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Immunology and Infection

Isolement des simples communautés bactériennes intracellulaires généré à partir d’un modèle murin d’Infection des voies urinaires pour l’analyse de cellules individuelles en aval

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/58829
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1,3
1Infectious Diseases Group, Genome Institute of Singapore, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, National University of Singapore, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Summary

Ce protocole décrit une méthode simple permettant d’isoler les cellules épithéliales unique, infectés par la vessie d’un modèle murin d’infection urinaire.

Abstract

Dans cet article, nous décrivons une procédure utilisée pour isoler les communautés bactériennes intracellulaires individuelles d’une souris qui a été infecté expérimentalement dans les voies urinaires. Le protocole peut être largement divisé en trois sections : l’infection, récolte de cellules épithéliales de la vessie et micropipetting de la bouche d’isoler des cellules épithéliales infectées. Les cellules épithéliales isolées contient des cellules bactériennes viables et sont presque exempt de contamination de bactéries extracellulaires, le rend idéal pour l’analyse de cellules individuelles en aval. Le temps pris depuis le début de l’infection à l’obtention d’une seule communauté bactérienne intracellulaire est environ 8 h. Ce protocole est peu coûteux à déployer et utilise des matériaux largement disponibles, et nous prévoyons qu’il peut également être utilisé dans des modèles d’infection à isoler des cellules infectées unique des mélanges de cellules même si ces cellules infectées sont rares. Toutefois, en raison d’un risque potentiel en micropipetting de la bouche, cette procédure n’est pas recommandée pour les agents hautement infectieux.

Introduction

Infections des voies urinaires (IVU) comptent parmi les infections bactériennes les plus fréquentes. Environ 40 à 50 % des femmes devraient connaître au moins une infection des voies urinaires (IVU) au cours de leur durée de vie1. L’un des principaux agents d’infection urinaire est uropathogènes e. coli (UPEC), qui représente plus de 70 % de l’infections urinaires non compliquées2. Par ailleurs, environ un quart des personnes atteintes d’une infection urinaire auront une infection récurrente, souvent causée par la même souche, malgré un traitement antibiotique approprié3. La forte incidence d’infection urinaire représente un lourd fardeau sur les systèmes de santé, coûtant plus de $ 2 milliards par an dans l’US4. En outre, l’utilisation d’antibiotiques pour traiter les infections urinaires mène également à la hausse des taux de résistance aux antibiotiques, qui est un de problème majeur de santé publique5.

Par conséquent, un gros effort a été placé dans la compréhension des mécanismes par lesquels UPEC infecte les voies urinaires, ainsi que sa capacité de provoquer des infections récurrentes6,7,8. En particulier, un modèle de souris de l’infection a servi à examiner les caractéristiques bactériennes et hôte qui contribuent à l’UTI8. Ce modèle de souris a l’avantage d’être applicable aux non modifiées souches cliniques isolées de patients humains. Ce modèle a également conduit à la découverte des voies de bactéries potentiellement thérapeutiques importantes pour l’établissement des infections urinaires, tels que le Type 1 pilus9 et fer acquisition systèmes10.

Par rapport à ces réussites en étudiant les événements précoces UTI, connaissance des mécanismes qui sous-tendent les infection urinaire récurrente fait encore défaut11. Une hypothèse est que UPEC échappe à une antibiothérapie et provoque des infections récurrentes dans la vessie en formant des communautés bactériennes intracellulaires (GRV) dans les cellules épithéliales de la vessie. GRV ont été identifiées dans des modèles murins d’infection et humaine UTI patients12,13. La présence de GRV dans les échantillons d’urine de patients pédiatriques de UTI a été associée à des taux plus élevés de récidive14,15. Toutefois, les isoler GRV et étudie les bactéries en leur sein s’est avéré pour être techniquement difficile en raison de leur rareté ; On estime qu’une vessie murine infectée a généralement seulement 10-100 GRV16. En outre, les cellules épithéliales de la vessie sont relativement gros (50-120 µm)17, rendant difficile à déployer la fluorescence assistée par cellule triant (FACS) étant donné que les buses de FACS typiques sont conçus avec un diamètre de 70 µm ou 100 µm. Ainsi, les cellules aussi grandes que les cellules épithéliales de la vessie sont souvent éliminées par filtration avant FACS pour éviter d’engorger la fluidique.

Notre laboratoire a récemment décrit une méthode générale et économique pour isoler les cellules infectées rares de mélanges tels que les cellules épithéliales raclées de la vessie18. Pour isoler efficacement les GRV, nous avons utilisé la bouche traditionnel pipetage. Micropipetting de la bouche est une technique qui est utilisée depuis longtemps pour la micromanipulation des cellules individuelles et des embryons pour analyse en aval19,20,21,22,23, 24 , 25. bouche traditionnel pipetage de grandes quantités de liquides (en millilitres) a souvent été la cause de laboratoire concernant les accidents, et la technique a justement été boudée par une grande partie de la communauté des chercheurs en dehors de l’embryologie traditionnel et applications de cellule unique. Notre protocole est inspiré par les versions monocellulaire de cette technique19,20, atténuer les risques en fournissant un grand tampon (> 2 mL) d’air entre le chercheur et l’échantillon par rapport au volume de liquide transféré (< 1 ΜL). Cette méthode tire également parti du contrôle fin cette bouche donne micropipetting, qui se traduit par un faible volume final solution transféré et haute pureté de cellules isolées environnantes. La technique utilise des matériaux peu coûteux (< 50$) et devrait donc être possible de mettre en œuvre dans tous les laboratoires.

Ce protocole visual décrit notre technique d’isolation IBC, qui fournit une référence afin d’aider les autres chercheurs qui cherchent à reproduire cette technique. Le chercheur besoin d’accéder à un microscope à dissection fluorescent (ou des appareils similaires) qui permet de visualiser les différentes cellules épithéliales et les bactéries fluorescentes en imagerie live, avec un stade d’imagerie ouvert et accessible pour micropipetting (voir la Table des matières pour les détails du microscope utilisé, bien que les autres modèles d’instrument équivalent peuvent également être utilisés). Alors que le présent protocole portera sur les GRV dans un modèle murin d’infection urinaire, des méthodes similaires devraient s’appliquer à isoler des cellules infectées de suspensions cellulaires dans d’autres modèles d’infection.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici sur la gestion des animale ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Institut du génome de Singapour et un centre de ressources biologiques de l’Agence pour la Science, technologie et recherche, Singapour.

1. souris Infection

  1. Préparation des capillaires en verre
    1. Une source de flamme nue (bec Bunsen ou lampe à alcool) de lumière.
    2. Tenir un verre capillaire avec les deux mains en pinçant fermement les deux extrémités, puis au milieu du tube de chaleur uniformément jusqu'à ce que le verre va doux. Tourner le tube capillaire doucement en arrière le long de son axe à l’aide de chauffage même du verre.
    3. Retirez le capillaire de verre de la source de chaleur et immédiatement écartez mains, tout en maintenant la poignée sur les deux extrémités du tube. La longueur finale idéale du capillaire extraite est 3-5 cm de plus que l’unpulled capillaire pour assurer un diamètre interne approprié pour isoler les cellules épithéliales de la vessie unique.
      Mise en garde : Le tube reste encore extrêmement chaud pendant une période de temps, donc infirmé le capillaire sur une surface de chaleur pendant quelques minutes refroidir avant de passer à l’étape suivante.
    4. Vérifiez pour voir si le milieu du capillaire de verre est devenue plus étroite (Figure 1A) et que l’intérieur du tube est toujours creusent (Figure 1B). Pour isoler des GRV, une taille d’alésage de 200 à 400 µm est utilisable.
    5. Ramasser une extrémité du capillaire extraite d’une seule main. Tenir une paire de pinces avec l’autre main et utilisez-le pour ramasser le verre tiré capillaire au niveau du col. Veiller à ce que les pinces sont maniés avec suffisamment de force pour s’accrocher fermement à capillaire sans écraser.
    6. Utiliser un rapid mouvement de torsion de la main qui tient la pince pour enclencher le capillaire extraite au point plus étroit pour créer un micropipetting de bouche capillaire.
      Remarque : En utilisant les doigts au lieu de forceps est également acceptable, tant qu’une protection adéquate contre les échardes de verre est utilisée.
    7. Répétez les étapes 1.1.2-1.1.6 au moins 4 x plus à produire suffisamment capillaires de rechange micropipetting et offrant un éventail de diamètres pour l’isolement de l’IBC. Si plus d’un groupe d’infection est prévu, préparer 5 capillaires micropipetting supplémentaires pour chaque groupe supplémentaire de l’infection.
      Mise en garde : N’oubliez pas de couper la flamme.
    8. Placez les capillaires tirés dans une boîte de pétri de 100 mm et exposez le plat aux rayons UV pendant 30 min stériliser les capillaires.
    9. Replacer le couvercle sur la boîte de pétri après stérilisation UV et stocker la boîte de pétri avec les capillaires à la température ambiante.
  2. Préparation des cathéters avant l’infection
    1. Préparer les cathéters urinaires pour infection comme décrit dans Hung et al.8 et al. Conover26 au moins un jour avant l’infection.
  3. Préparation des uropathogènes fluorescent culture d’e. coli
    1. Croître le sélectionné uropathogènes exprimant le fluorophore bactérienne souche selon les protocoles établis.
      Remarque : Le choix de la souche et le fluorophore dépendre en grande partie le microscope et les souches disponibles dans différents laboratoires. Dans cet exemple, nous utilisons une souche dérivée de UTI89, qui est un isolat clinique originaire d’un patient atteint de cystite récurrente. Cette souche, SLC-638, porte un plasmide (CLSP-77) qui exprime les vsfGFP-9 et la kanamycine résistance18. SLC-638 est cultivé dans le bouillon LB à 37 ° C et additionné de 50 kanamycine µg/mL.
    2. Souche SLC-638-ensemencer sur un Luria Bertani (LB)-gélose additionnée de 50 kanamycine µg/mL. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
    3. (Facultatif) Découvre la plaque sur le microscope à dissection pour confirmer l’expression de marqueurs fluorescents avant de choisir une colonie.
    4. À l’aide d’une boucle de l’inoculation bactérienne, transférer la colonie sélectionnée dans une fiole conique de 125 mL avec 10 mL de bouillon LB additionné de 50 kanamycine µg/mL. Incuber le ballon statiquement à 37 ° C pendant 24 h.
    5. Repiquer les bactéries de cette fiole en prenant 10 µL de la culture de la fiole et il diluer dans 10 mL de bouillon LB additionné de 50 kanamycine µg/mL dans une fiole de frais 125 mL (une dilution de 1/1000). Incuber à ce deuxième ballon statiquement à 37 ° C pendant encore 24 h.
    6. Tournez en bas la culture bactérienne pendant 5 min à 5 000 x g et 4 ° C.
    7. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot bactérien dans du PBS froid à OD600 de 0,5.
      Remarque : Même si elle peut varier d’une culture à, typiquement 1 mL de culture statique donne environ 4-5 mL de OD600 = 0,5 culture bactérienne. Le volume total de l’inoculum bactérien nécessaire pour chaque souche peut être calculée comme suit : 50 µL est requise pour chaque souris et 50 µL est nécessaire pour remplir la tête de l’aiguille. 10-20 % supplémentaire (minimum de 50 µL) de l’inoculum est recommandé pour tenir compte de volume mort dans la seringue.
    8. Le reste du mélange bactérien permet de déterminer le titre de l’infection, comme décrit dans Hung et al.,8.
      Remarque : Cette étape peut être retardée de quelques heures en stockant le mélange bactérien à 4 ° C.
  4. Modèle murin d’Infection des voies urinaires
    1. Infecter les souris comme décrit par Hung et al.8, avec un groupe expérimental pour chaque souche d’Escherichia coli fluorescent cultivé dans la section 1.3.
      Remarque : Voir aussi Conover et coll.26 pour l’assistance visuelle.
    2. Noter le moment de l’inoculation bactérienne de la souris ou la cage.
    3. Répétez les infections pour l’ensemble du groupe expérimental.
      Remarque : Le cathéter de l’infection peut être réutilisé pour toutes les souris du même groupe.
    4. Répétez les étapes 1.4.1-1.4.3 pour chaque groupe expérimental prévu, veillant à ce qu’un cathéter frais et nouveau gel lubrifiant est établi pour chaque groupe.
      Remarque : Pour des expériences avec un grand nombre d’animaux, il est préférable de diviser les animaux en groupes de cinq et bien décaler les infections telle que chaque groupe soit infecté environ 30 min à 1 h d’intervalle. Cela vous donnera suffisamment de temps pour les étapes suivantes (articles 2 et 3).

2. vessie cellules épithéliales récolte afin d’obtenir une Suspension cellulaire

  1. Récolte et en inversant les vessies murins
    1. Préparer trois tubes coniques 50 mL, remplis de 45 mL d’éthanol à 70 % pour stériliser le matériel chirurgical.
    2. Dans deux des tubes préparées à l’étape 2.1.1, placer une paire de ciseaux et une paire de pinces chaque. Insérez le troisième tube de deux paires de pinces (une préférence plus étroite et à bout arrondi, pour l’inversion de la vessie).
      Remarque : Les outils dans le premier tube seront utilisés sur la région externe, les outils dans le second seront utilisés dans la récolte de la vessie, et les deux paires de pinces dans le dernier testament de tube utilisé par inversion de la vessie.
    3. À 6 h après l’infection, euthanasier les souris infectées, selon les protocoles établis de IACUC de l’institution.
      Remarque : Notre protocole IACUC réclame l’euthanasie par dislocation cervicale effectuée alors que la souris est sous anesthésie (isoflurane).
    4. Posez les animaux plat sur le dos et utiliser un vaporisateur rempli d’éthanol à 70 % pour stériliser leur région abdominale.
    5. À l’aide d’une paire de pinces et ciseaux chirurgicaux du premier tube (préparé à l’étape 2.1.2), l’ouverture faire une petite incision transversale sur la peau environ 1 cm au-dessus de l’urètre. Développez l’incision en diagonale vers les membres supérieurs de la souris, création d’une coupe en forme de V le long de toute la partie antérieure de la souris qui expose le contenu du péritoine. Veiller à ce que, au cours de ce processus, les ciseaux ne pas coupent à travers les intestins de la souris (Figure 2A, B).
    6. Placez-vous dans le deuxième ensemble d’outils (préparé à l’étape 2.1.2). En utilisant des lames des ciseaux ou les arbres de la pince, abaissez doucement les coussinets adipeux près de la région pelvienne de la souris.
      Remarque : Cette étape entraîne la vessie pour saillie vers l’extérieur et assure une visibilité pour la récolte.
    7. Attrapez la vessie exposée au sommet avec une paire de pinces (Figure 2C).
    8. Gardant fermement sur l’apex de la vessie avec la pince, coupez et libérer la vessie du reste de l’animal (coupant l’urètre et les uretères) en utilisant les ciseaux chirurgicaux. Ne pas relâcher la pince tenant la vessie encore.
    9. Commutation de ciseaux à la pince arrondie plus étroite de la troisième conique tube (de l’étape 2.1.2), insérez la pointe d’un arbre de la pince arrondie dans l’ouverture de la vessie où il a été coupé juste à l’étape précédente (Figure 2D). Avec la pointe de la pince arrondie en toute sécurité insérée dans l’ouverture de la vessie, libérer la paire de pinces de préhension à l’apex de la vessie et remettez-le dans le deuxième tube conique.
    10. À l’aide de la deuxième paire de pinces du troisième tube, tournez doucement « inside out », tirant sur l’extrémité extérieure de la bouche de la vessie de la pince arrondie (Figure 2D, flèche 1) d’abord et guider autour puis sur l’autre extrémité de la vessie la pince arrondie (Figure 2D, flèche 2).
      Remarque : L’action peut être comparé à enlever une chaussette d’un pied et en tirant sur l’autre.
      1. Au cours du processus d’inversion, maintenir la première paire arrondie de la pince presque complètement fermé. Ceci fournit suffisamment de liberté de mouvement à enlever la vessie depuis le premier puits de la pince arrondie, mais également apporte le deuxième arbre de la pince arrondie plus près à la première et permet la vessie devant être transférés facilement. Le résultat final de cette étape, c’est que la vessie doit se terminer vers le haut étant inversé et à l’extrémité de l’arbre du deuxième de la première paire de pinces (Figure 2A).
      2. À l’aide de la deuxième paire de pinces, cajoler doucement la vessie inversée au large de la pointe de la pince dans 1 mL de PBS froid.
        Remarque : (Facultatif) C’est le moment opportun de prendre des images de l’ensemble inversé, infectée vessie d’observer la fréquence générale et la distribution des GRV, le cas échéant.
    11. Répétez les étapes 2.1.1-2.1.10 pour chaque vessie dans le groupe expérimental (jusqu'à un maximum de cinq animaux).
  2. Raclage de cellules épithéliales de vessie
    1. À l’aide de deux paires de pinces de nettoyer, grattez légèrement l’extérieur de la vessie inversée (qui est la couche de cellules épithéliales internes). Le PBS environnant devrait apparaître plus nuageux comme produit de raclage et cellules épithéliales sont libérés dans la solution de PBS.
    2. (Facultatif) Vérifier visuellement que le raclage de la vessie a libéré des cellules dans la solution à l’aide d’un microscope à dissection. Figure 3 A, B). Le PBS doit apparaître nuageux à le œil nu, et les cellules épithéliales de la raclée vessie individuels peuvent être vu à un grossissement de 10 x.
    3. Répétez les étapes 2.2.1-2.2.2 pour chaque vessie récoltée à l’étape 2.1.

3. intracellulaire isolement de la communauté bactérienne (IBC) : bouche pipetage de GRV

Remarque : Toutes les méthodes décrites dans cette section ont fait l’objet d’une évaluation des risques institutionnels. Bouche de pipetage comporte le risque inhérent d’ingestion de la solution qui est transférée. Ce risque est réduit dans une large mesure par les volumes nanolitres qui utilise ce protocole, et nous recommandons que tous les utilisateurs de la paie de protocole en considération le principe de précaution et notes pratiques énumérés ici et dans la discussion.

  1. Après les cellules ont été grattées dans du PBS, mis en place l’appareil de micropipetting de bouche (Figure 3C).
    1. Insérez l’extrémité plus épaisse du verre tiré capillaire (la fin unpulled) dans le bouchon en caoutchouc (extrémité blanche) du tube de l’aspirateur.
    2. Insérez l’extrémité étroite d’une pointe de pipette de 1 mL dans l’autre extrémité ouverte (rouge) du tube aspirateur, veillant à ce qu’il y ait un ajustement serré.
    3. Insérez l’extrémité étroite d’une aspiration pipette dans l’extrémité ouverte et large de la pointe de pipette de 1 mL de 2 mL, assurant encore une fois qu’il y a un ajustement.
      Remarque : Le programme d’installation qui en résulte permet au chercheur de pipette de la bouche de l’extrémité plus large et ouverte de la pipette d’aspiration à créer une force d’aspiration douce à partir de l’extrémité étroite du tube capillaire à l’autre extrémité de l’appareil.
    4. Tester l’appareil de micropipetting de bouche final utilisant un 100 mm boîte de pétri contenant de l’eau désionisée fraîche. Une légère action d’aspiration sur l’extrémité ouverte de la pipette d’aspiration (similaire à siroter une boisson avec une paille) devrait augmenter le niveau du liquide dans le tube capillaire, mais ne provoque pas de l’eau désionisée à déborder dans le tube de l’aspirateur. Utilisez une main pour contrôler le tube capillaire, tout en utilisant l’autre main pour ajuster la position de la boîte de pétri.
      Remarque : La force de succion requise pour un seul bac bouche-pipetage variera entre chercheurs. Toutefois, il est recommandé que chaque chercheur d’essayer cette technique commencent avec une aspiration faible et augmenter lentement si aucun liquide ne s’écoule vers le haut le capillaire. Il n’y a aucune nécessité d’une force supérieure à sucer sur une paille pour boire. Si le tube capillaire ne semble pas être ramasser de liquide pendant l’essai à l’étape 3.1.4, il est possible que le capillaire ou le tube d’aspiration est obstrué et doit être remplacé. Il est en outre recommandé que tous les nouveaux chercheurs première pratique contrôle d’aspiration dans l’appareil de pipetage de bouche à l’aide de stériliser l’eau. En outre, Notez que le contrôle du volume absorbé par l’appareil de pipetage de bouche est grâce à l’utilisation de la langue du chercheur. La langue peut finement régler la puissance de succion appliquée, ainsi que servir d’arrêt d’urgence.
    5. Après avoir obtenu l’adoption réussie de liquide, tester la possibilité d’expulser du capillaire en soufflant doucement dans l’extrémité ouverte de la pipette d’aspiration. Veiller à ce qu’aucune bulle n’est créés en train d’expulser le liquide pour prévenir la contamination des GRV au cours de l’étape 3.5.
      Remarque : Comme avec l’aspiration, la force de la pression positive appliquée par le chercheur d’expulser l’IBC dans le tube à centrifuger variera entre chercheurs. Il est recommandé aux chercheurs de nouveau au présent protocole à l’étape pratique 3.1 quelques jours avant l’infection réelle. Une suggestion pour la pratique micropipetting de bouche est de pratiquer, transfert de petites quantités d’eau stérilisée mélangé avec quelques gouttes de colorant alimentaire (pour la visibilité) à l’aide de l’appareil d’une micropipette de bouche.
  2. Placez la suspension cellulaire gratté sous le microscope à dissection et qualifient les GRV de gros agrégats fluorescents (Figure 3A, B). La plage idéale de grossissement est 20-40 x. Trempez l’extrémité fine du verre capillaire dans un nouveau tube de PBS pour 1 s pour réduire l’absorption de volume non désirée par capillarité.
  3. Regardant à travers le microscope, identifier l’IBC d’intérêt et amenez lentement l’extrémité ouverte du tube capillaire vers le bac. Utilisez l’extrémité fine du verre capillaire pour balayer les cellules supplémentaires près de chaque bac pour éviter l’aspiration des deux cellules ou davantage, ou casser apart grands agrégats de cellules.
  4. Tout en regardant à travers le microscope, appliquer une très petite force d’aspiration sur l’extrémité (pipette aspirante) de l’appareil de micropipetting de bouche pour guider l’IBC dans le capillaire de verre.
  5. Après avoir décroché le bac, déplacer le capillaire dans un tube à centrifuger vide de 1,5 mL et appliquez une légère pression positive d’expulser la goutte et l’IBC dans le tube à centrifuger (Figure 3D).
  6. Répétez les étapes 3,3 à 3,6 sur nombreux GRV est nécessaires de la vessie actuelle, avant de passer à la prochaine vessie. Changer d’aspiration les pipettes et les capillaires fréquemment pour éviter l’accumulation de salive.
    Mise en garde : Lorsque vous travaillez avec des souches de bactéries infectieuses (ou cliniques), constamment surveiller le niveau de solution dans le capillaire. Ne laissez pas le niveau du liquide étant pipeté débordement du bord du capillaire dans le tube de l’aspirateur. Dans ce cas, immédiatement basculer vers un tube d’aspirateur différents et jeter le jeu précédent vers le haut.
  7. Répétez les étapes 3,2 à 3,6 sur toutes les outres récoltés, ou jusqu'à ce qu’un nombre suffisant d’échantillons biologiques ont été collecté pour le groupe expérimental.
  8. (Facultatif) Répétez les étapes 3.6 et 3.7 jusqu'à ce que tous les groupes expérimentaux (ou souris) ont été euthanasiés et assez d’échantillons biologiques ont été récoltés dans chaque groupe.

Representative Results

En dehors de la confirmation (Figure 3D) de la présence d’un seul bac isolé dans le tube de prélèvement par le microscope à dissection, la pureté du GRV isolé peut également être confirmée par microscopie confocale. Comme le montre la Figure 4A, les cellules isolées devraient tacher pour e. coli et uroplakin et sont la taille attendue pour GRV (50-120 µm)17. En outre, e. coli coloration n’est pas présente dans le liquide environnant. Selon nos données, plus de 90 % des cellules isolées avec cette technique sont GRV18. Après l’isolement, la présence et la viabilité des cellules bactériennes dans le GRV individuel peuvent être confirmés par l’énumération de (UFC) d’unité formant colonie (Figure 4B) ou quantitative PCR (qPCR) pour les équivalents génomique ( Figure 4 C). Figure 4C montre également que des cellules épithéliales infectées isolés suivant le même protocole n’ont pas des quantités quantifiables de bactéries. Selon ces données, nous estimons que la gamme de l’UFC dans un bac unique est de2-10 103 dans le modèle murin d’infection urinaire. L’un des principaux objectifs d’isolement d’IBC simple est d’effectuer des analyses en aval telles que le séquençage de RNA. Pour vérifier que notre méthode d’isolement a pu obtenir de RNA de bactéries dans des GRV pour l’analyse, nous avons effectué quantitative de transcription inverse polymérase PCR (qRT-PCR) quantification des trois gènes (16 s, cyoB et frdA) pour une gamme de GRV individuellement isolées ou regroupées (Figure 4D). Toutes les données sur la Figure 4 a été adapté avec autorisation d’Arnaud et al.,18. Un schéma de présentation de notre protocole d’isolement IBC peut être vu dans la Figure 5, qui est reproduit d’Arnaud et al.,18.

Figure 1
Figure 1 : Main tiré capillaires tenir compte des ouvertures étroites. (A) des échantillons de main tiré des tubes capillaires sont affichés sur un fond noir pour le contraste. De bas en haut, une unpulled capillaire, un capillaire qui n’était pas rangé dans une mesure suffisante, un capillaire qui peut être utilisé pour la récolte des cellules épithéliales de vessie unique et un capillaire qui a été tiré trop mince (et donc séparés en deux morceaux) sont indiquées. Une règle de 15 cm est placée au bas de l’image pour l’échelle. Le point estimé pour brisant le capillaire utilisable est indiqué sur la figure de la flèche rouge. (B) Image prise avec un microscope à dissection confirmant le creux diamètre interne d’un capillaire extraite (en bas). Un capillaire unpulled est positionnée au-dessus pour démontrer la différence de taille relative des deux capillaires. Echelle = 4,0 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Dissection de la souris pour récolter les cellules épithéliales de la vessie. (A) une image d’une souris avec des lignes blanches ajouté pour indiquer l’emplacement estimé et l’angle des incisions pour exposer la cavité péritonéale murine et la vessie. Incision postérieure du cavité péritonéale souris (B) une image de l’exposé. Vessie (C) une image de l’exposé (flèche rouge) qui dépassent entre les coussinets adipeux. (D) une image de la vessie murine avec l’extrémité de la pince insérée dans la lumière, avec des flèches pour indiquer la direction du mouvement nécessaire pour inverser la vessie. Le premier boudin légèrement vers l’extérieur, puis autour et le premier arbre de la pince. Les directions de mouvement pour les deux actions sont comme indiqué par des flèches blanches numérotées 1 et 2. (E) une image montrant la position définitive de la vessie inversée enfilée sur le deuxième axe de la pince. Les arbres de la pince sont étiquetés dans les deux tableaux D et E avec flèches rouges et texte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Bac de récolte des cellules de la vessie. (A) une infectés et inversée de la vessie en solution de PBS froide avant grattage de la cellule. (B) une image montrant gratté comme vu au microscope des cellules de vessie. GRV peut être identifié comme grands agrégats fluorescents verts dans les deux images (voir flèches rouges). Appareil de micropipetting de bouche (C) une image de la terminé. La pipette aspirante de pipette, tube de l’aspirateur et tube capillaire extraite sont identifiés avec les flèches numérotées comme indiqué sur la droite. (D) une image d’un seul isolé IBC dans un tube de prélèvement de 1,5 mL (encadré en rouge). Barres d’échelle (comme indiqué) sont représentés par des lignes blanches dans les groupes A, B et D. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : GRV récoltés sont pures et peut être utilisé pour l’analyse en aval. Ce chiffre a été modifié avec la permission d’Arnaud et al.,18. (A) des Images de deux cellules isolées de GFP-positives qui ont été colorées avec les anticorps anti-uroplakin et anti - dee. coli . La première cellule (BAC 1) comporte des images de différents canaux (à faible grossissement) sur la gauche, et une image fusionnée à fort grossissement se trouve sur la droite. La deuxième cellule (Bac 2) est montrée à fort grossissement dans les canaux individuels et fusionné. Barreaux de l’échelle est celles indiquées. L’ADN est coloré au 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et représenté dans la couche bleue. Anti -Escherichia coli est taché avec un anticorps secondaire conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et représenté dans le canal vert. Anti-uroplakin est taché avec un anticorps secondaire conjugué à l’isothiocyanate de tétraméthylrhodamine (TRITC) et représenté dans le canal rouge. (B) bactérienne de l’UFC de GRV isolés. GRV est traitées immédiatement, ou incubés dans 0,1 % Triton-X pour 10 ou 30 min. UFC Pooled chefs d’accusation de GRV individuels isolé de n = 3 expériences distinctes sont indiquées. Seuil de détection = 0,7 log10 UFC/IBC. Les points rouges tracées à la limite de détection indiquent les échantillons pour lesquels aucune colonie ont été récupérés. Tous les échantillons contenant du bac ne sont pas significativement différents (p > 0,05, test de Mann-Whitney) ; les cellules épithéliales infectées sont significativement différentes des données CIB (10 min) (p < 0,001, test de Mann-Whitney). (C) qPCR quantification des bactéries sur les GRV individuels et des cellules épithéliales infectées après une incubation de 10 min à 0,1 % Triton-X (*, p < 0,0001, test de Mann-Whitney, n = 4). Seuil de détection = 1,18 journal10 génome bactérien équivalents/IBC. Points rouges indiquent les échantillons pour lesquels aucune colonie ont été récupérés sur le titrage en panneau b. (D) Quantification des gènes 16 s rRNA, cyoB et Emvrf pour un nombre variable de GRV individuellement isolées ou regroupées (n = 1 expérience ; chacun point indique la moyenne des 3 répétitions techniques). NC ne = aucun contrôle négatif de l’ADN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Une représentation schématique et ses associés photographies représentant l’isolement des GRV via micropipetting de la bouche d’infecté vessies souris. Ce chiffre est tiré d’Arnaud et al.,18. (A), A récolté vessie d’entier ; (B) un inversé vessie toute exposant la GFP exprimant GRV ; (C), un gros plan sur le bord de la raclée vessie montrant GRV individuels en suspension dans le tampon adjacente ; (D) un seul isolé IBC dans un tube. Les flèches rouges dans le groupe B indiquent les exemples de GRV GFP-positif sur la surface Luminale de la vessie. La ligne pointillée rouge dans panneau C indique la bordure droite de la vessie inversée (indiquée sous « BL ») ; les flèches rouges en panneau C indiquent apparente GFP-positif épithéliales cellules individuelles qui ont été grattées la surface de la vessie. Ligne pointillée blanche en panneau D indique une gouttelette solubilisé sub-microlitres contenant un GRV isolé, ce qui est indiqué par une flèche blanche. Barreaux de l’échelle = 2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole que nous avons décrit permet l’isolement des GRV unique d’un modèle murin d’infection urinaire. Ce protocole isole GRV contenant des bactéries intracellulaires viables, qui peuvent être vérifiées en cultivant pour UFC. Les résultats de protocole dans des bactéries intracellulaires de GRV avec peu de contamination par des bactéries extracellulaires, permettant davantage de caractérisation de ces deux bactéries et hôte cellulaire d’une IBC (Figure 4C). Nous montrons aussi que les germes d’un bac unique peuvent être utilisées dans des applications en aval comme qPCR (Figure 4C), ce qui suggère que notre technique peut servir au processus GRV pour les autres analyses in vitro. En mettant en commun les bactéries récoltées dans aussi peu que 5 GRV, nous démontrer davantage notre capacité à effectuer des analyses qRT-PCR sur trois gènes bactériens, suggérant que RNA de bonne qualité peut être récoltée de bactéries dans notre GRV isolés (Figure 4D). Combinés, les données que nous avons montré indiquent qu’analyse pangénomique RNA (telles que le séquençage de RNA) sur GRV unique est possible grâce à cette technique d’isolation.

Dans ce protocole, nous nous sommes concentrés sur le point de temps de 6 h parce que c’est lors de l’IBC numéros maximum dans les vessies de noirs 6 souris infectées par UTI89,27. En outre, nous avons aussi utilisé un système statique de culture bactérienne pour augmenter le niveau d’expression de pilus de type 1 dans UTI89. L’expression de pilus de type 1 est critique pour e. coli pour attacher et infectent les cellules épithéliales de la vessie28. Toutefois, cette expression est étroitement réglementé29 et signaux environnementaux sont connus de l’altérer30. Afin de maintenir un phénotype compatible infection et un nombre suffisant de GRV, nous recommandons d’utiliser une culture bactérienne statique de 2 x 24 h (légèrement modifié de Hung et al.8) et le point 6 h de temps infection quand travailler avec déjà testé e. coli des souches comme NU14 et UTI8928,29. Toutefois, il est possible que ces variables devront être ajustées dans les autres souches UTI ou autres souches de souris pour obtenir le nombre idéal de GRV de chaque infection.

Tandis que le protocole de Hung et coll.8 utilise uniquement des souris femelles, autres protocoles établis pour l’établissement d’infection des voies urinaires chez les souris mâles ont été déclarés31. Dans ce modèle, la cystite chez la souris mâle a également suivi la voie de l’IBC. Comme les vessies des souris mâles et femelles ont une taille similaires, nous prévoyons que notre protocole d’isolement IBC peut être utilisé sur des souris mâles infectés ainsi.

La technologie relativement simple utilisée dans le présent protocole s’assure également qu’elle peut être déployée dans la plupart des laboratoires. Une des étapes clés impliquées dans le présent protocole est l’arrachement des capillaires en verre pour créer microcapillaries pour sélectionner le type de cellules d’intérêt. Cette étape permet une flexibilité dans les diamètres de microcapillaries créé, et donc la méthode peut être étendue à plusieurs types de cellules cibles différents. Toutefois, en raison de la variation inhérente à la création de ces capillaires, veiller à faire en sorte que le diamètre final est dans une zone de portée. Si les capillaires sont trop étroits, ils ne parviennent pas à ramasser la cellule d’intérêt, mais si elles sont faites trop larges, plusieurs cellules pourraient être choisis dans une tentative unique. En outre, l’utilisation d’une flamme nue pendant le processus de traction capillaire porte un risque inhérent de brûlures et d’incendie, afin que le chercheur tente de créer microcapillaries devrait s’efforcer d’éviter de tels événements ne se produisent. Afin de réduire la variabilité ainsi que les risques d’incendie ouvert impliqués dans la fabrication de ces capillaires, le chercheur pourrait faire usage d’une micropipette traditionnelle en tirant la machine, comme ceux utilisés pour des expériences électrophysiologiques (p. ex., PC-100, groupe de Narishige). Comme ces machines font usage de gravité ou de plates-formes robotiques pour tirer les capillaires, ils peuvent être adaptés pour répondre aux besoins du modèle infection. Toutefois, la vaste gamme de micropipette tirant machines disponibles signifiera que le chercheur individuel devront passer par tâtonnements pour déterminer le diamètre final capillaire pour une utilisation avec ce protocole.

Le protocole présenté utilise des bactéries exprimant une balise fluorescente pour identifier visuellement l’IBC. Ainsi, cette technique est limitée par la capacité des chercheurs à modifier génétiquement l’organisme infectieux. Spécifiquement pour l’UPEC, formant des IBC des souches telles que CFT073 et NU14 ont été transformées avec succès avec GFP exprimant plasmides32,33,34; par conséquent, ceux-ci doivent être utilisables dans le même protocole. Basé sur la zone de la vessie (70 mm2) de souris35, la longueur des cellules épithéliales individuelles (50-120 µm)17et la fréquence des GRV dans une vessie unique16, une estimation prudente de l’incidence des GRV est sur 1 à 1 000 cellules (soit 0,1 %). Cette estimation met en valeur l’utilité de notre protocole d’isolement cellulaire pour cibler des événements rares. La précision de la sélection de cellules par le biais de notre protocole et la large gamme de diamètres capillaires qui peut être tiré suggèrent que ce protocole peut être utilisé pour isoler les bactéries intracellulaires des autres modèles in vivo et in vitro de l’infection. En effet, nous avons utilisé avec succès cette technique pour isoler des cellules épithéliales infectées vessie cultivées (données non présentées).

Un des plus techniquement difficiles étapes du protocole est inversant la vessie pour exposer les cellules épithéliales de raclage. Nous avons trouvé qu’il est également possible de faire une incision sur la vessie pour il s’écrasent pour racler. Toutefois il faut pour réduire les dommages aux cellules épithéliales de la vessie pendant le processus de découpage il ouvert ; Idéalement, une coupe unique doit être utilisée pour s’écrasent l’ouverture de la vessie. En outre, la découpe doit être faite dans du PBS froide, pour prévenir toute perte accidentelle de cellules ou de tissus de la vessie au cours du processus.

Bouche pipetage des GRV dans ce protocole assure un meilleur contrôle sur le processus de sélection de cellule, ainsi que de limiter le volume final de solution transféré ainsi que de la cellule. Le contrôle précis et la grande séparation de solution de bouche des chercheurs maximise également la sécurité du chercheur, que les volumes transférés sont dans le nanolitre gamme microlitre. En revanche, notre expérience avec la micropipette moderne est qu’elle tend à transférer plus liquide environnant et les cellules avec l’IBC, pouvant déboucher sur une contamination bactérienne Luminale extracellulaire. Nous avons conclu que bouche pipetage fournit de meilleures performances plus autres unicellulaires méthodes d’isolation a aussi signalé par d’autres laboratoires22,23,24. En dehors de l’isolement cellulaire unique, bouche pipetage a même été utilisé dans unicellulaires électroporation pour neurones25, qui montre encore l’utilité et le contrôle minute un chercheur qualifié pouvant atteindre avec la technique. Toutefois, la sécurité est d’une importance primordiale, et nous suggérer d’éventuelles mesures supplémentaires qui peuvent être prises selon les agents pathogènes utilisés : (i) l’extension de la mémoire tampon d’air entre le chercheur et le matériel biologique, par exemple en utilisant une aspiration pipette avec un plus grand volume (p. ex., 5 mL), ou (ii) l’ajout d’un filtre physique tels que de l’ouate dans la pipette aspirante d’agir comme un obstacle supplémentaire.

Dans les cas où une évaluation des risques aboutit à la conclusion que la bouche de pipetage est encore trop risqué, les configurations robotiques disponibles dans le commerce (comme celles utilisées pour les nanoinjections) peuvent être combinées avec les autres sections de notre technique de fournir une méthode plus sûre pour isoler les cellules infectées de populations mixtes. Il est à noter que notre expérience avec l’aide d’un micromanipulateur robotique a démontré une diminution du taux d’isolement de bac par rapport à la bouche de pipetage, comme la grande variation intra-expérimentale en taille de cellule épithéliale de la vessie rend difficile pour l’utilisateur d’un bras robotique pour déterminer la force nécessaire pour ramasser les GRV unique. Néanmoins, il reste une option viable, bien que plus coûteux, pour ceux qui travaillent avec des agents hautement infectieux de la maladie.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par la Fondation nationale de la recherche, bureau, Singapour du premier ministre, en vertu de son programme de bourses de recherche NRF (NRF prix no. NRF-RF2010-10) ; National Medical Research Council le Singapour ministère de la santé (NMRC/CIRG/1358/2013) ; et l’Institut du génome de Singapour (GIS) / Agence pour la Science, technologie et recherche (A * STAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL eppendorf tube For static bacterial culture and OD measurement
100% ethanol For Alcohol Burner
15 mL conical tube For static bacterial culture and OD measurement
1 mL Tuberculin Syringe BD Biosciences  302100
3% Bacterial Agar For static bacterial culture and OD measurement
70% ethanol For static bacterial culture and OD measurement
Aesculap anatomic forceps Braun/Kruuse BD222R For initial dissection of mouse (skin, fascia)
Alcohol Burner Wheaton 237070
Aspirating pipette BD Biosciences  357558
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177
Bacterial loops For static bacterial culture and OD measurement
Benchtop centrifuge Eppendorf 5424 Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes
Conical flasks For static bacterial culture and OD measurement
Digital camera for microscope Olympus DP71 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Glass Capillaries Kimax 6148K07
Iris Scissors STR SS 110MM Braun BC110R
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein Animal Health 29405
Kanamycin Sulfate Calbiochem 420311 For static bacterial culture and OD measurement
LB broth (Miller) Thermo/Gibco 10855021 For static bacterial culture and OD measurement
Light source unit for microscope Olympus LG-PS2 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Lubricant  KY Any similar commercial medical lubricant will suffice
Macro fluorescence microscope Olympus MVX10 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Micropipette + micropipette tips For static bacterial culture and OD measurement
PBS 1x For static bacterial culture and OD measurement
Pipette controller + Pipettes For static bacterial culture and OD measurement
Polyethylene Tubing BD Intramedic 427401
Precision Glide needle 30 G BD Biosciences  305107 Possibly under new catalogue number (305106)
Splinter forceps curved Braun BD312R
Spray bottle (for ethanol) For static bacterial culture and OD measurement
Square cuvettes Elkay 127-1010-400 For static bacterial culture and OD measurement
Sterilgard III Advance Safety Cabinet Baker SG403 Any biosafety cabinet with a UV irridiator
Sterilin 90mm Standard Petri Dish Thermo 101VR20 Any sterile petri dish
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm Braun OK366R Recommended for harvesting of bladder
Surgical Scissors STR S/B 105MM Braun BC320R
Tabletop Centrifuge Eppendorf 5810R Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals
WPA C08000 cell density meter Biowave (Biochrom) 80-3000-45 For static bacterial culture and OD measurement

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References

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