Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering af enkelt intracellulære bakterielle samfund genereret fra en Murine Model af urinvejsinfektion for Downstream encellede analyse

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/58829
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1,3
1Infectious Diseases Group, Genome Institute of Singapore, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, National University of Singapore, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Summary

Denne protokol beskriver en simpel metode til at isolere enkelt, inficeret blæren epitel celler fra en murine model af urinvejsinfektion.

Abstract

I denne artikel vil skitsere vi en procedure, der anvendes til at isolere individuelle intracellulære bakterielle samfund fra en mus, der har været eksperimentelt inficeret i urinvejene. Protokollen kan groft inddeles i tre sektioner: infektion, blære epitelcelle høst og mund micropipetting at isolere individuelle inficerede epitelceller. Den isolerede epitelcelle indeholder levedygtige bakterieceller og er næsten fri for kontaminerende ekstracellulære bakterier, hvilket gør den ideel til downstream encellede analyse. Den tid, det tager fra starten af infektionen til at opnå en enkelt intracellulære bakterielle samfund er omkring 8 h. Denne protokol er billigt at installere og anvender bredt tilgængelige materialer, og vi forventer, at det også kan udnyttes i andre infektion modeller at isolere enkelt inficerede celler fra celle blandinger selvom de inficerede celler er sjældne. Men på grund af en potentiel risiko i munden micropipetting, denne procedure anbefales ikke til meget smitsomme agenser.

Introduction

Urinvejsinfektioner (urinvejsinfektioner) er en af de mest almindelige bakterielle infektioner. Anslået 40-50% af kvinder forventes at opleve mindst én urinvejsinfektion (UTI) i løbet af deres levetid1. En af de vigtigste agenter af UTI er uropathogenic E. coli (UPEC), som tegner sig for over 70% af ukomplicerede urinvejsinfektioner2. Omkring en fjerdedel af dem, der har en UTI har desuden en tilbagevendende infektion, ofte forårsaget af den samme stamme, trods relevant antibiotisk behandling3. Den høje forekomst af UTI repræsenterer en betydelig byrde på sundhedssystemerne, koster mere end 2 milliarder dollars om året i USA 's4. Desuden fører brug af antibiotika til behandling af urinvejsinfektioner også til stigende antibiotikaresistens satser, som er en større offentlige sundhed bekymring5.

Derfor har en stor indsats været placeret i at forstå de mekanismer, hvorved UPEC inficerer urinvejene, såvel som dens evne til at forårsage recidiverende infektioner6,7,8. Især er en musemodel af infektion blevet brugt til at behandle bakterielle og vært egenskaber, der bidrager til UTI8. Denne musemodel har fordelen at være gældende for umodificeret klinisk stammer isoleret fra menneskelige patienter. Denne model har også ført til opdagelsen af potentielt druggable bakteriel veje vigtigt for etableringen af UTI, såsom den Type 1 pilus9 og jern erhvervelse systemer10.

Sammenlignet med disse succeser i at studere de tidlige begivenheder i UTI, mangler kendskab til de underliggende tilbagevendende UTI mekanismer stadig11. En hypotese er, at UPEC undviger antibiotikabehandling og forårsager tilbagevendende infektioner i blæren ved at danne intracellulære bakterielle samfund (IBC 's) i blæren epitel celler. IBC'er er blevet identificeret, både i murine modeller af infektion og i menneskelige UTI patienter12,13. Tilstedeværelsen af IBC'er i urinprøver fra pediatric UTI patienter har været forbundet med højere satser for gentagelse14,15. Imidlertid isolere IBC'er og studere bakterier i dem har vist sig for at være teknisk udfordrende på grund af deres sjældenhed; Det anslås, at en inficeret murine blære typisk kun har 10-100 IBC'er16. Derudover blæren epitel celler er forholdsvis stor (50-120 µm)17, at gøre det udfordrende for at implementere fluorescens bistået celle sortering (FACS) da der typisk FACS dyser er designet med diametre af 70 µm eller 100 µm. Celler så stor som blæren epitel celler er således ofte fjernes ved filtrering før FACS at undgå tilstopning af fluidics.

Vores lab for nylig beskrev en generel og økonomisk metode til at isolere sjældne inficerede celler fra blandinger som skrabede epitelceller af blæren18. Du kan effektivt isolere IBC'er, brugte vi traditionelle munden pipettering. Munden micropipetting er en teknik, der har længe været anvendt til micromanipulation af enkelt celler og embryoner til downstream analyse19,20,21,22,23, 24 , 25. traditionelle munden Pipettering af store flydende mængder (i milliliter) har ofte været årsag til laboratoriet vedrørende ulykker, og teknikken har med rette været undgået ved meget fra forskerkredse uden for traditionelle embryologi og enkelt celle applikationer. Vores protokol er inspireret af enkelt celle versioner af denne teknik19,20, som mindske risikoen ved at give en stor buffer (> 2 mL) af luften mellem forsker og prøve i forhold til mængden af væske overført (< 1 ΜL). Denne metode tager også fordel af fine kontrol at munden micropipetting giver, som oversætter til en lav endelige mængden af omgivende løsning overført og høj renhed af isolerede celler. Teknikken, der bruger billig materialer (<$ 50), og dermed burde være muligt at gennemføre i alle laboratorier.

Denne visuelle protokol beskriver vores IBC isolation teknik, giver en reference for at bistå andre forskere søger at kopiere denne teknik. Forskeren skal have adgang til en fluorescerende dissekere mikroskop (eller lignende udstyr), der kan bruges til at visualisere individuelle epitelceller og fluorescerende bakterier under live imaging, med en åben og tilgængelig imaging scenen for micropipetting (Se Tabel af materialer til detaljerne i mikroskop bruges, selvom andre tilsvarende instrument modeller kan også bruges). Mens denne protokol vil fokusere på IBC'er i en murine model af UTI, bør lignende metoder anvendes isolere inficerede celler fra celle suspensioner i andre modeller af infektion.

Protocol

Alle metoder, der beskrives her med hensyn til dyrs håndtering er godkendt af den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Genome Institute of Singapore og biologiske Resource Center af agenturet for videnskab, teknologi og forskning, Singapore.

1. Mouse infektion

  1. Forberedelse af glas kapillærer
    1. Lyskilde en åben ild (bunsenbrænder eller alkohol brænder).
    2. Hold et glas kapillær med to hænder af fast klemme begge ender, så varme midten af røret jævnt indtil glasset går blødt. Rotere kapillar forsigtigt frem og tilbage langs dens akse til støtte i selv varme glas.
    3. Fjerne glas kapillær fra varmekilden og straks trække hænder fra hinanden, samtidig med at greb på begge ender af røret. Den trak kapillær ideelle endelige længde er 3-5 cm længere end en unpulled kapillær at sikre en passende indre diameter til isolering af enkelt blæren epitel celler.
      Forsigtighed: Slangen er stadig meget varmt for en periode, så der er kapillar afsat på en varme-sikker overflade i et par minutter til at afkøle, før du fortsætter til næste trin.
    4. Tjek for at se, hvis i midten af glas kapillær er blevet hule smallere (fig. 1A) og at indre af røret er stadig (figur 1B). Til isolering af IBC'er er en boring størrelse på 200-400 µm brugbar.
    5. Afhente ene ende af den trak kapillær med den ene hånd. Hold et par pincet med anden hånden, og brug det til at afhente den trak glas kapillær på sit smalleste punkt. Sikre, at pincet er svingede med tilstrækkelig kraft til at greb kapillar fast uden at knuse det.
    6. Bruge en hurtig vride bevægelse af den hånd, der holder pincet til at fastgøre den trak kapillær på det smalleste sted til at oprette en mund micropipetting kapillær.
      Bemærk: Ved hjælp af fingrene i stedet for pincet er også acceptabelt, så længe tilstrækkelig beskyttelse mod glas skårene bruges.
    7. Gentag trin 1.1.2-1.1.6 mindst 4 x mere til at producere tilstrækkelig reservedele micropipetting kapillærer og levere en række diametre for IBC isolation. Hvis mere end én infektion gruppe forventes, forberede hver yderligere infektion gruppe 5 ekstra micropipetting kapillærer.
      Forsigtighed: Glem ikke at slukke for åben ild.
    8. Placer de trak kapillærer i en 100 mm petriskål og udsætte parabol til UV-stråling for 30 min til at sterilisere kapillærerne.
    9. Sæt det øverste låg på petriskålen efter UV sterilisation og gemme petriskål med kapillærer ved stuetemperatur.
  2. Forberedelse af katetre forud for infektion
    1. Forberede infektion som beskrevet i Hung et al.8 og Conover et al.26 mindst én dag før infektionen urinkatetre.
  3. Forberedelse af fluorescerende uropathogenic E. coli kultur
    1. Vokser den valgte fluorophore-udtrykker uropathogenic bakteriel stamme efter fastlagte protokoller.
      Bemærk: Valg af belastning og fluorophore afhænge i høj grad af mikroskop og stammer, der er tilgængelige i individuelle laboratorier. I dette eksempel bruger vi en stamme, der er afledt fra UTI89, som er en klinisk isolere oprindeligt fra en patient med tilbagevendende blærebetændelse. Denne stamme, SLC-638, bærer en plasmid (pSLC-77), der udtrykker både vsfGFP-9 og kanamycin modstand18. SLC-638 er vokset i LB bouillon ved 37 ° C suppleret med 50 µg/mL kanamycin.
    2. Streak stamme SLC-638 på en Luria Bertani (LB)-agar plade suppleret med 50 µg/mL kanamycin. Inkuber plade ved 37 ° C natten over.
    3. (Valgfrit) Se pladen på dissekere mikroskopet at bekræfte udtryk for fluorescerende markører før du vælger en koloni.
    4. Overføre ved hjælp af en bakteriel podning løkke, valgte kolonien til en 125 mL konisk kolbe med 10 mL af LB bouillon suppleret med 50 µg/mL kanamycin. Inkuber kolbe statisk ved 37 ° C i 24 timer.
    5. Subkultur bakterier fra denne kolbe ved at tage 10 µL af kultur fra kolben og fortynde det i 10 mL af LB bouillon suppleret med 50 µg/mL kanamycin i en frisk 125 mL kolbe (en 1:1000 fortynding). Inkuber denne anden kolbe statisk ved 37 ° C i en anden 24 h.
    6. Spin ned bakteriekulturen for 5 min på 5.000 x g og 4 ° C.
    7. Den dekanteres og resuspenderes bakteriel i kolde PBS på OD600 på 0,5.
      Bemærk: Selv om det kan variere fra kultur til kultur, typisk 1 mL af statisk kultur giver ca. 4-5 mL OD600 = 0,5 bakteriekulturen. Den samlede mængde af bakteriel inokulum behov for hver stamme kan beregnes som følger: 50 µL er påkrævet for hver mus og 50 µL er brug for påfyldning nål hoved. En yderligere 10-20% (mindst 50 µL) af inokulat anbefales at tage højde for dødvolumen i sprøjten.
    8. Bruge den resterende bakteriel blanding til at bestemme titer infektion som beskrevet i Hung et al.8.
      Bemærk: Dette trin kan blive forsinket et par timer ved at gemme den bakterielle blanding på 4 ° C.
  4. Murine Model af urinvejsinfektion
    1. Inficere musene, som beskrevet af Hung et al.8, med en eksperimentelle gruppe for hver stamme af fluorescerende E. coli kulturperler i afsnit 1.3.
      Bemærk: Se også Conover et al.26 for visuel hjælp.
    2. Bemærk tidspunktet for bakteriel podning af mus eller bur.
    3. Gentag infektioner for den hele eksperimentelle gruppe.
      Bemærk: Infektion kateter kan genbruges til alle mus i samme gruppe.
    4. Gentag trin 1.4.1-1.4.3 for hver eksperimentelle gruppe planlagt, at sikre, at en frisk kateter og nye smøremiddel gel er forberedt til hver gruppe.
      Bemærk: Til forsøg med et stort antal dyr, er det bedst at opdele dyrene i grupper på fem og overvældende infektioner, således at hver gruppe er inficeret ca 30 min til 1 time fra hinanden. Dette vil give tilstrækkelig tid til de følgende trin (afsnit 2 og 3).

2. blære epitelcelle høst for at opnå en cellesuspension

  1. Høst og invertere murine blærer
    1. Forberede tre 50 mL konisk rør fyldt med 45 mL i 70% ethanol for sterilisering kirurgisk udstyr.
    2. I to af rørene forberedt i trin 2.1.1, anbringes et par saks og et par pincet hver. Placer to par pincet (en helst smallere og med afrundet spids, for inversion af blæren) ind i den tredje rør.
      Bemærk: Værktøjer i det første rør vil blive brugt på det eksterne område, værktøjer i andet vil blive brugt i blæren høst, og de to par af pincet i sidste rør vil bruges i blæren inversion.
    3. På 6 h efter infektion, aflive de inficerede mus ifølge institutionens etablerede IACUC protokoller.
      Bemærk: Vores IACUC protokol kræver aktiv dødshjælp via cervikal dislokation udført mens musen er under anæstesi (isofluran).
    4. Læg dyrene fladt på ryggen og bruge en sprayflaske fyldt med 70% ethanol til at sterilisere deres abdominale område.
    5. Ved hjælp af et par pincet og kirurgisk saks fra den første tube (udarbejdet i trin 2.1.2), åbning gør et lille tværgående snit på huden omkring 1 cm over den urethrae. Udvid indsnittet diagonalt mod de øvre lemmer af musen, at skabe et V-formet snit langs hele forreste af musen, der afslører indholdet af bughinden. Sikre, at under denne proces, saksen ikke kan skære gennem tarmene af musen (figur 2A, B).
    6. Skift til det andet sæt af værktøjer (udarbejdet i trin 2.1.2). Ved hjælp af vinger af saks og pincet aksler, forsigtigt trykke ned på fedtpuder nær bækkenpartiet af musen.
      Bemærk: Dette trin forårsager blære til at Rage udad og sikrer synlighed for høst.
    7. Greb den udsatte blære ved spids med et par pincet (figur 2C).
    8. At holde et fast greb på blæren apex med pincet, skære og gratis blære fra resten af dyret (skære urinrøret og urinlederne væk) ved hjælp af kirurgiske saks. Ikke frigive pincet holding blæren endnu.
    9. Skifte fra saksen til smallere afrundede pincet fra den tredje koniske rør (fra trin 2.1.2), Indsæt spidsen af et skaft af den afrundede pincet i åbningen af blæren hvor var det bare skære i det foregående trin (figur 2D). Med spidsen af den afrundede pincet sikkert indsat i åbningen af blæren, frigive par pincet gribende apex af blæren og returnere den til den anden koniske rør.
    10. Ved hjælp af det andet par pincet fra den tredje rør forsigtigt slå blæren "inside out", først trække ydersiden slutningen af mundingen af blæren fra den afrundede pincet (figur 2D, pil 1) og vejlede det omkring og over andre spidsen af de afrundede pincet (figur 2D, pil 2).
      Bemærk: Handlingen kan sammenlignes med at fjerne en sok fra den ene fod og trække det over den anden.
      1. Inversion proces, opretholde den første afrundede par pincet næsten helt lukket. Dette giver tilstrækkelig bevægelsesfrihed til at trække blæren ud fra den første aksel af afrundede pincet, men også bringer anden skaftet af den afrundede pincet tættere til først og giver mulighed for blære overføres let. Det endelige resultat af dette skridt er, at blæren skal ende op at blive omvendt og på spidsen af den anden aksel af de første par pincet (figur 2E).
      2. Ved hjælp af andet par pincet, forsigtigt lokke inverteret blæren ud spidsen af pincet til 1 mL koldt PBS.
        Bemærk: (Valgfrit) Dette er det opportunt tidspunkt at tage billeder af hele inverteret, inficerede blære til at overholde de generelle frekvens og distribution af IBC'er, hvis nogen.
    11. Gentag trin 2.1.1-2.1.10 for hver blære i den eksperimentelle gruppe (til højst fem dyr).
  2. Blæren epitelcelle skrabning
    1. Ved hjælp af to rene par pincet, forsigtigt skrabe på ydersiden af inverteret blæren (som er den indre epitelcelle lag). Den omkringliggende PBS skal vises cloudier som skrabning provenuet og epitelceller er udgivet i PBS løsning.
    2. (Valgfrit) Bekræft visuelt, at blæren skrabning har udgivet celler i løsning ved hjælp af en dissekere mikroskop. Figur 3 A, B). PBS skal vises uklar med det blotte øje, og skrabede individuelle blæren epitel celler kan ses på 10 x forstørrelse.
    3. Gentag trin 2.2.1-2.2.2 for hver høstet blære fra trin 2.1.

3. intracellulære bakterielle samfund (IBC) isolation: mund Pipettering af IBC'er

Bemærk: Alle metoder, der beskrives i dette afsnit har undergået en institutionel risikovurdering. Munden pipettering bærer den iboende risiko for indtagelse af den løsning, der overføres. Denne risiko er i vid udstrækning afbødes af nanoliter diskenheder, der bruger denne protokol, og vi anbefaler, at alle brugere af protokollen løn hensyn til forsigtighedsprincippet og praksis noter vises her og i diskussionen.

  1. Efter cellerne har været skrabes ind i PBS, oprette mund micropipetting apparater (figur 3C).
    1. Indsæt den tykkere ende af den trak glas kapillær (unpulled slutningen) i gummiproppen (hvide ende) af indsugningsventil tube.
    2. Indsæt den smalle ende af en 1 mL pipette tip i andre åbne (rød) udgangen af indsugningsventil tube, at sikre, at der er en stram pasform.
    3. Indsæt den smalle ende af en 2 mL sugning pipette ind i den åbne, bredere ende af 1 mL pipette spids, igen at sikre, at der er en stram pasform.
      Bemærk: Den resulterende installationsprogrammet kan forskeren munden pipette fra den bredere, åbne ende af den aspirating pipette til at oprette en blid suge kraft fra den smalle ende af kapillarrør i anden enden af apparatet.
    4. Test den endelige mund micropipetting apparater ved hjælp af en 100 mm petriskål indeholdende frisk deioniseret vand. En lille suge handling på den åbne ende af den aspirating pipette (svarende til nipper på en drikke gennem et sugerør) bør øge niveauet af væske i kapillar, men ikke forårsage den deioniseret vand at overflow i indsugningsventil tube. Brug én hånd til at styre kapillarrør, mens du bruger anden hånden til at justere placeringen af petriskålen.
      Bemærk: Styrken af suge kræves til munden-pipettering en enkelt IBC varierer blandt forskere. Det anbefales dog at hver forsker forsøger denne teknik starter med en svag sugning og langsomt øge det hvis ingen væske strømmer op kapillar. Der er ingen grund for en magt større end sucking på en halm til at drikke. Hvis kapillar ikke synes at være picking up væske under testen i trin 3.1.4, er det muligt, at enten kapillar eller aspirating røret er tilstoppet og skal udskiftes. Det anbefales videre, at alle nye forskere første praksis kontrollerende suge i munden pipettering apparatet ved hjælp af steriliseret vand. Bemærk desuden, at kontrol af den mængde, der er taget op af munden pipettering apparatet ved hjælp af forskerens tungen. Tungen kan fint justere styrken af suge anvendt, samt fungere som et nødstop.
    5. Efter opnåelse af vellykket optagelse af væske, teste evnen til at udvise det fra kapillar ved forsigtigt blæse ind i den åbne ende af den aspirating pipette. Sikre, at ingen bobler er lavet ved at udvise væske for at undgå kontaminering af IBC'er under trin 3.5.
      Bemærk: Som med suge varierer styrken af positive tryk fra forsker at udvise IBC i centrifugeglasset blandt forskere. Det anbefales for forskerne nye til denne protokol til praksis trin 3.1 et par dage før den faktiske infektion. Et forslag til praktiserende mund micropipetting er praksis overførsel af små mængder af steriliseret vand blandet med et par dråber mad farve (for synlighed) med munden mikropipette apparatur.
  2. Placer den skrabede cellesuspension dissekere mikroskopet og identificere IBC'er som store fluorescerende aggregater (fig. 3A, B). Den ideelle vifte af forstørrelse er 20-40 x. Dyppe den fine slutningen af glasset kapillær i en frisk tube PBS for 1 s for at reducere udbredelsen af uønskede volumen gennem kapillaritet.
  3. Ser man gennem mikroskop, identificere IBC af interesse og langsomt bringe den åbne ende af kapillarrør mod IBC. Bruge den fine slutningen af glasset kapillær for at feje væk ekstra celler i nærheden hver IBC forhindre aspiration af to eller flere celler eller bryde apart større aggregater af celler.
  4. Mens du kigger gennem mikroskop, anvende en meget lille suge kraft på den fjerneste ende (sugning pipette) af munden micropipetting apparater til at guide IBC i glas kapillær.
  5. Efter picking up en IBC, flytte kapillar til en tom 1,5 mL centrifugeglas og anvende et let overtryk at udvise slipværktøjet og IBC i centrifugeglasset (figur 3D).
  6. Gentag trin 3,3-3,6 på efter mange IBC'er er behov fra nuværende blæren, før du fortsætter til næste blæren. Ændre sugning pipetter og kapillærer ofte at forhindre ophobning af spyt.
    Forsigtighed: Når du arbejder med smitsomme (eller kliniske) stammer af bakterier, konstant overvåge niveauet af løsning i kapillar. Lad ikke niveauet af væsken bliver pipetted overløb fra kanten af kapillar ind i indsugningsventil rør. Hvis dette sker, straks skifte til en anden indsugningsventil tube, og kassér den tidligere sæt op.
  7. Gentag trin 3.2-3.6 på alle høstede blærer, eller indtil tilstrækkeligt antal biologiske prøver er blevet indsamlet for den eksperimentelle gruppe.
  8. (Valgfrit) Gentag trin 3.6 og 3.7 indtil alle eksperimentelle grupper (eller mus) har været aflivet og tilstrækkelig biologiske prøver er blevet høstet fra hver gruppe.

Representative Results

Ud over bekræftelse (figur 3D) af tilstedeværelsen af en enkelt isoleret IBC i collection tube via dissekere mikroskop bekræftes renhed af den isolerede IBC også af Konfokal mikroskopi. Som vist i figur 4A, de isolerede celler bør pletten for både E. coli og uroplakin, og er den forventede størrelse for IBC'er (50-120 µm)17. Derudover er E. coli farvning ikke til stede i de omkringliggende væske. Baseret på vores data, er mere end 90% af celler isoleret med denne teknik IBC'er18. Efter isolering, kan tilstedeværelse og levedygtighed af bakterieceller i de enkelte IBC bekræftes gennem koloni-dannende enhed (CFU) optælling (fig. 4B) eller kvantitative polymerase kædereaktion (qPCR) for genomisk ækvivalenter ( Figur 4 C). figur 4C viser også ikke-inficerede epitelceller isoleret med samme protokol ikke har målelige mængder af bakterier. Baseret på disse data, anslår vi, at vifte CFUs i en enkelt IBC er 102-103 i murine model af urinvejsinfektion. En af de vigtigste mål for enkelt IBC isolation er at udføre downstream analyser såsom RNA sekventering. For at kontrollere, at vores isolation metode er stand til at opnå RNA fra bakterier i IBC'er for analyse, vi udførte kvantitativ reverse transkription polymerase kæde reaktion (qRT-PCR) kvantificering af tre gener (16S, cyoB, og frdA) for en række individuelt isoleret og poolet IBC'er (figur 4D). Alle de data, der er vist i figur 4 er blevet tilpasset med tilladelse fra Duraiswamy et al.18. En oversigt over skematisk af vores IBC isolation protokol kan ses i figur 5, som er gengivet fra Duraiswamy et al.18.

Figure 1
Figur 1 : Hånd-trukket kapillærer bevarer smalle åbninger. (A) prøver af hånd-trukket kapillarrør vises på en sort baggrund for kontrast. Fra bund til top, en unpulled kapillær, en kapillær, der ikke var trukket i tilstrækkelig grad, er en kapillær, der kan bruges til enkelt blære epitelcelle høst og en kapillær, der blev trukket for tynd (og dermed adskilt i to stykker) vist. En 15 cm lineal er placeret nederst i billedet til skala. Det anslåede punkt for snapping off den anvendelige kapillær er angivet på figuren med den røde pil. (B) billede taget med et dissekere mikroskop bekræfter den hule indvendige diameter af en trak kapillær (nederst). En unpulled kapillær er placeret over at vise den relative størrelse forskel på de to kapillærer. Skalalinjen = 4,0 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Dissektion af musen til at høste blæren epitel celler. (A) et billede af en mus med hvide linjer tilføjes angiver omtrentlig placering og vinkel af indsnit til at afsløre murine bughulen og blære. (B) et billede af eksponerede mus bughulen efter indsnit. (C) et billede af den udsatte blære (rød pil) fremspringende fra mellem de fedtpuder. (D) et billede af murine blæren med spidsen af pincet indsat i lumen, med pilene til at angive retningen af bevægelse for at invertere blæren. Blæren er først trak lidt udad, derefter rundt og slukke den første aksel af pincet. Retninger bevægelsesområdet for begge handlinger er som anført af hvide pile nummereret 1 og 2. (E) et billede som viser den endelige holdning af inverteret blæren indsat på anden akslen af pincet. Skafter af pincet er mærket i begge paneler D og E med røde pile og tekst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : IBC høst fra blæren celler. (A) en inficeret og omvendt blære i kolde PBS løsning før celle skrabning. (B) et billede som viser skrabet blære celler som set under et mikroskop. IBC'er kan identificeres som store grønne fluorescerende aggregater i både billeder (Se røde pile). (C) et billede af den færdige mund micropipetting apparater. Sugning pipette, pipette tip, indsugningsventil tube og trak kapillarrør identificeres med nummererede pile som anført til højre. (D) et billede af en enkelt isoleret IBC inden for en 1,5 mL collection tube (beskrevet i rødt). Skala barer (som nævnt) er repræsenteret af hvide linjer i paneler A, B og D. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Høstede IBC'er er ren og kan bruges til downstream analyse. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Duraiswamy mfl18. (A) billeder af to isolerede normal god landbrugspraksis-positive celler, der var farvet med anti-uroplakin og anti -E.coli antistoffer. Den første celle (IBC 1) har billeder af individuelle kanaler (ved lav-forstørrelse) til venstre, og en høj forstørrelse flettede billede er til højre. Den anden celle (IBC 2) er vist i høj forstørrelse i flettede og individuelle kanaler. Skala barer er som angivet. DNA er farvet med 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og repræsenteret i den blå kanal. AntiE. coli er plettet med en sekundær antistof konjugeret til fluorescein isothiocyanat (FITC) og repræsenteret i den grønne kanal. Anti-uroplakin er plettet med en sekundær antistof konjugeret med tetramethylrhodamine isothiocyanat (TRITC) og er repræsenteret i den røde kanal. (B) bakteriel CFUs fra isolerede IBC'er. IBC'er var behandles straks eller inkuberes i 0,1% Triton-X til 10 eller 30 min. Puljet CFU tællinger af individuelle IBC'er isoleret fra n = 3 separate eksperimenter er vist. Påvisningsgrænsen = 0,7 log10 CFUs/IBC. Røde prikker afbildet på påvisningsgrænsen angive prøver som ingen kolonier blev inddrevet. Alle IBC-holdige prøver er ikke signifikant forskellige (p > 0,05, Mann-Whitney test); de ikke-inficerede epitelceller er væsentligt forskellige fra IBC (10 min) data (p < 0,001, Mann-Whitney test). (C) qPCR kvantificering af bakterier på individuelle IBC'er og ikke-inficerede epitelceller efter en 10 min inkubation i 0,1% Triton-X (*, p < 0,0001, Mann-Whitney test, n = 4). Påvisningsgrænsen = 1,18 log10 bakterielle genom ækvivalenter/IBC. Røde prikker angiver prøver som ingen kolonier blev genoprettet på titering i panelet B. (D) kvantificering af 16S rRNA, cyoB, og frdA gener for varierende antal individuelt isoleret og poolet IBC'er (n = 1 eksperiment; hver punkt angiver gennemsnittet af 3 tekniske replikater). NC = ingen DNA negativ kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : En skematisk og dens tilknyttede fotografier repræsenterer isolation af IBC'er via munden micropipetting fra inficerede mus blærer. Denne figur er gengivet fra Duraiswamy et al.18. (A) A høstet hele blæren; (B) et omvendt hele blæren udsætter normal god landbrugspraksis udtrykker IBC'er; (C) et nærbillede af kanten af en skrabet blære viser individuelle IBC'er i suspension i den tilstødende buffer; (D) en enkelt isoleret IBC pipetted ind i et rør. Røde pile i panelet B angiver eksempler på normal god landbrugspraksis-positive IBC'er om det luminale overflade af blæren. Den røde stiplede linje i panelet C angiver den højre kant af inverteret blæren (angivet som "BL"); røde pile i panelet C angiver tilsyneladende individuelle normal god landbrugspraksis-positive epitel celler, der har været skrabes blære overflade. Hvide stiplede linje i panelet D angiver et micropipetted sub-microliter slipværktøj indeholdende en isoleret IBC, der er angivet med en hvid pil. Skalere barer = 2 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den protokol, vi har beskrevet giver til isolering af enkelt IBC'er fra en murine model af UTI. Denne protokol isolerer IBC'er, der indeholder levedygtige intracellulære bakterier, som kan verificeres ved dyrkning for CFU. Protocol resultater i intracellulære bakterier fra IBC'er med lidt forurening af ekstracellulære bakterier, giver mulighed for yderligere karakterisering af både bakterier og vært celle fra et IBC (fig. 4C). Vi viser også, at bakterier fra en enkelt IBC kan bruges i downstream applikationer såsom qPCR (fig. 4C), hvilket tyder på, at vores teknik kan bruges til processen IBC'er for andre in vitro-analyser. Ved at samle de bakterier, der er høstet fra så lidt som 5 IBC'er, viser vi yderligere vores evne til at udføre qRT-PCR analyse på tre bakteriel gener, hvilket tyder på, at god kvalitet RNA kan høstes fra bakterier i vores isolerede IBC'er (figur 4D). Kombineret, tyder de data, vi har vist, på at udføre genome-wide RNA analyse (såsom RNA sekventering) på enkelt IBC'er kan være muligt ved hjælp af denne isolation teknik.

I denne protokol, har vi fokuseret på 6 h tidspunkt, fordi det er når IBC numre toppe i blærer af sort 6 mus inficeret af UTI8927. Desuden har vi også brugt en statisk bakteriekulturen system til at forbedre niveauet for type 1 pilus udtryk i UTI89. Udtryk af typen 1 pilus er kritisk for E. coli tillægger og inficere blæren epitel celler28. Men dette udtryk er stramt reguleret29 og miljømæssige stikord er kendt for at ændre den30. For at opretholde en konsekvent infektion fænotype og tilstrækkeligt antal IBC'er, anbefaler vi at bruge en 2 x 24 h statisk bakteriekulturen (lidt ændret fra Hung et al.8) og 6 h infektion tidspunkt når arbejder med tidligere testet E. coli stammer som NU14 og UTI8928,29. Det er imidlertid muligt, at disse variabler skal justeres i andre UTI stammer eller i andre mus stammer til at opnå den ideelle antal IBC'er fra hver infektion.

Mens protokollen fra Hung et al.8 bruger kun hunmus, har andre etablerede protokoller til oprettelse af urinvejsinfektion hos mandlige mus været rapporteret31. I denne model fulgt blærebetændelse i mandlige mus også IBC pathway. Som blærer af mandlige og kvindelige mus er ens i størrelse, forventer vi, at vores IBC isolation protokol kan anvendes på inficerede mandlige mus samt.

Den relativt simple teknologi udnyttes i denne protokol sikrer også, at det kan installeres i de fleste laboratorier. En af de vigtigste skridt, der er involveret i denne protokol er hale af glas kapillærer til at oprette microcapillaries for at markere den celletype af interesse. Dette trin giver mulighed for fleksibilitet i diameteren af microcapillaries skabt, og dermed metoden kan udvides til at omfatte flere forskellige mål celletyper. På grund af den iboende variation i at skabe disse kapillærer, skal pleje tages til at sikre, at den endelige diameter i en brugsområdet. Hvis kapillærer er for snæver, de undlader at afhente celle af interesse, men hvis de bliver for bredt, flere celler kunne vælges i et enkelt forsøg. Desuden bærer brug af åben ild under processen med kapillar trække en iboende risiko for forbrændinger og brand, så forskeren forsøger at skabe microcapillaries skal sørge for at forhindre sådanne hændelser opstår. For at reducere variabiliteten samt åbne brandrisikoen involveret i at gøre disse kapillærer, forskeren kunne gøre brug af en traditionel mikropipette trække maskine, som dem der bruges til elektrofysiologiske eksperimenter (f.eks. PC-100, Narishige gruppe). Da disse maskiner gøre brug af tyngdekraften eller robot platforme til at trække kapillærerne, de kan skræddersys til at opfylde behovene hos infektion modellen. Den brede vifte af mikropipette trække maskiner tilgængelige vil imidlertid betyde, at den enkelte forsker vil savn hen til efterkontrollere nogle trial and error til at bestemme den passende endelige kapillær diameter til brug med denne protokol.

Den præsenterede protokol gør brug af bakterier giver udtryk for en fluorescerende tag visuelt identificere IBC. Således, denne teknik er begrænset af forskernes evne til genetisk ændre den infektiøse organismer. Specielt for UPEC, er IBC-dannende stammer som CFT073 og NU14 blevet med held omdannet med normal god landbrugspraksis-udtrykker plasmider32,33,34; disse bør derfor være brugbar i den samme protokol. Baseret på området med musen blære (70 mm2)35, længden af individuelle epitelceller (50-120 µm)17og hyppigheden af IBC'er i en enkelt blære16, et konservativt estimat for forekomsten af IBC'er handler om 1 i 1.000 celler (eller 0,1%). Dette skøn montrer nytte af vores celle isolation protokol til at målrette sjældne hændelser. Præcisionen af cellemarkeringen gennem vores protokol og den brede vifte af kapillar diametre, der kan trækkes tyder på, at denne protokol kan bruges til at isolere intracellulære bakterier fra andre in vivo og in vitro-modeller af infektion. Ja, vi har med succes brugt denne teknik til at isolere smittede kulturperler blæren epitel celler (data ikke vist).

En af de mere teknisk udfordrende skridt i protokollen invertere blæren for at udsætte epitelceller for skrabning. Vi har fundet, at det også er muligt at gøre et snit på blæren til splay det for skrabning. Men tiden bør udvises forsigtighed til at reducere skaden epitelceller af blæren under processen med at skære det åbne; ideelt set bør et enkelt snit udnyttes til at splay blære open. Derudover bør cut foretages i kolde PBS, til at forhindre utilsigtet tab af celler eller blæren væv under processen.

Munden Pipettering af IBC'er i denne protokol giver større kontrol over celle udvælgelsesproces, samt begrænse det endelige rumfang af opløsning overføres sammen med cellen. Fin kontrol og stor adskillelse af løsning fra forskernes munden også maksimerer sikkerheden for forskeren, som mængder overført inden for nanoliter til microliter rækkevidde. Vores erfaring med den moderne mikropipette er derimod at det har en tendens til at overføre flere omkringliggende væske og celler med IBC, potentielt fører til forurening med ekstracellulære luminale bakterier. Vores konklusion, at munden pipettering giver en højere ydeevne over andre enkelt celle isolation metoder er også blevet rapporteret af andre labs22,23,24. Bortset fra enkelt celle isolation, er munden pipettering selv blevet brugt i encellede elektroporation for neuroner25, hvilket yderligere viser nytte og minut kontrol, som en uddannet forsker kan nå med teknikken. Men sikkerhed er af største betydning, og vi foreslå mulige yderligere foranstaltninger, der kan træffes afhængigt af patogener bliver brugt: (i) udvidelse af luften buffer mellem forskeren og det biologiske materiale, for eksempel ved hjælp af en sugning pipette med en større volumen (f.eks. 5 mL), eller (ii) tilføjer et fysisk filter som VAT i den aspirating pipette til at fungere som en yderligere barriere.

I tilfælde hvor en vurdering fører til den konklusion, at det stadig er for risikabelt at munden pipettering, kan kommercielt tilgængelige robot opsætninger (som dem der bruges til nanoinjections) kombineres med de andre dele af vores teknik til at give en mere sikker metode til isolere inficerede celler fra blandede befolkninger. Det skal bemærkes, at vores erfaring med at bruge en robot micromanipulator har vist en nedsat sats på IBC isolation i forhold til mund pipettering, som den store intra eksperimentel variation i blæren epitelcelle størrelse gør det udfordrende for brugeren af en robotarm til at bestemme den kraft, der kræves for at afhente enkelt IBC'er. Det er imidlertid stadig en levedygtig, men dyrere, mulighed for dem, der arbejder med meget smitsomme agenser af sygdom.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Danmarks Grundforskningsfond, premierministerens kontor, Singapore, under sin NRF Research Fellowship ordning (NRF indgå nr. NRF-RF2010-10); Singapore Ministry of Healths nationale medicinske Forskningsråd (NMRC/CIRG/1358/2013); og Genome Institute of Singapore (GIS) / agentur for videnskab, teknologi og forskning (A * stjerne).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL eppendorf tube For static bacterial culture and OD measurement
100% ethanol For Alcohol Burner
15 mL conical tube For static bacterial culture and OD measurement
1 mL Tuberculin Syringe BD Biosciences  302100
3% Bacterial Agar For static bacterial culture and OD measurement
70% ethanol For static bacterial culture and OD measurement
Aesculap anatomic forceps Braun/Kruuse BD222R For initial dissection of mouse (skin, fascia)
Alcohol Burner Wheaton 237070
Aspirating pipette BD Biosciences  357558
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177
Bacterial loops For static bacterial culture and OD measurement
Benchtop centrifuge Eppendorf 5424 Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes
Conical flasks For static bacterial culture and OD measurement
Digital camera for microscope Olympus DP71 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Glass Capillaries Kimax 6148K07
Iris Scissors STR SS 110MM Braun BC110R
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein Animal Health 29405
Kanamycin Sulfate Calbiochem 420311 For static bacterial culture and OD measurement
LB broth (Miller) Thermo/Gibco 10855021 For static bacterial culture and OD measurement
Light source unit for microscope Olympus LG-PS2 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Lubricant  KY Any similar commercial medical lubricant will suffice
Macro fluorescence microscope Olympus MVX10 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Micropipette + micropipette tips For static bacterial culture and OD measurement
PBS 1x For static bacterial culture and OD measurement
Pipette controller + Pipettes For static bacterial culture and OD measurement
Polyethylene Tubing BD Intramedic 427401
Precision Glide needle 30 G BD Biosciences  305107 Possibly under new catalogue number (305106)
Splinter forceps curved Braun BD312R
Spray bottle (for ethanol) For static bacterial culture and OD measurement
Square cuvettes Elkay 127-1010-400 For static bacterial culture and OD measurement
Sterilgard III Advance Safety Cabinet Baker SG403 Any biosafety cabinet with a UV irridiator
Sterilin 90mm Standard Petri Dish Thermo 101VR20 Any sterile petri dish
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm Braun OK366R Recommended for harvesting of bladder
Surgical Scissors STR S/B 105MM Braun BC320R
Tabletop Centrifuge Eppendorf 5810R Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals
WPA C08000 cell density meter Biowave (Biochrom) 80-3000-45 For static bacterial culture and OD measurement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  2. Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).
  3. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).
  4. Foxman, B., Barlow, R., D'Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs. Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).
  5. Zowawi, H. M., et al. The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology. Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).
  6. Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections. Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).
  7. Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract. Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).
  8. Hung, C. -S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).
  9. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science Translational Medicine. , (2011).
  10. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. PLoS Pathogens. , (2009).
  11. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).
  12. Hunstad, D. A., Justice, S. S. Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli. Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).
  13. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Medicine. , (2007).
  14. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  15. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  16. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection. Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).
  17. Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal). International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).
  18. Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir. Infection and Immunity. , (2018).
  19. Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).
  20. Tang, F., et al. Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres. PLoS One. , (2011).
  21. Wells, J. M., Melton, D. A. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development. 127, 1563-1572 (2000).
  22. Guo, H., et al. Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing. Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).
  23. Zhao, R., et al. The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
  24. Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).
  25. Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2017).
  26. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), 52892 (2015).
  27. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
  28. Mulvey, M. A., et al. Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli. Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).
  29. Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).
  30. Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media. Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).
  31. Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).
  32. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  33. Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli. Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).
  34. Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073. Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).
  35. Jost, S. P. Postnatal growth of the mouse bladder. Journal of Anatomy. 143, 39-43 (1985).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 146 urinvejsinfektion encellede isolation intracellulære bakterielle samfund uropathogenic Escherichia coli murine UTI
Isolering af enkelt intracellulære bakterielle samfund genereret fra en Murine Model af urinvejsinfektion for Downstream encellede analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, E., Chee, J. L. Y.,… More

Yang, E., Chee, J. L. Y., Duraiswamy, S., Chen, S., Lees, K., Chen, S. L. Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis. J. Vis. Exp. (146), e58829, doi:10.3791/58829 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter