०० µm नोजल का उपयोग करें और चैनलों की व्यवस्था करके सकारात्मक DPSCs निर्धारित करने के लिए १०,००० घटनाओं को इकट्ठा ।
  3. DPSCs के विभेद को पूरा करें ।
    1. बीज पर 1 × 104 कोशिकाओं पर 24-पूरी DMEM मीडिया में अच्छी तरह से प्लेटें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए मशीन 5% CO2के साथ एक humidified हवा वातावरण में ।
    2. आधार मीडिया के रूप में प्रतिस्पर्धा DMEM माध्यम का उपयोग कर भेदभाव मीडिया तैयार करना । १०० एनएम डेक्समेतएसॉनी, 10 मिमी β-glycerophosphate, और ०.२ mm ascorbic एसिड को मिलाकर osteogenic मीडिया तैयार करें । 1 × इंसुलिन-कैल्सीटोनिन-सेलेनियम (इसके-जी), १०० एनएम डेक्समेतएसॉनी, १०० एनजी/एमएल बदलने वृद्धि कारक बीटा (TGF-β), 14 μg/एमएल ascorbic एसिड, और 1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) को मिलाकर chondrogenic मीडिया तैयार करें । १०० एनएम डेक्समेतएसॉनी, 5 μg/एमएल इंसुलिन, ०.५ mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), और ६० माइक्रोन indomethacin को मिलाकर adipogenic मीडिया तैयार करें ।
      नोट: भेदभाव मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस से कम एक सप्ताह के लिए रखा जा सकता है ।
    3. परिवर्तन विकास मीडिया आस्टियो-, chondro-, या adipo-genic भेदभाव मीडिया और ताज़ा मीडिया दो सप्ताह के लिए सप्ताह में दो बार ।
    4. वॉन Kossa और Alcian नीले दाग, एंजाइम गतिविधि (क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि), immunocytochemistry, और मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) विश्लेषण द्वारा पहले21वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार भेदभाव की पुष्टि करें ।
      1. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% paraformaldehyde के साथ तय कर रहे हैं कि कोशिकाओं पर वॉन Kossa और Alcian नीले दाग प्रदर्शन करते हैं । पंजाबियों के साथ तय की कोशिकाओं को धोने और उंहें कैल्शियम जमा निरीक्षण करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार vonKossa किट के साथ दाग .
      2. 3% की १०० मिलीलीटर में Alcian नीले रंग के १.०० जी भंग करके Alcian नीले दाग समाधान तैयार (वी/v) आगे धुंधला के लिए एसिटिक एसिड । Alcian ब्लू समाधान के साथ 30 मिनट के लिए पंजाब और दाग कोशिकाओं के साथ तय कोशिकाओं को धो लें । एक प्रकाश माइक्रोस्कोप द्वारा दाग नमूने कल्पना ।

3. कंडीशन मीडियम की तैयारी (CM)

  1. मुख्यमंत्री संग्रह से पहले ताजा पूरा DMEM 24 एच के साथ कदम १.७ से कोशिकाओं के मीडिया बदलें ।
    नोट: 2-4 बीतने की सिफारिश की है ।
  2. वातानुकूलित DPSCs से मध्यम (सेमी) इकट्ठा जब कोशिकाओं ८०% प्रवाह तक पहुंचने । 5 मिनट के लिए अपशिष्ट ऊतक सामग्री और कोशिका मलबे को हटाने के लिए ३०० x g पर एकत्र मीडिया केंद्रापसारक ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, हालत मध्यम से मलबे को हटाने के लिए ०.२ µm सिरिंज फिल्टर का उपयोग करें ।
  3. supernatant लीजिए और अधिक प्रयोगों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    नोट: लंबी अवधि के भंडारण के लिए supernatant पर-८० ° c रखें ।

4. मुख्यमंत्री के साथ कैंसर कोशिकाओं का उपचार

  1. सेल व्यवहार्यता विश्लेषण करते हैं ।
    1. बीज पीसी-3 कोशिकाओं (मानव प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं) पर ९६-अच्छी तरह से प्लेटें 5 × 103 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व में/अच्छी प्रकार से पूरा DMEM और एक humidified कक्ष में ३७ डिग्री सेल्सियस पर और 5%2 सह 24 घंटे के लिए मशीन ।
    2. 24 एच के लिए पूर्ण DMEM के साथ मिश्रित 10, 20, 30, ४०, और सेमी (v/v) के ५०% के साथ कोशिकाओं का इलाज ।
    3. 3 का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता उपाय-(4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-फिनाइल)-2-(4-sulfo-फिनाइल)-2H-tetrazolium (MTS)-परख के रूप में वर्णित पहले24।
  2. परफॉर्म टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ dUTP निक एंड लेबलिंग (TUNEL) िरा.
    1. बीज पीसी-6 पर 3 कोशिकाओं-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटें 2 × 105 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व पर/अच्छी तरह से और एक humidified कक्ष में ३७ ° c और 5% सह2 रात भर में मशीन ।
    2. पूर्ण DMEM माध्यम के साथ 20% सेमी (v/v) को मिलाएं और 24 ज के लिए कक्षों पर लागू करें ।
    3. Trypsinize कोशिकाओं और TUNEL प्रतिक्रिया मिश्रण के ५० μL में निलंबित (लेबल समाधान + एंजाइम समाधान, किट के साथ आपूर्ति की) और ६० मिनट के लिए एक humidified और 5% सह2 वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
      नोट: trypsinization के लिए, 6-well सेल कल्चर प्लेट्स से मीडिया निकालें, पंजाब के 1 मिलीलीटर से धो लें और trypsin के ५०० µ l को जोड़ें । humidified हवा वातावरण और 5% CO2के साथ ३७ ° c में एक मशीन में 2 मिनट के लिए मशीन । trypsin को बाधित करने के लिए 2 मिनट की मशीन द्वारा पीछा पूरा DMEM मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । ३०० एक्स जी पर कोशिकाओं को गोली कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    4. पंजाबियों के साथ कुल्ला और cytometry प्रवाह का उपयोग करके पंजाब में कोशिकाओं का विश्लेषण ।
  3. प्रदर्शन qPCR िरा.
    1. बीज पीसी-6 पर 3 कोशिकाओं-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटें 2 × 105 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व पर/अच्छी तरह से और एक humidified मशीन में ३७ ° c और 5% सह2 रात भर में मशीन ।
    2. पूर्ण DMEM माध्यम के साथ 20% सेमी (v/v) को मिलाएं और 24 ज के लिए कक्षों पर लागू करें ।
    3. Trypsinize कोशिकाओं और आरएनए अलगाव और सीडीएनए संश्लेषण के लिए सेल गोली इकट्ठा ।
      नोट: 6-well सेल कल्चर प्लेट्स से मीडिया निकालें, पंजाब के 1 मिलीलीटर से धो लें, और trypsin के ५०० µ l को जोड़ें । humidified हवा वातावरण और 5% CO2के साथ ३७ ° c में एक मशीन में 2 मिनट की मशीन । trypsin को बाधित करने के लिए 2 मिनट की मशीन द्वारा पीछा पूरा DMEM मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । ३०० एक्स जी पर कोशिकाओं को गोली कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    4. पहले वर्णित प्रोटोकॉल25के अनुसार qPCR प्रयोगों को निष्पादित करें ।
  4. कैंसर कोशिकाओं के सेल माइग्रेशन निष्पादित करें ।
    1. बीज 1 × 105 पीसी-12 पर 3 कोशिकाओं-अच्छी तरह से प्लेटें और एक humidified मशीन में रात भर ३७ ° c और 5% सह2में मशीन ।
    2. एक बाँझ २०० μL टिप और सेमी के विभिन्न सांद्रता युक्त ताजा माध्यम के साथ तुरंत मध्यम परिवर्तन के साथ खरोंच कोशिकाओं [उदा., 10, 20, 30, ४०, और सेमी की ५०% (वी/
    3. एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत खरोंच का निरीक्षण और विभिन्न समय अंतराल (0 और 24 एच) पर तस्वीरें ले लो ।
    4. फार्मूला का उपयोग कर छवि जंमू सॉफ्टवेयर का उपयोग करके खरोंच बंद उपाय:
      Equation
      नोट: छवि जंमू सॉफ्टवेयर के साथ खरोंच छवि खोलें । छवि में पहले से मौजूद स्केल बार के समान परिमाण वाली रेखा आरेखित करना । क्लिक करें विश्लेषण, स्केल सेट, और आरेखित रेखा के आवर्धन के रूप में पिक्सेल में दूरी का निरीक्षण । ज्ञात दूरी भाग के लिए स्केल बार का आकार लिखें, इकाई (पिक्सल, सेमी, आदि) की व्यवस्था है, और ठीक पर क्लिक करें । फिर से विश्लेषण अनुभाग में जाओ और माप पर क्लिक करें । यह पहले चयनित इकाई के रूप में स्केल बार का आकार देगा । खरोंच के एक किनारे पर क्लिक करें और खींचें खरोंच के दूसरे छोर तक पहुंचने तक । प्रत्येक समय बिंदु (0 h और 24 h) के लिए मान नोट करें । इन मानों को ऊपर के सूत्र में प्लग करें और स्क्रैच बंद करने की गणना करे ।

5. कैंसर कोशिकाओं और DPSCs के अप्रत्यक्ष संपर्क द्वारा सेल प्रवासन

  1. बीज 3 × 104 24 पर DPSCs-अच्छी तरह से थाली आवेषण ०.४ माइक्रोन ताकना और एक humidified मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर ।
  2. बीज पीसी-24 पर 3 कोशिकाओं-अच्छी प्लेटें 5 × 104 के एक सेल घनत्व पर और एक humidified मशीन में रात भर ३७ ° c और 5% सह2में मशीन ।
  3. खरोंच पीसी-एक बाँझ २०० μL टिप के साथ 3 कोशिकाओं, ताजा माध्यम के साथ माध्यम बदलने के लिए, और जगह पीसी-3 कोशिकाओं पर DPSCs ले जाने आवेषण.
  4. एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें और सेल माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न समय अंतराल (0 और 24 एच) पर तस्वीरें ले लो ।

6. सह-संस्कृति परख और प्रवाह Cytometry विश्लेषण

  1. लेबल पीसी-3 कोशिकाओं और PKH67 (हरा) और PKH26 (लाल) फ्लोरोसेंट सेल linker रंजक, क्रमशः26का उपयोग करके DPSCs ।
  2. Trypsinize पीसी-3 और DPSCs कोशिकाओं, क्रमशः । टी से मीडिया निकालें-७५ ऊतक संस्कृति कुप्पी, पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो, और trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें । humidified हवा वातावरण और 5% CO2के साथ ३७ ° c में एक मशीन में 2 मिनट के लिए मशीन । trypsin को बाधित करने के लिए 2 मिनट की मशीन द्वारा पीछा पूरा DMEM मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, supernatant त्यागें, और मंदक-सी किट द्वारा आपूर्ति की बफर में तैयार डाई समाधान में सेल छर्रों resuspend ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  4. 10 मिनट के लिए डाई समाधान में कोशिकाओं को गर्मी और FBS के १०० µ एल जोड़कर धुंधला प्रतिक्रिया समाप्त । 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक, supernatant त्यागें, और सह संवर्धन से पहले पूर्ण विकास के माध्यम से कोशिकाओं को धो लो ।
  5. प्लेट लेबल कोशिकाओं (5 × 104/well) पर 6-अच्छी तरह से प्लेटों पर 1:1 अनुपात (DPSCs: PC3). पूर्ण DMEM में सह-कल्चर्ड कक्ष बनाए रखें ।
  6. 5 मिनट के लिए और पंजाबियों के साथ धोने के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक द्वारा 24 ज या ४८ एच मशीन अवधि के बाद कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  7. प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) बफ़र के ३०० µ l में 5 मिलीलीटर दौर नीचे प्रवाह cytometry ट्यूबों में कोशिकाओं को पुनः निलंबित । नमूना विश्लेषण से पहले सही सेल समुच्चय फैलाने के लिए भंवर ।
  8. ४५ साई म्यान दबाव के साथ एक १०० µm नोजल का उपयोग करें ।
    नोट: अत्यंत उच्च प्रवाह दर प्रतिदीप्ति का पता लगाने की संवेदनशीलता कम हो सकती है ।
  9. पहले27उल्लेख के रूप में सेल प्रकार और मुआवजे के लिए उपयुक्त आगे और साइड स्कैटर लेजर वोल्टेज को समायोजित करने के लिए दाग नियंत्रण कोशिकाओं और एक रंगीन कोशिकाओं का प्रयोग करें ।
    नोट: कक्ष के मलबे, मृत कोशिकाओं, या समुच्चय को बाहर करने के लिए लाइव कक्षों के लिए गेटिंग का उपयोग करें ।
  10. fl-1 (हरा) और fl-2 (लाल) चैनलों की व्यवस्था करके प्रतिशत सकारात्मक हरी DPSCs और लाल पीसी-3 कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए १०,००० घटनाओं (१००,००० बेहतर है) लीजिए.

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Representative Results

चित्रा 1 संस्कृति की स्थिति के तहत DPSCs के जनरल एमएससी विशेषताओं को दर्शाया गया है । DPSCs (आंकड़ा 1b) चढ़ाना के बाद fibroblast की तरह कोशिका आकृति विज्ञान डालती है । MSC सरफेस एंटीजन (CD29, CD73, CD90, CD105, और CD166) अत्यधिक व्यक्त करते हैं जबकि टेम मार्कर (CD34, CD45, और CD14) नेगेटिव (फिगर 1C) होते हैं । आस्टियो-, chondro-, और adipo-genic भेदभाव से संबंधित रूपात्मक और आणविक स्तर पर परिवर्तन DPSCs संस्कृति में विभेदक कॉकटेल आवेदन (चित्रा 1 d)के बाद मनाया जाता है ।

प्रोस्टेट कैंसर सेल प्रसार और प्रवास पर DPSCs से स्रावित अणुओं की गतिविधि का निर्धारण करने के लिए, हम मुख्यमंत्री कि संस्कृतिपूर्ण दंत स्टेम कोशिकाओं से एकत्र किया जाता है और कैंसर सेल प्रसार और प्रवासी व्यवहार का विश्लेषण लागू होता है । मुख्यमंत्री उपचार (20% v/) MTS सेल व्यवहार्यता विश्लेषण के आधार पर चयनित किया गया था । पीसी-3 स्टेम सेल मुख्यमंत्री के साथ इलाज कोशिकाओं TUNEL परख और qPCR विश्लेषण के अधीन थे कोशिका मृत्यु और नियंत्रण और प्रायोगिक शर्तों के तहत अपोप्तोटिक विनियमन निर्धारित करते हैं । हम निष्कर्ष निकाला है कि मुख्यमंत्री उपचार सेल व्यवहार्यता और पीसी में कम सेल मौत-3 सेल संस्कृति में वृद्धि हुई । पूर्व vivo सेल माइग्रेशन परख (खरोंच परख) DPSCs के मुख्यमंत्री पीसी-3 कैंसर सेल प्रवास को प्रभावित करता है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए किया गया था । 10% और 20% सेमी (वी/वी) की सांद्रता के साथ उपचार काफी नियंत्रण समूह की तुलना में 24 ज (चित्रा 2)में खरोंच बंद करने में वृद्धि हुई । इसी प्रकार, 20% सेमी (वी/उपचार प्रेरित extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन जीन अभिव्यक्ति जैसे कोलेजन मैं, fibronectin, और laminin, जो सेल प्रवास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ।

हम दो अलग संस्कृति तकनीक का इस्तेमाल किया पीसी की प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष सह संस्कृतियों-3 कोशिकाओं और पूर्व vivo शर्तों के तहत DPSCs की स्थापना । ट्रांस-वेल सिस्टम पीसी-3 कैंसर कोशिकाओं के लिए एक अप्रत्यक्ष संपर्क वातावरण बनाने के लिए चुना गया था । पीसी-3 कोशिकाओं को अच्छी तरह से थाली और आवेषण DPSCs ले जाने के तल पर वरीयता प्राप्त शीर्ष पर रखा गया था । क्योंकि हम एक में सीधे संपर्क, ट्रांस-०.४ माइक्रोन ताकना आकार के साथ अच्छी तरह से झिल्ली उत्पंन करने का उद्देश्य ऊपरी भाग से DPSCs के शारीरिक कोशिका आंदोलन को रोकने के लिए उपयोग किया गया झिल्ली के माध्यम से नीचे भाग के लिए । DPSCs से स्रावित अणुओं पीसी की बढ़ी खरोंच बंद करने-3 कोशिकाओं को नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में काफी । पीसी-3 DPSCs के साथ प्रसंस्कृत कोशिकाओं ५१% खरोंच बंद करने का प्रदर्शन किया, जबकि नियंत्रण कोशिकाओं 24 घंटे के बाद ३८% बंद था (3 ए आंकड़ा)। प्रत्यक्ष सह संस्कृतियों DPSCs और पीसी-3 कोशिकाओं के 1:1 अनुपात युक्त स्वयं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया स्टेम सेल और कैंसर की कोशिकाओं के संगठन । कोशिकाओं को लाल और हरे रंग की झिल्ली के साथ दाग थे माइक्रोस्कोप के तहत विभिंन प्रकार के कोशिका भेद । पीसी-3 लाल प्रतिदीप्ति डाई के साथ सना हुआ कोशिकाओं को एक ट्यूब की तरह संरचना में DPSCs से घिरे थे एक 24 एच मशीन अवधि के बाद । फ्लोरोसेंट रंजक से सना हुआ सह-प्रसंस्कृत कोशिकाओं प्रतिदीप्ति धुंधला के आधार पर प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था, और कोशिका अनुपात का पता लगाया गया । DPSCs और पीसी-3 कोशिकाओं एक अच्छी तरह से संगठित संरचना है जिसमें पीसी-3 कोशिकाओं ४८ के बाद तेजी से proliferated ज (चित्रा बी)बनाया । हालांकि कोशिकाओं को एक समान अनुपात (1:1) में प्रत्यक्ष सह संस्कृति के लिए वरीयता प्राप्त थे, पीसी के ६२.२२%-3 कोशिकाओं ४८ एच मशीन के बाद निर्धारित किया गया था, पीसी की उच्च प्रसार दर-3 कोशिकाओं का संकेत ।

Figure 1
चित्रा 1: दंत लुगदी स्टेम सेल (DPSCs) के लक्षण वर्णन । (क) लुगदी दांत के केंद्र से प्राप्त ऊतक । (ख) Fibroblast-DPSCs की तरह कोशिका आकृति विज्ञान । स्केल बार: १०० माइक्रोन । (ग) DPSCs. CD29, CD73, CD90, CD105, और सीडी १६६ के प्रवाह cytometry विश्लेषण सकारात्मक सतह मार्कर हैं, जबकि CD14, CD34, और CD45 नकारात्मक सतह मार्कर हैं । नेकां: नकारात्मक नियंत्रण (विकास मध्यम कोशिकाओं का इलाज) । (घ) DPSCs के mesenchymal कोशिका प्रकारों में अंतर वॉन Kossa धुंधला, Alcian नीला धुंधला, और लिपिड बूंदों (स्केल बार: २०० माइक्रोन) के साथ पुष्टि की गई थी । Osteocalcin, कोलेजन प्रकार द्वितीय (कर्नल द्वितीय), और फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन 4 (FABP4) immunostainings आस्टियो-, chondro-, और adipogenic के DPSCs भेदभाव दिखाया । स्केल बार: २०० माइक्रोन । यह आंकड़ा दोगान एट अल से अनुकूलित है । ३४. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कोशिका व्यवहार्यता और खरोंच विश्लेषण के लिए DPSCs से हालत मध्यम (सेमी) का संग्रह । TUNEL धनात्मक कक्षों में 20% सेमी (v/v) अनुप्रयोग की कमी की गई थी । खरोंच बंद करने के परिमाणात्मक माप से पता चला कि मुख्यमंत्री पीसी-3 सेल प्रवास में वृद्धि हुई । मुख्यमंत्री: वातानुकूलित माध्यम; नेकां: नकारात्मक नियंत्रण (विकास मध्यम कोशिकाओं का इलाज) । * P < ०.०५. यह आंकड़ा दोगान एट अल से अनुकूलित है । ३४. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ट्रांस के लिए कार्यप्रणाली-अच्छी तरह से सेल प्रवास परख और सह संस्कृति । (A) पीसी-ट्रांस-वेल सह-कल्चर सिस्टम में 3 सेल स्क्रैच बंद । (ख) दाग DPSCs (green प्रतिदीप्ति) और पीसी-3 कोशिकाओं (red प्रतिदीप्ति) के 24 ज और सह-संस्कृति (1:1 सीडिंग अनुपात) के ४८ ज के बाद इंटरेक्शन पैटर्न । DPSCs के संबंध में उच्चतर पीसी-3 कक्ष संख्या का पता लगाया गया । स्केल बार: २०० माइक्रोन । यह आंकड़ा दोगान एट अल से अनुकूलित है । ३४. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ट्यूमर पर्यावरण के लिए MSCs का योगदान सेल फ्यूजन, entosis या cytokine और स्टेम सेल और कैंसर की कोशिकाओं के बीच28chemokine गतिविधियों के माध्यम से संकर सेल पीढ़ी सहित कई बातचीत द्वारा विनियमित है । संरचनात्मक संगठन, सेल सेल बातचीत, और स्रावित कारकों ट्यूमर संवर्धन के मामले में कैंसर सेल व्यवहार का निर्धारण, प्रगति, और आसपास के ऊतकों को मेटास्टेसिस. उचित पूर्व vivo मॉडल सिस्टम निवासी सेल आबादी की बातचीत के पीछे तंत्र की जांच करने के लिए कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस के लिए सेलुलर संचार समझने की आवश्यकता है ।

हम प्रोस्टेट कैंसर और दंत स्टेम सेल बातचीत के लिए एक मॉडल प्रणाली बनाने के लिए DPSCs का इस्तेमाल किया । वयस्क स्टेम सेल के इस प्रकार के लाभ ऊतक स्रोत और आसान अलगाव कदम की पहुंच है । दूसरी ओर, अच्छी तरह से ज्ञात वयस्क स्टेम सेल प्रकार के साथ तुलना के बिना केवल DPSCs का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल की कमी है । वर्तमान सह-संस्कृति के तरीकों प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष तकनीक में वर्गीकृत कर रहे है जो paracrine शामिल घुलनशील स्रावित अणुओं और एक ही वातावरण में विभिंन कोशिका आबादी के प्रत्यक्ष संस्कृति के संकेत29,30, 31. पूरी तरह से विशेषता DPSCs के मुख्यमंत्री संस्कृति में paracrine संकेत मध्यस्थता कैंसर कोशिका विकास का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. मुख्यमंत्री आवेदन सेल बातचीत के अध्ययन के लिए सबसे आसान तरीका है और संस्कृति प्रणाली में घुलनशील मध्यस्थ गतिविधियों के अवलोकन के लिए अनुमति देता है । हालांकि मुख्यमंत्री एक पूरी तरह से पर्याप्त मॉडल प्रणाली नहीं है, एक सह के रूप में मुख्यमंत्री आवेदन-संस्कृति विधि सेल सेल बातचीत पूर्व vivoका पालन करने के लिए बहुत कुशल है. DPSCs के मुख्यमंत्री कोशिका प्रसार और प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के प्रवास में वृद्धि हुई है, DPSCs से स्रावित कारकों के कारण मेटास्टेटिक phenotype के अधिग्रहण का संकेत है ।

सेल के एक अंय मॉडल-सेल संपर्क इस तरह के एक ट्रांस के रूप में एक शारीरिक बाधा की स्थापना है अच्छी तरह से कोशिका आबादी30के बीच झिल्ली । ट्रांस अच्छी तरह से सिस्टम दो प्रकार में विभाजित हैं: उन जो pores के माध्यम से सेल आंदोलन की अनुमति है, और उन स्रावित कारकों के हस्तांतरण को सक्षम करने जबकि झिल्ली के माध्यम से सेल संपर्क बाधा के रूप में अच्छी तरह से । हम ०.४ माइक्रोन ताकना आकार के साथ ट्रांस कुओं का इस्तेमाल किया पीसी के बंद का विश्लेषण-3 खरोंच, नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में DPSC समूह में उच्च कैंसर सेल प्रवास दर खुलासा ।

हालांकि सेमी और ट्रांस-वेल आधारित सिस्टम एक विशेष सेल प्रकार३२के योगदान का विश्लेषण करने के लिए लाभप्रद हैं, एक ही वातावरण में विभिन्न उपजनसंख्याों के प्रत्यक्ष संवर्धन अप्रत्यक्ष सह संस्कृति के साथ समानांतर तरीके से आवश्यक है । सीडिंग अनुपात और नियंत्रित किया जा सकता है अलग आबादी के संरचनात्मक संगठन आसानी से प्रत्यक्ष सह द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है कैंसर की कोशिकाओं के साथ एमएससी की संस्कृति । हम क्रमशः DPSCs और पीसी-3 हरे और लाल प्रतिदीप्ति झिल्ली रंजक के साथ दाग कोशिकाओं के 1:1 अनुपात का इस्तेमाल किया । DPSCs पीसी-3 कोशिकाओं को घेर और संस्कृति कुओं में एक ट्यूब की तरह संरचना बनाया । पीसी-3 कोशिकाओं DPSCs द्वारा उत्पंन चैनल की तरह संरचनाओं से घिरा हुआ टाप के रूप में समूहों का गठन किया ।

हाल ही में, Brunetti एट अल. दिखाया गया है कि DPSCs स्रावित TNF से संबंधित apoptosis-उत्प्रेरण ligand (ट्रेल) osteogenic भेदभाव के दौरान और मायलोमा कैंसर कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित, कैंसर के साथ दंत स्टेम कोशिकाओं के संभावित बातचीत का संकेत कक्ष३३। हमारे अध्ययन पहली रिपोर्ट है कि एक पूर्व vivo मॉडल के रूप में दंत चिकित्सा व्युत्पंन MSCs और प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं की बातचीत का मूल्यांकन करता है । हम अपने प्रयोगों में तीन अलग प्रत्यक्ष/अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया । कैंसर की कोशिकाओं और उच्च प्रवास दरों के प्रसार या तो मुख्यमंत्री और ट्रांस से अच्छी तरह से परख या सह द्वारा पता लगाया गया संवर्धन अंतर से सना हुआ कोशिकाओं है कि कई बातचीत के लिए अनुमति देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को Yeditepe विश्वविद्यालय ने समर्थन दिया था. इस आलेख में उपयोग किए गए सभी डेटा और आंकड़ों को पहले३४प्रकाशित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11885084 For cell culture
FBS Invitrogen 16000044 For cell culture
PSA Lonza 17-745E For cell culture
Trypsin Invitrogen 25200056 For cell dissociation
PBS Invitrogen 10010023 For washes
Dexamethasone Sigma D4902 Component of differentiation media
β-Glycerophosphate Sigma G9422 Component of osteogenic differentiation medium
Ascorbic acid Sigma A4544 Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) Invitrogen 41400045 Component of chondrogenic differentiation medium
TGF-β Sigma SRP3171 Component of chondrogenic differentiation medium
Insulin Sigma I6634 Component of adipogenic differentiation medium
Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma I7018 Component of adipogenic differentiation medium
Indomethacin Sigma I7378 Component of adipogenic differentiation medium
MTS Reagent Promega G3582 Cell viability analyses
TUNEL Assay Sigma 11684795910 Apoptotic analyses
24-well plate inserts Corning 3396 For trans-well migration assay
PKH67 Sigma PKH67GL For co-culture cell staining
PKH26 Sigma PKH26GL For co-culture cell staining
Paraformaldehyde Sigma P6148 For cell fixation
von Kossa Kit BioOptica 04-170801.A For cell staining (differentiation)
Alcian blue Sigma A2899 For cell staining (differentiation)

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References

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Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58825, doi:10.3791/58825 (2019).

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