Summary
Det här protokollet beskriver en enkel metod att isolera enstaka, infekterade-urinblåsan epitelceller från en murin modell av urinvägsinfektion.
Abstract
I den här artikeln beskriver vi ett förfarande som används för att isolera enskilda intracellulära bakteriella samhällen från en mus som har infekterats experimentellt i urinvägarna. Protokollet kan delas in i tre delar: den infektion, urinblåsan epitelial cellen skörd och mun micropipetting att isolera enskilda infekterade epitelceller. Isolerade epitelial cellen innehåller livskraftiga bakterieceller och är nästan gratis av kontaminerande extracellulära bakterier, vilket gör den idealisk för nedströms encelliga analys. Tiden från början av infektion för att erhålla en enda intracellulära bakteriella gemenskapen är ca 8 h. Detta protokoll är billig att distribuera och använder allmänt tillgängliga material och vi räknar med att det också kan användas i andra infektion modeller att isolera enstaka infekterade celler från cell blandningar, även om dessa infekterade celler är sällsynta. Dock på grund av en potentiell risk i mun micropipetting rekommenderas proceduren inte för mycket smittämnen.
Introduction
Urinvägsinfektioner (UVI) är en av de vanligaste bakteriella infektionerna. Uppskattningsvis 40-50% av kvinnor förväntas uppleva minst en urinvägsinfektion (UVI) under sin livstid1. En av de viktigaste medlen av UTI är uropathogenic E. coli (UPEC), som står för över 70% av okomplicerad UVI2. Cirka en fjärdedel av dem som har en UVI har dessutom en återkommande infektion, ofta orsakas av samma stam, trots lämplig antibiotikabehandling3. Den höga förekomsten av UTI representerar en betydande börda för hälso-och sjukvårdssystem, kostar mer än $2 miljarder per år i USA4. Dessutom leder användningen av antibiotika för att behandla UVI också till ökande antibiotikaresistens priser, vilket är en större folkhälsa oro5.
Därför har en stor ansträngning placerats i förstå de mekanismer genom vilka UPEC infekterar urinvägarna, samt dess förmåga att orsaka återkommande infektioner6,7,8. Särskilt har en musmodell av infektion använts för att undersöka bakteriell och värd egenskaper som bidrar till UTI8. Denna musmodell har fördelen att vara tillämpliga på oförändrad klinisk stammar som isolerats från mänskliga patienter. Denna modell har också lett till upptäckten av potentiellt druggable bakteriell vägar viktigt för inrättandet av UVI, såsom Typ1 pilus9 och järn förvärv system10.
Jämfört med dessa framgångar i att studera tidiga händelser i UTI, saknas kunskap om mekanismerna bakom återkommande UVI fortfarande11. En hypotes är att UPEC undviker antibiotikabehandling och orsakar återkommande infektioner i urinblåsan genom att bilda intracellulära bakteriella samhällen (IBC) inom urinblåsan epitelceller. IBCer har upptäckts både i murina modeller av infektion och i mänskliga UTI patienter12,13. Förekomsten av IBCer i urinprov från pediatric UTI patienter har associerats med högre andelen återkommande14,15. Dock har isolera IBCer och studera bakterierna inom dem visat sig vara tekniskt utmanande på grund av deras raritet; Det uppskattas att en infekterad murina urinblåsan vanligtvis bara har 10-100 IBCer16. Dessutom urinblåsan epitelceller är relativt stora (50-120 µm)17, vilket gör det svårt för att distribuera fluorescens assisterad cell sortering (FACS) med tanke på att typiska FACS munstycken är utformade med diametrar av 70 µm eller 100 µm. Celler som är lika stor som urinblåsan epitelceller är således ofta bort genom filtrering före FACS att undvika igensättning av flödesteknik.
Vårt labb nyligen beskrivit en allmän och ekonomisk metod för att isolera sällsynta infekterade celler från blandningar såsom skrapade epitelceller av urinblåsan18. För att effektivt isolera IBCer, använde vi traditionella mun pipettering. Mun micropipetting är en teknik som har länge använts för mikromanipulation av enstaka celler och embryon för efterföljande analys19,20,21,22,23, 24 , 25. traditionell mun pipettering av stora flytande volymer (i milliliter) har ofta varit orsaken till laboratoriet relaterade olyckor, och tekniken har med rätta varit skys av mycket av forskarvärlden utanför traditionella embryologi och enstaka cell program. Våra protokoll är inspirerad av de enda cell versioner av denna teknik19,20, vilket minska risken genom att tillhandahålla en stor buffert (> 2 mL) av luft mellan forskaren och prov jämfört vätskevolym överfört (< 1 ΜL). Denna metod också drar nytta av den fina kontrollen som mun micropipetting ger, som översätter till en låg slutlig volym av omgivande lösningen överförs och hög renhet av isolerade celler. Tekniken använder billig material (< 50$), och bör därför vara möjligt att genomföra i alla övningar.
Denna visuella protokollet beskriver våra IBC isolering teknik, som tillhandahåller en referens för att hjälpa andra forskare som försöker replikera denna teknik. Forskaren behöver tillgång till en fluorescerande dissekera Mikroskop (eller liknande utrustning) som kan användas för att visualisera enskilda epitelceller och fluorescerande bakterier under levande imaging, med en öppen och tillgänglig imaging scen för micropipetting (se Tabell av material för detaljerna i mikroskopet används, även om andra motsvarande instrument modeller kan också användas). Medan detta protokoll kommer att fokusera på IBCer i en murin modell av UVI, bör liknande metoder gälla att isolera infekterade celler från cellsuspensioner i andra modeller av infektion.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här angående djurhantering har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Genome Institute i Singapore och biologiska Resurscenter för byrån för vetenskap, teknologi och forskning, Singapore.
1. mus infektion
-
Beredning av glas kapillärer
- Ljuskälla en öppen låga (Bunsenbrännare eller spritbrännaren).
- Håll ett glas kapillär med två händer genom att nypa fast båda ändarna och sedan värma mitten av röret jämnt tills glaset går mjukt. Rotera kapillären försiktigt fram och tillbaka längs dess axel till stöd i jämn uppvärmning av glaset.
- Ta bort glas kapillären från värmekällan och omedelbart dra händerna isär, bibehållen grepp på båda ändarna av röret. Drog kapillären idealisk slutliga längd är 3-5 cm längre än en unpulled capillary att säkerställa en lämplig inre diameter för att isolera enstaka urinblåsan epitelceller.
Varning: Slangen är fortfarande extremt varmt under en tid, så avsätta kapillären på en värme-säker yta i några minuter för att svalna innan du fortsätter till nästa steg. - Kontrollera för att se om mitten av glas kapillären har blivit ihåliga smalare (figur 1A) och att insidan av röret fortfarande (figur 1B). För isolering av IBCer är en bore storlek 200-400 µm användbara.
- Plocka upp ena ände de drog kapillären med ena handen. Håll ett par pincett med den andra handen och använda den för att plocka upp dragna glaset kapillär på smalast. Säkerställa att tången är utövas med tillräcklig kraft att greppa kapillären ordentligt utan att krossa den.
- Använd en snabb vridande rörelse av handen som håller tången för att knäppa drog kapillären i den smalaste punkten skapa en mun micropipetting kapillär.
Obs: Använda fingrarna istället för tången är också acceptabla, så länge tillräckligt skydd från glas skärvor används. - Upprepa steg 1.1.2-1.1.6 minst 4 x mer att producera tillräckligt reservdelar micropipetting kapillärer och erbjuda ett utbud av diametrar för IBC isolering. Om mer än en infektion grupp förväntas förbereda 5 ytterligare micropipetting kapillärer för varje ytterligare infektion.
Varning: Glöm inte att stänga av den öppna elden. - Placera drog kapillärerna i ett 100 mm petriskål och exponera skålen för UV-strålning för 30 min att sterilisera kapillärerna.
- Sätt tillbaka locket på petriskål efter UV sterilisering och lagra petriskål med kapillärerna i rumstemperatur.
-
Beredning av katetrar före infektion
- Förbereda urin katetrar för infektion som beskrivs i Hung et al.8 och Conover et al.26 minst en dag innan infektion.
-
Beredning av fluorescerande uropathogenic E. coli kultur
- Växa de valda fluorophore-uttryckande uropathogenic bakteriell stam enligt fastställda protokoll.
Obs: Val av stam och fluorophore beror till stor del på mikroskopet och stammar tillgängliga i enskilda laboratorier. I detta exempel använder vi en stam som härrör från UTI89, vilket är en kliniska isolat ursprungligen från en patient med recidiverande cystit. Denna stam, SLC-638, bär en plasmid (pSLC-77) som uttrycker både vsfGFP-9 och kanamycin motstånd18. SLC-638 odlas i LB buljong vid 37 ° C kompletteras med 50 µg/mL kanamycin. - Strimma stam SLC-638 på en Luria Bertani (LB)-agarplatta kompletteras med 50 µg/mL kanamycin. Inkubera plattan vid 37 ° C över natten.
- (Valfritt) Visa plattan på mikroskopet dissekera bekräfta uttrycket av fluorescerande markörer innan du väljer en koloni.
- Använda en bakteriell inympning loop, överföra den valda kolonin till en 125 mL konisk kolv med 10 mL LB buljong kompletteras med 50 µg/mL kanamycin. Inkubera kolven statiskt vid 37 ° C under 24 h.
- Subkultur bakterierna från denna kolven genom att ta 10 µL av kultur från kolven och späda ut den i 10 mL LB buljong kompletteras med 50 µg/mL kanamycin i en färsk 125 mL mätkolv (en 1: 1000 utspädning). Inkubera denna andra kolv statiskt vid 37 ° C för en annan 24 h.
- Snurra ner den bakteriella kulturen för 5 min på 5 000 x g och 4 ° C.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera bakteriell pelleten i kalla PBS på OD600 0,5.
Obs: Även om det kan variera från kultur till kultur, vanligtvis 1 mL av statisk kultur ger ca 4-5 mL OD600 = 0,5 bakterieodling. Den totala volymen av bakteriell inokulatet behövs för varje stam kan beräknas enligt följande: 50 µL krävs för varje mus och 50 µL behövs för att fylla nålen huvudet. Ytterligare 10-20% (minst 50 µL) av inokulatet rekommenderas att redovisa dödvolym i sprutan. - Använd resterande bakteriell blandningen för att bestämma titern infektion som beskrivs i Hung et al.8.
Obs: Detta steg kan fördröjas i några timmar genom att lagra bakteriell blandningen vid 4 ° C.
- Växa de valda fluorophore-uttryckande uropathogenic bakteriell stam enligt fastställda protokoll.
-
Murina modell av urinvägsinfektion
- Infektera möss som beskrivs av Hung et al.8, med en experimentell grupp för varje stam av fluorescerande E. coli odlade i avsnitt 1.3.
Obs: Se även Conover et al.26 för visuell hjälp. - Notera tid av bakteriell inympningen för musen eller bur.
- Upprepa infektioner för hela experimentella gruppen.
Obs: Infektion katetern får återanvändas för alla möss i samma grupp. - Upprepa steg 1.4.1-1.4.3 för varje experimentella gruppen planerade, säkerställa att en ny kateter och nya smörjmedel gel är redo för varje grupp.
Obs: För experiment med ett stort antal djur, är det bäst att dela upp djuren i grupper om fem och svindlande infektioner så att varje grupp är infekterade ca 30 min till 1 h apart. Detta kommer att ge tillräckligt med tid för följande (avsnitt 2 och 3).
- Infektera möss som beskrivs av Hung et al.8, med en experimentell grupp för varje stam av fluorescerande E. coli odlade i avsnitt 1.3.
2. urinblåsa epitelial cellen skörd för att erhålla en cellsuspension
-
Skörd och Invertera murina blåsor
- Förbered tre 50 mL koniska rör fyllda med 45 mL 70% etanol för sterilisering kirurgisk utrustning.
- I två av rören bereddes i steg 2.1.1, placera ett par sax och ett par pincett varje. Placera två par pincett (en helst smalare och med en rundad spets, för inversionen av urinblåsan) i tredje röret.
Obs: Verktygen i första röret kommer att användas på externa regionen, verktygen i andra kommer att användas i urinblåsan skörd och tången i sista röret kommer två par används i urinblåsan inversion. - På 6 h efter infektion, eutanasi infekterade möss enligt institutets etablerade IACUC protokoll.
Obs: Vårt IACUC protokoll efterlyser dödshjälp via cervikal Dislokation utförs medan musen är under narkos (isofluran). - Lägg djuren platt på ryggen och använda en sprayflaska fylld med 70% etanol för att sterilisera sin buken.
- Använder ett par pincett och kirurgiska saxar från första röret (bereddes i steg 2.1.2), öppning gör ett litet tvärgående snitt på huden ca 1 cm ovanför den urinrörets. Expandera snitt diagonalt mot armar av musen, skapa en V-formad skära längs hela främre av musen som exponerar innehållet i bukhinnan. Se till att under denna process, inte skär saxen genom tarmen av musen (figur 2A, B).
- Växla till den andra uppsättningen av verktyg (bereddes i steg 2.1.2). Med blad av saxen eller axlarna av tången, tryck försiktigt på fett kuddar nära bäckenregionen av musen.
Obs: Detta steg orsakar blåsan att sticka ut utåt och garanterar synlighet för skörd. - Grepp exponerade urinblåsan vid spetsen med ett par pincett (figur 2C).
- Att hålla ett fast grepp på urinblåsan apexen med tången, skära och gratis urinblåsan från resten av djuret (skära urinröret och urinledare bort) med kirurgisk sax. Inte släppa tången hålla urinblåsan ännu.
- Byte från saxen till smalare rundade tången från den tredje koniska rör (från steg 2.1.2), infoga spetsen på en axel av rundade tången i urinblåsan där den sänktes bara i föregående steg (figur 2D) öppning. Med spetsen på rundade tången säkert infogas i öppnandet av urinblåsan, släpp para av tången gripande apexen av urinblåsan och returnera den till det andra koniska röret.
- Använder det andra paret av tången från tredje röret, försiktigt slå blåsan ”inside out”, först dra utsidan slutet av mynningen av urinblåsan från rundade tången (pil 1,figur 2D) och vägleda det runt och över den andra spetsen av rundade tången (figur 2D, pil 2).
Obs: Åtgärden kan liknas vid att ta bort en strumpa från ena foten och dra den över den andra.- Under inversion processen, upprätthålla den första runda par pincett nästan helt stängd. Detta ger tillräcklig rörelsefrihet att dra urinblåsan bort från första axeln av rundade tången, men också ger andra axeln av rundade tången närmare till först och för urinblåsan att överföras enkelt. Slutresultatet av detta steg är att urinblåsan bör sluta upp att vara inverterad och på spetsen på den andra axeln i det första paret pincett (figur 2E).
- Använder det andra paret av tången, försiktigt lirka inverterad blåsan av spetsen på tången in 1 mL kall PBS.
Obs: (Valfritt) Detta är det lägligt att ta bilder av hela inverterad, infekterade blåsan att iaktta de allmänna frekvens och distribution av IBCer, om någon.
- Upprepa steg 2.1.1-2.1.10 för varje blåsa i den experimentella gruppen (till högst fem djur).
-
Urinblåsan epitelial cell skrapning
- Med hjälp av två ren par pincett, skrapa försiktigt utsidan av inverterad blåsan (som är den interna epiteliala cell-lagret). Den omgivande PBS ska visas grumligare som skrapning vinning och epitelceller släpps ut i PBS lösningen.
- (Valfritt) Visuellt bekräfta att den blåsan skrapning har släppt celler till lösning med dissekera Mikroskop. Figur 3 ” A, B). PBS bör vara grumliga för blotta ögat, och skrapade enskilda urinblåsan epitelceller kan ses vid 10 x förstoring.
- Upprepa steg 2.2.1-2.2.2 för varje skördade urinblåsan från steg 2.1.
3. intracellulära bakteriella gemenskapen (IBC) isolering: mun pipettering av IBCer
Obs: Alla metoder som beskrivs i detta avsnitt har genomgått en institutionell riskbedömning. Munnen pipettering medför en inneboende risk för intag av lösningen som överförs. Denna risk mildras till stor del av de nliter volymer där detta protokoll, och vi rekommenderar att alla användare av protokoll betala hänsyn till försiktighetsprincipen och praxis anteckningar som anges här och i diskussionen.
-
Efter cellerna har skrapats i PBS, sätt upp munnen micropipetting utrustningen (figur 3C).
- Sätt den tjockare änden av dragna glaset kapillär (unpulled slutet) i gummiproppen (vit slutet) av sugenheten röret.
- Infoga den smala änden av en 1 mL pipettspetsen i andra öppna (röd) ände hygienfilter röret, säkerställa att det finns en tight passform.
- Anslut den smala änden av en 2 mL aspirera pipett i öppen, bredare änden av 1 mL pipettspetsen, igen som det säkerställer en åtsittande passform.
Obs: Den resulterande inställningen kan forskaren mun pipett från bredare, öppen ände utvärderingsenheten pipetten att skapa en skonsam sugstyrka från den smala änden av kapillärröret i andra änden av apparaten. - Testa den slutliga mun micropipetting apparater använder en 100 mm petriskål som innehåller avjoniserat vatten. En liten sug åtgärd på den öppna änden av utvärderingsenheten pipetten (liknar smuttar på en dryck genom ett sugrör) bör öka nivån av vätska i kapillären, men inte orsaka avjoniserat vatten att svämma över i sugenheten röret. Använda en hand för att styra kapillärröret, medan du använder å andra sidan för att justera positionen för petriskål.
Obs: Styrkan i sug krävs för mun-pipettering en enda IBC varierar bland forskare. Det rekommenderas dock att varje forskare försöker denna teknik börjar med en svag sug och långsamt öka det om ingen vätska rinner upp kapillären. Det finns inget behov av en kraft större än suger på ett sugrör för att dricka. Om kapillären inte verkar vara plocka upp vätska under testet i steg 3.1.4, är det möjligt att antingen kapillären eller sug röret är ockluderas och behöver bytas. Det rekommenderas dessutom att alla nya forskare första praktiken styra sug i munnen pipettering apparaten med steriliserat vatten. Observera att kontrollen av den volym som upptas av munnen pipettering apparaten är genom användning av forskarens tungan. Tungan kan fint justera styrkan på sug som tillämpas, samt fungera som en nödstoppsknapp. - Efter att uppnå framgångsrika upptag av vätska, testa förmågan att utvisa det från kapillären genom att försiktigt blåsa i den öppna änden av utvärderingsenheten pipetten. Se till att inga bubblor skapas i färd med att utvisa vätskan för att förhindra kontaminering av IBCer under steg 3.5.
Obs: Som med sug varierar styrkan i positiva påtryckningar av forskaren att utvisa IBC i centrifugröret bland forskare. Det rekommenderas för forskare nya till detta protokoll till praktiken steg 3.1 några dagar innan själva infektionen. Ett förslag för praktiserande mun micropipetting är att öva överföra små volymer av steriliserat vatten blandat med några droppar livsmedelsfärgämne (för synlighet) med användning av munnen mikropipett utrustning.
- Placera den skrapade cellsuspensionen under mikroskopet dissekera och identifiera IBCer som stora fluorescerande aggregat (figur 3A, B). Den idealiska förstoringen är 20-40 x. Doppa i fina slutet av glaset kapillär i en färsk tub av PBS för 1 s att minska upptaget av oönskade volymen via kapillärkraft.
- Tittar genom mikroskopet, identifiera IBC av intresse och långsamt föra den öppna änden av kapillär röret mot IBC. Använd fina slutet av glaset kapillär för att sopa undan extra celler nära varje IBC att förhindra aspiration av två eller flera celler, eller att bryta isär större aggregat av celler.
- Medan du tittar genom mikroskopet, applicera en mycket liten sugstyrka på den bortre änden (utvärderingsenheten pipett) av mun micropipetting apparaten att styra IBC i glas kapillären.
- Efter att plocka upp IBC, flytta kapillären till en tom 1,5 mL centrifugrör och en liten positiv tryck att utvisa droplet-programmet och IBC i centrifugeringsröret (figur 3D).
- Upprepa steg 3,3-3,6 på eftersom många IBCer behövs från nuvarande blåsan, innan du fortsätter till nästa urinblåsan. Ändra utvärderingsenheten pipetter och kapillärer ofta för att förhindra ansamling av saliv.
Varning: Vid arbete med infektiösa (eller kliniska) stammar av bakterier, ständigt övervaka nivån av lösning i kapillären. Låt inte nivån av vätska som för spill från kanten av kapillären i sugenheten röret. Om detta inträffar omedelbart byta till en annan hygienfilter tube och kassera den tidigare uppsättningen upp. - Upprepa steg 3,2-3,6 på alla skördade blåsor, eller tills tillräckligt antal biologiska prover har samlats för den experimentella gruppen.
- (Valfritt) Upprepa steg 3.6 och 3.7 tills alla experimentella grupper (eller möss) har varit euthanized och tillräcklig biologiska prover har skördats från varje grupp.
Representative Results
Frånsett bekräftelse (figur 3D) förekomsten av en enda isolerad IBC i samling röret via mikroskopet dissekera, kan renheten av den isolerade IBC också bekräftas av konfokalmikroskopi. Som visas i figur 4A, isolerade celler bör fläcken för både E. coli och uroplakin, och är den beräknade storleken för IBCer (50-120 µm)17. Dessutom är E. coli färgning inte närvarande i den omgivande vätskan. Baserat på våra data, är mer än 90% av celler isolerade med denna teknik IBCer18. Efter isolering, kan den närvaro och genomförbarheten av bakteriecellerna i enskilda IBC bekräftas genom kolonin bildar enheten (CFU) uppräkning (figur 4B) eller kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR) för genomisk medel ( Figur 4 C). figur 4C visar också att oinfekterade epitelceller isolerad med samma protokoll inte har mätbara mängder bakterier. Baserat på dessa data, uppskattar vi att det utbud av CFUs i en enda IBC är 102-103 i murina modellen av urinvägsinfektion. En av de viktigaste målen för enda IBC isolering är att utföra efterföljande analyser såsom RNA-sekvensering. Verifiera att vår isolering metod är kunna erhålla RNA från bakterier i IBCer för analys, vi utfört kvantitativa omvänd transkription polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR) kvantifiering av tre gener (16S, cyoB, och frdA) för en utbud av individuellt isolerade och poolade IBCer (figur 4D). Alla data visas i figur 4 har anpassats med tillstånd från Duraiswamy et al.18. En översikt Schematisk bild av våra IBC isolering protokoll kan ses i figur 5, som reproduceras från Duraiswamy et al.18.
Figur 1 : Hand dras kapillärer behålla smala öppningar. (A) prover av hand dras kapillärrör visas på en svart bakgrund för kontrast. Från botten till toppen, en unpulled kapillär, en kapillär som inte drogs i tillräcklig utsträckning, visas en kapillär som kan användas för enkel urinblåsan epitelial cellen skörd och en kapillär som drogs för tunt (och således separerade i två bitar). En 15 cm linjal är placerad längst ned i bilden för skala. Den beräknade punkten för knäppa av användbara kapillären indikeras på siffran av den röda pilen. (B) bild tagen med dissekera Mikroskop bekräftar ihåliga innerdiameter av en drog kapillär (nederst). En unpulled capillary är placerad ovanför för att demonstrera relativa storlek skillnaden av två kapillärerna. Skalstapeln = 4,0 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Dissekering av musen att skörda urinblåsan epitelceller. (A) en bild av en mus med vita linjer till ange ungefärlig plats och vinkel av snitt att exponera de murina bukhålan och urinblåsan. (B) en bild av de exponerade mus bukhålan efter snittet. (C), en bild av de exponerade urinblåsan (röd pil) sticker ut mellan de fett kuddar. (D), en bild av murina blåsan med spetsen på tången in i lumen, med pilar som visar riktningen av vinkar för att Invertera blåsan. Blåsan dras först något utåt, sedan runt och utanför det första skaftet av tången. Riktningarna av motion för både åtgärder är indikerat av vita pilarna numrerade 1 och 2. (E) en bild som visar den slutliga ståndpunkten av inverterad urinblåsan insatt på andra axeln av tången. Skaft av tången är märkta i båda panelerna D och E med röda pilar och text. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : IBC skörd från urinblåsan celler. (A) en infekterad och inverterad blåsa i kall PBS lösning före cellen skrapning. (B) en bild som visar skrapade urinblåsan celler som kan ses i Mikroskop. IBCer kan identifieras som stora grön fluorescerande aggregat i båda bilderna (se Röda pilar). (C) en bild den fullbordade mun micropipetting apparater. Utvärderingsenheten pipett, pipettspetsen, rökrörs röret, och drog kapillärrör identifieras med numrerade pilar som anges till höger. (D) en bild av en enda isolerad IBC inom ett 1,5 mL collection tube (rödmarkerade). Skala barer (som anges) representeras av vita linjer i paneler A, B och D. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Skördade IBCer är ren och kan användas för efterföljande analys. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Duraiswamy et al18. (A) bilder av två isolerade GFP-positiva celler som var fläckade av anti-uroplakin och anti -E.coli antikroppar. Den första cellen (IBC 1) har bilder av enskilda kanaler (på låg-förstoring) till vänster, och en hög förstoring sammanslagna bilden är till höger. Den andra cellen (IBC 2) visas i hög förstoring i sammanslagna och enskilda kanaler. Skala barer är indikerat. DNA är målat med 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) och representerade i den blå kanalen. Anti -E. coli är målat med en sekundär antikropp konjugerat med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) och representerade i den gröna kanalen. Anti-uroplakin är målat med en sekundär antikropp konjugerat till tetrametylrodamin fluoresceinisothiocyanat (TRITC) och representerade i den röda kanalen. (B) bakteriell CFUs från isolerade IBCer. IBCer var behandlas omedelbart, eller inkuberas i 0,1% Triton-X för 10 eller 30 min. poolade CFU räkningarna av enskilda IBCer isolerade från n = 3 separata experiment visas. Detektionsgränsen = 0.7 log10 CFUs/IBC. Röda prickar plottas på detektionsgränsen visar prover som återfanns inga kolonier. Alla IBC-innehållande prover är inte signifikant (p > 0,05, Mann-Whitney test); oinfekterade epitelceller skiljer sig avsevärt från IBC (10 min) data (p < 0,001, Mann-Whitney test). (C) qPCR kvantifiering av bakterier på enskilda IBCer och oinfekterade epitelceller efter en 10 min inkubation i 0,1% Triton-X (*, p < 0,0001, Mann-Whitney test, n = 4). Detektionsgränsen = 1,18 log10 bakteriella genomet medel/IBC. Röda prickar visar prover som återfanns inga kolonier på patientserumprov i panelen B. (D) kvantifiering av 16S rRNA, cyoB, och frdA gener för olika antal individuellt isolerade och poolade IBCer (n = 1 experiment; varje punkten anger medelvärdet av 3 tekniska replikat). NC = ingen DNA negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : En schematisk och dess associerade fotografier som representerar isolering av IBCer via munnen micropipetting från infekterade möss urinblåsor. Denna siffra är Reproducerad från Duraiswamy et al.18. (A) A skördas hela urinblåsan; (B) en inverterad hela urinblåsan utsätta den GFP uttrycker IBCer; (C), en närbild på kanten av en skrapade urinblåsan visar enskilda IBCer i suspension i intilliggande bufferten; (D) en enda isolerad IBC pipetteras i ett rör. Röda pilar i panel B visar exempel på GFP-positiv IBCer på luminala ytan av blåsan. Den röda streckade linjen i panel C indikerar den högra kantlinjen i inverterad urinblåsan (anges som ”BL”); Röda pilar i panel C visar uppenbara individuella GFP-positiv epitelceller som har skrapats bort urinblåsan ytan. Vita streckade linjen i panelen D anger en micropipetted sub-mikroliter droplet som innehåller en isolerad IBC, vilket indikeras av en vit pil. Skala barer = 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Protokollet har vi beskrivit tillåter för isolering av enda IBCer från en murin modell av UVI. Detta protokoll isolerar IBCer innehållande livskraftig intracellulära bakterier, som kan verifieras genom odling för CFU. Protokoll resultaten i intracellulära bakterier från IBCer med lilla kontaminering av extracellulära bakterier, vilket möjliggör ytterligare karakterisering av både bakterier och värd cell från en IBC (figur 4C). Vi visar också att bakterierna från en enda IBC kan användas i efterföljande led applikationer såsom qPCR (figur 4C), tyder på att vår teknik kan användas till process IBCer för andra in vitro-analyser. Genom att samla de bakterier som skördas från så få som 5 IBCer, visar vi ytterligare vår förmåga att utföra qRT-PCR-analys på tre bakteriella gener, vilket tyder på att bra kvalitet RNA kan skördas från bakterier i våra isolerade IBCer (figur 4D). Kombinerat, ange data vi har visat att utföra genome-wide RNA analys (till exempel RNA-sekvensering) på enda IBCer kan vara möjligt med denna isolering teknik.
I detta protokoll, har vi fokuserat på 6 h tid-punkten för det är när IBC nummer topp i blåsorna av svart 6 möss som infekterats av UTI8927. Dessutom har vi också använt ett statiskt bakterieodling system för att förbättra nivån på typ 1 pilus uttryck i UTI89. Uttrycket av typ 1 pilus är kritisk för E. coli att fästa och infektera urinblåsan epitelceller28. Men detta uttryck är hårt reglerade29 och miljömässiga ledtrådar är kända för att påverka det30. För att upprätthålla en konsekvent infektion fenotyp och tillräckligt antal IBCer, rekommenderar vi att du använder en statisk bakterieodling från 2 x 24 h (något modifierad från Hung et al.8) och 6 h infektion tidpunkten när arbetar med tidigare testade E. coli stammar såsom NU14 och UTI8928,29. Det är dock möjligt att dessa variabler kommer att behöva justeras i andra UTI stammar eller andra möss stammar att få det perfekt antalet IBCer från varje infektion.
I protokollet från Hung et al.8 används endast honmöss, varit andra etablerade protokoll för fastställande av urinvägsinfektion hos hanmöss rapporterade31. I denna modell följde cystit hos hanmöss också den IBC-vägen. Eftersom blåsorna av manliga och kvinnliga möss är lika i storlek, räknar vi med att våra IBC isolering protokoll kan användas på infekterade manliga möss också.
Den relativt enkla teknik som utnyttjas i detta protokoll garanterar också att det kan användas på de flesta laboratorier. En av de viktigaste stegen som är inblandade i detta protokoll är att dra av glas kapillärer att skapa microcapillaries för att välja celltyp av av intresse. Detta steg ger flexibilitet i diametrarna av microcapillaries skapade, och således metoden kan utökas till flera olika mål celltyper. Dock på grund av den inneboende variationen att skapa dessa kapillärer, måste försiktighet iakttas för att säkerställa att den slutliga diametern är i ett användbart utbud. Om kapillärerna är för snävt, de misslyckas med att plocka upp cellen av intresse, men om de är gjorda för breda, flera celler kan väljas i ett försök. Användning av öppen eld under processen för kapillär dra bär dessutom en inneboende risk för brännskador och brand, så att forskaren försöker skapa microcapillaries bör ta hand att förhindra att sådana händelser inträffar. För att minska variationen samt öppna brandrisken inblandade i att göra dessa kapillärer, forskaren kan göra användningen av en traditionell mikropipett dra maskinen, som används för elektrofysiologiska experiment (t.ex. PC-100, Narishige-gruppen). Eftersom dessa maskiner gör användning av antingen gravitation eller robotliknande plattformar för att dra kapillärerna, de kan skräddarsys för att möta behoven hos den infektion modellen. Men, det breda utbudet av mikropipett dra maskiner tillgängliga kommer att innebära att den enskilda forskaren kommer att behöva gå igenom några försök och misstag att fastställa lämpliga slutliga kapillär diameter för användning med detta protokoll.
Presenterade protokollet utnyttjar bakterier att uttrycka en fluorescerande tagg att visuellt identifiera IBC. Således, denna teknik är begränsad av forskarnas förmåga att genetiskt modifiera den infektiösa organismen. Specifikt för UPEC, har IBC-bilda stammar såsom CFT073 och NU14 framgångsrikt transformerats med GFP-uttryckande plasmider32,33,34. Därför bör dessa användas i samma protokoll. Baserat på området av mus urinblåsan (70 mm2)35, längden på enskilda epitelceller (50-120 µm)17och frekvensen av IBC-behållare i en enda urinblåsan16, en konservativ uppskattning för incidensen av IBCer handlar om 1 av 1 000 celler (eller 0,1%). Denna uppskattning visar upp verktyget i vår cell isolering protokoll att rikta sällsynta händelser. Precisionen i cellmarkeringen genom våra protokoll och det breda utbudet av kapillär diametrar som kan dras tyder på att detta protokoll kan användas för att isolera intracellulära bakterier från andra in vivo och in vitro-modeller av infektion. Ja, vi har framgångsrikt använt denna teknik för att isolera smittade odlade urinblåsan epitelceller (inga data anges).
En av de mer tekniskt utmanande steg i protokollet Invertera urinblåsan för att exponera epitelceller för skrapning. Vi har funnit att det också är möjligt att göra ett snitt på urinblåsan att splay det för skrapning. Emellertid tack vård bör vidtas för att minska skador till epitelcellerna i urinblåsan under processen med att skära den öppen; helst bör en enda klippa utnyttjas för att splay urinblåsan öppna. Dessutom bör snittet göras i kalla PBS, att förhindra oavsiktlig förlust av celler eller urinblåsan vävnad under processen.
Munnen pipettering av IBCer i detta protokoll ger större kontroll över cell urvalsprocessen, samt att begränsa den slutliga volymen överförs tillsammans med cellen. Den fina kontroll och stor separation av lösning från forskarnas mun också maximerar säkerheten för forskaren, som de volymer som överförs är inom nliter till mikroliter utbud. Vår erfarenhet med den moderna mikropipett är däremot att det tenderar att överföra mer omgivande vätskan och celler med IBC, vilket kan leda till kontaminering med extracellulära luminala bakterier. Vår slutsats att munnen pipettering ger en högre prestanda över andra enda cell isoleringsmetoder har också rapporterats av andra labs22,23,24. Bortsett från enstaka cell isolering, har mun pipettering även använts i encelliga elektroporation för nervceller25, vilket ytterligare visar verktyget och den minuterna kontroll som utbildade forskare kan uppnå med tekniken. Men säkerheten är av primär betydelse, och vi föreslår eventuella ytterligare åtgärder som kan vidtas beroende på de patogener som används: (i) förlängningen av det luftbuffert mellan forskaren och det biologiska materialet, till exempel genom att använda en aspirera pipett med en större volym (t.ex. 5 mL), eller (ii) att lägga till en fysisk filter såsom bomull till utvärderingsenheten pipetten att fungera som ytterligare ett hinder.
I fall där en riskbedömning leder till slutsatsen att det fortfarande är för riskabelt att munnen pipettering, kan kommersiellt tillgängliga robotic uppställningar (till exempel de som används för nanoinjections) kombineras med de andra delarna av vår teknik för att ge en säkrare metod för isolera infekterade celler från blandade populationer. Det bör noteras att vår erfarenhet med att använda en robotic micromanipulator har visat en minskad frekvens av IBC isolering jämfört med munnen pipettering, som den stora inom experimentell variationen i urinblåsan epitelial Cellstorlek gör det utmanande för användaren av en robotarm att avgöra den kraft som krävs för att plocka upp enda IBCer. Det är dock fortfarande ett gångbart, men dyrare, alternativ för dem som arbetar med mycket smittämnen av sjukdom.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Research Foundation, premiärministerns kontor, Singapore, enligt dess NRF Research Fellowship system (NRF utmärkelse nr. NRF-RF2010-10); Singapore hälsoministeriets National Medical Research Council (NMRC/CIRG/1358/2013). Genome Institute i Singapore (GIS) / byrå för vetenskap, teknik och forskning (A * STAR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL eppendorf tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| 100% ethanol | For Alcohol Burner | ||
| 15 mL conical tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| 1 mL Tuberculin Syringe | BD Biosciences | 302100 | |
| 3% Bacterial Agar | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| 70% ethanol | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Aesculap anatomic forceps | Braun/Kruuse | BD222R | For initial dissection of mouse (skin, fascia) |
| Alcohol Burner | Wheaton | 237070 | |
| Aspirating pipette | BD Biosciences | 357558 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Bacterial loops | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424 | Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes |
| Conical flasks | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Digital camera for microscope | Olympus | DP71 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
| Glass Capillaries | Kimax | 6148K07 | |
| Iris Scissors STR SS 110MM | Braun | BC110R | |
| Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Kanamycin Sulfate | Calbiochem | 420311 | For static bacterial culture and OD measurement |
| LB broth (Miller) | Thermo/Gibco | 10855021 | For static bacterial culture and OD measurement |
| Light source unit for microscope | Olympus | LG-PS2 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
| Lubricant | KY | Any similar commercial medical lubricant will suffice | |
| Macro fluorescence microscope | Olympus | MVX10 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
| Micropipette + micropipette tips | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| PBS 1x | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Pipette controller + Pipettes | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Polyethylene Tubing | BD Intramedic | 427401 | |
| Precision Glide needle 30 G | BD Biosciences | 305107 | Possibly under new catalogue number (305106) |
| Splinter forceps curved | Braun | BD312R | |
| Spray bottle (for ethanol) | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Square cuvettes | Elkay | 127-1010-400 | For static bacterial culture and OD measurement |
| Sterilgard III Advance Safety Cabinet | Baker | SG403 | Any biosafety cabinet with a UV irridiator |
| Sterilin 90mm Standard Petri Dish | Thermo | 101VR20 | Any sterile petri dish |
| Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm | Braun | OK366R | Recommended for harvesting of bladder |
| Surgical Scissors STR S/B 105MM | Braun | BC320R | |
| Tabletop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals |
| WPA C08000 cell density meter | Biowave (Biochrom) | 80-3000-45 | For static bacterial culture and OD measurement |
References
- Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).
- Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).
- Foxman, B., Barlow, R., D'Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs. Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).
- Zowawi, H. M., et al. The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology. Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).
- Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections. Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).
- Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract. Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).
- Hung, C. -S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).
- Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science Translational Medicine. , (2011).
- Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. PLoS Pathogens. , (2009).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).
- Hunstad, D. A., Justice, S. S. Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli. Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Medicine. , (2007).
- Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
- Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
- Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection. Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).
- Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal). International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).
- Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir. Infection and Immunity. , (2018).
- Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).
- Tang, F., et al. Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres. PLoS One. , (2011).
- Wells, J. M., Melton, D. A. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development. 127, 1563-1572 (2000).
- Guo, H., et al. Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing. Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).
- Zhao, R., et al. The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
- Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G.
- Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), 52892 (2015).
- Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
- Mulvey, M. A., et al. Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli. Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).
- Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).
- Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media. Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).
- Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).
- Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
- Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli. Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).
- Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073. Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).
- Jost, S. P.
