Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av enkelt intracellulær bakteriell samfunn generert fra en Murine modell av urinveisinfeksjon for nedstrøms encellede analyse

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/58829
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1,3
1Infectious Diseases Group, Genome Institute of Singapore, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, National University of Singapore, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Summary

Denne protokollen beskriver en enkel metode for å isolere enkelt, infisert-blæren epitelceller fra en murine modell av urinveisinfeksjon.

Abstract

I denne artikkelen skissere vi prosedyre for å isolere enkelte intracellulær bakteriell lokalsamfunn fra en mus som har blitt eksperimentelt infisert i urinveiene. Protokollen kan grovt inndeles i tre deler: infeksjon, blæren epithelial cellen høsting og munnen micropipetting å isolere personlige infiserte epitelceller. Isolert epithelial cellen inneholder levedyktig bakterielle celler og uten nesten forurensende ekstracellulære bakterier, gjør det ideelt for nedstrøms encellede analyse. Tiden fra starten av infeksjon å oppnå en enkelt intracellulær bakterielle samfunnet er ca 8 timer. Denne protokollen er billig å distribuere og bruker allment tilgjengelig materiale, og forventer vi at det kan også benyttes i andre infeksjon modeller å isolere infiserte enkeltceller fra cellen blandinger selv om de infiserte cellene er sjeldne. Men på grunn av en potensiell risiko i munnen micropipetting, er denne prosedyren ikke anbefalt for svært smittsomme stoffer.

Introduction

Urin skrift infeksjoner (UTIs) er en av de vanligste bakterielle infeksjonene. Anslagsvis 40-50% av kvinner ventes å få minst en urinveisinfeksjon (UVI) under sin levetid1. En av de viktigste agentene til UTI er uropathogenic E. coli (UPEC), som står for over 70% av ukomplisert UTIs2. Videre får omtrent en fjerdedel av de som har en UTI en tilbakevendende infeksjoner, ofte forårsaket av den samme stammen, til tross for aktuelle antibiotika behandling3. Den høye forekomsten av UTI representerer en betydelig belastning på helsevesenet, koster mer enn $2 milliarder i året i USA4. Videre fører bruk av antibiotika til å behandle UTIs også til stigende antibiotikaresistens priser, som er en stor helse bekymring5.

Derfor er en stor innsats plassert i forstå mekanismene som UPEC infiserer urinveiene, samt dens evne til å føre tilbakevendende infeksjoner6,7,8. Spesielt har en musemodell av smitte blitt brukt til å undersøke bakteriell og vert egenskaper som bidrar til UTI8. Denne musemodell har fordelen av å være gjelder for uforandret klinisk stammer isolert fra menneskelige pasienter. Denne modellen har også ført til oppdagelsen av potensielt druggable bakteriell trasé viktig for etablering av UTI, som Type 1 pilus9 og jern oppkjøpet systemer10.

Sammenlignet med disse suksessene i å studere tidlige hendelser i UTI, mangler kunnskap om mekanismene bak tilbakevendende UTI fortsatt11. Én hypotese er at UPEC omgår antibiotika terapi og årsaker tilbakevendende infeksjoner i blæren ved forming intracellulær bakteriell samfunn (IBCs) i blæren epitelceller. IBCs er blitt identifisert i murine modeller av smitte og i human UTI pasienter12,13. Tilstedeværelsen av IBCs i urinprøver fra pediatriske UTI pasienter har vært forbundet med høyere priser regelmessighet14,15. Imidlertid isolere IBCs og studere bakterier i dem har vist seg for å være teknisk utfordrende på grunn av deres sjeldenhet; Det er anslått at en infisert murine blæren vanligvis bare har 10-100 IBCs16. Videre blæren epitelceller er relativt store (50-120 µm)17, gjør det utfordrende for å distribuere fluorescens assistert celle sortering (FACS) gitt at typisk FACS dyser er utformet med diameter på 70 µm eller 100 µm. Dermed er celler så stor som blæren epitelceller ofte fjernet av filtrering før FACS å unngå tilstopping i fluidics.

Våre lab nylig beskrevet en generell og økonomisk metode for å isolere sjeldne infiserte celler fra blandinger som skrapte epitelceller blæren18. For å effektivt isolere IBCs, brukte vi tradisjonelle munnen pipettering. Munnen micropipetting er en teknikk som har lenge vært brukt for micromanipulation av enkeltceller og embryo for nedstrøms19,20,21,22,23, 24 , 25. tradisjonelle munnen pipettering av store flytende volumer (i ml) har ofte vært årsaken til laboratoriet relaterte ulykker og teknikken har med rette blitt utstøtt fra mye av forskningen fellesskapet utenfor tradisjonelle embryologi og enkelt celle programmer. Våre protokollen er inspirert av enkeltcelle versjonene av denne teknikken19,20, som redusere risikoen ved å gi en stor buffer (> 2 mL) luft mellom forsker og prøve sammenlignet med volumet av væske overført (< 1 ΜL). Denne metoden også utnytter mulighetene den munnen micropipetting gir, som oversettes til en lav siste bindet rundt løsning overført og høy renhetsgrad isolert celler. Teknikken bruker billig materialer (<$ 50), og dermed bør være mulig å implementere i alle labs.

Denne visuelle protokollen beskriver våre IBC isolasjon teknikk, gir en referanse for å hjelpe andre forskere søker å gjenskape denne teknikken. Forskeren trenger tilgang til et fluorescerende dissecting mikroskopet (eller lignende utstyr) som kan brukes til å visualisere personlige epitelceller og fluorescerende bakterier under live bildebehandling, med et åpent og tilgjengelig tenkelig scenen for micropipetting (se Tabell for materiale for detaljer om mikroskopet brukes, selv om andre tilsvarende instrument modeller kan også brukes). Mens denne protokollen vil fokusere på IBCs i en murine modell av UTI, skal lignende metoder kunne brukes til å isolere infiserte celler fra cellen suspensjoner i andre modeller av infeksjon.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her om dyr håndtering er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Genome Institute i Singapore og biologiske Ressurssenter for byrået for vitenskap, teknologi og forskning, Singapore.

1. musen infeksjon

  1. Utarbeidelse av glass kapillærene
    1. Lett en åpen flamme kilde (Bunsen brenner eller alkohol brenner).
    2. Holde et glass kapillær med to hender ved pinching fast begge ender, så varme i midten av røret jevnt til glasset går mykt. Rotere av kapillær forsiktig frem og tilbake langs aksen å hjelpe til med oppvarming av glasset.
    3. Fjerne av glass kapillær fra varmekilden og umiddelbart trekke hender fra hverandre, mens grep på begge ender av røret. Den trakk kapillær ideelle fast er 3-5 cm lengre enn en unpulled kapillær å sikre en passende interne diameter for å isolere enkelt blæren epitelceller.
      Forsiktig: Slangen fortsatt varme i en periode, så satt av kapillær på en varme-pengeskap overflate i noen minutter å avkjøle før du fortsetter til neste trinn.
    4. Sjekk for å se om midten av glass kapillær har blitt hul smalere (figur 1A) og at indre av røret er fortsatt (figur 1B). Isolering IBCs brukes en bar størrelse 200-400 µm.
    5. Plukk opp den ene enden av den trakk capillary med én hånd. Et par pinsett med den andre hånden, og bruke den til å plukke opp trakk glasset kapillær i smaleste punktet. Kontroller at tang er utøvet med nok kraft til grep av kapillær fast uten å knuse den.
    6. Bruk en rask krølle forslag i hånden holder tang feste av trakk kapillær på det smaleste punktet å skape micropipetting en munn kapillær.
      Merk: Bruke fingrene i stedet for tang er også akseptabelt, så lenge tilstrekkelig beskyttelse fra glass skår brukes.
    7. Gjenta trinn 1.1.2-1.1.6 minst 4 x mer å produsere nok ekstra micropipetting kapillærene og gir en rekke diametere IBC isolering. Hvis mer enn én infeksjon gruppe er forventet, forberede 5 ekstra micropipetting kapillærene for hver ytterligere smitte.
      Forsiktig: Glem ikke å stenge den åpen flammen.
    8. Plasser trakk kapillærene i en 100 mm Petriskål og utsette parabolen med UV-stråling i 30 min å sterilisere kapillærene.
    9. Sett lokket på Petriskål etter UV sterilisering og lagre Petriskål med kapillærene ved romtemperatur.
  2. Utarbeidelse av katetre før infeksjon
    1. Forberede urin katetre infeksjon som beskrevet i Hung et al.8 og Conover et al.26 minst en dag før infeksjon.
  3. Utarbeidelse av fluorescerende uropathogenic E. coli kultur
    1. Vokse den valgte fluorophore-uttrykke uropathogenic bakterielle belastningen i henhold til etablerte protokoller.
      Merk: Valg av belastning og fluorophore avhenger i stor grad av mikroskopet og stammer tilgjengelig i enkelte laboratorier. I dette eksemplet bruker vi en belastning avledet fra UTI89, som er en kliniske isolere opprinnelig fra en pasient med tilbakevendende cystitis. Dette belastning, SLC-638, bærer en plasmider (pSLC-77) som uttrykker både vsfGFP-9 og kanamycin motstand18. SLC-638 dyrkes i LB sjy ved 37 ° C med 50 µg/mL kanamycin.
    2. Strek belastning SLC-638 på en Luria Bertani (LB)-agar plate med 50 µg/mL kanamycin. Inkuber platen på 37 ° C over natten.
    3. (Valgfritt) Vis platen på dissecting mikroskopet å bekrefte uttrykk for fluorescerende markører før du velger en koloni.
    4. Bruke en bakteriell inokuleringen sløyfe, overføre valgte kolonien til en 125 mL konisk kolbe med 10 mL LB buljong med 50 µg/mL kanamycin. Inkuber kolbe statisk på 37 ° C i 24 timer.
    5. Subkultur bakterier fra denne kolbe tar 10 µL av kultur fra flasken og fortynne den i 10 mL av LB kjøttkraft supplert med 50 µg/mL kanamycin i en fersk 125 mL kolbe (en 1:1000 fortynning). Inkuber denne andre kolbe statisk på 37 ° C i en annen 24 timer.
    6. Nedspinning bakteriell kultur for 5 min 5000 x g og 4 ° C.
    7. Dekanter nedbryting og resuspend bakteriell pellet i kalde PBS på OD600 på 0,5.
      Merk: Selv om det kan variere fra kultur til kultur, vanligvis 1 mL av statisk kultur gir ca 4-5 mL OD600 = 0,5 bakteriell kultur. Det totale volumet av bakteriell inoculum trengs for hver stamme kan beregnes som følger: 50 µL kreves for hver musen og 50 µL er nødvendig for å fylle nålen hodet. Ytterligere 10-20% (minimum 50 µL) av inoculum anbefales å ta hensyn til død volum i sprøyten.
    8. Bruke gjenværende bakteriell blandingen for å bestemme infeksjon titer som beskrevet i Hung et al.8.
      Merk: Dette trinnet kan bli forsinket i noen timer ved å lagre bakteriell blandingen på 4 ° C.
  4. Murine modell av urinveisinfeksjon
    1. Infisere musene som beskrevet av Hung et al.8, med en eksperimentell gruppe for hver stamme av fluorescerende E. coli kultivert i delen 1.3.
      Merk: Se også Conover et al.26 for visuell hjelp.
    2. Merk tidspunktet for bakteriell inoculation for musen eller buret.
    3. Gjenta infeksjoner for hele forsøksgruppen.
      Merk: Infeksjon kateter kan gjenbrukes for alle mus i samme gruppe.
    4. Gjenta trinn 1.4.1-1.4.3 for hver forsøksgruppen planlagt, slik at en fersk kateter og nye smøremidler gel er forberedt for hver gruppe.
      Merk: For eksperimenter med mange dyr, er det best å dele dyrene i grupper av fem og svimlende infeksjoner slik at hver gruppe er infisert ca 30 minutter til 1 time fra hverandre. Dette vil gi nok tid for følgende (avsnitt 2 og 3).

2. blæren Epithelial cellen høsting for å få en celle suspensjon

  1. Høsting og invertere murine blærer
    1. Forberede tre 50 mL konisk rør fylt med 45 mL 70% etanol for sterilisering kirurgisk utstyr.
    2. To av rørene i trinn 2.1.1, plassere et par saks og et par pinsett hver. Plass to par pinsett (en fortrinnsvis smalere og med en avrundet tupp for inversjon av blæren) i tredje røret.
      Merk: Verktøyene i første røret vil bli brukt på det eksterne området verktøyene i andre skal brukes i blæren høsting og to par av tang i siste røret vil brukes i blæren inversjon.
    3. På 6 h post infeksjon, euthanize infiserte mus ifølge institusjonens etablerte IACUC protokoller.
      Merk: Våre IACUC-protokollen krever euthanasia via cervical forvridning mens musen er under narkose (isoflurane).
    4. Legg dyrene flatt på ryggen og bruke sprayflaske fylt med 70% etanol for å sterilisere deres mageområdet.
    5. Med en tang og kirurgisk saks fra første tuben (forberedt i trinn 2.1.2), åpningen lage en liten tverrgående snitt på huden ca 1 cm over den urethral. Utvide innsnitt diagonalt mot øvre lemmer av musen, skape en V-formet kutt langs hele fremre museklikk som viser innholdet i peritoneum. Kontroller at under denne prosessen saksen ikke vil kutte gjennom tarmen museklikk (figur 2A, B).
    6. Bytte til det andre settet med verktøy (forberedt i trinn 2.1.2). Bruker bladene av saksen eller sjakter av pinsett, skyv ned på fett pads nær bekkenområdet av musen.
      Merk: Dette trinnet fører til blæren til stikker utover og sørger for synlighet for høsting.
    7. Grep eksponert blæren på toppen med et par pinsett (figur 2C).
    8. Holde et fast grep på blæren toppen med tang, klippe og gratis blæren fra resten av dyret (skjæring urethra og urinlederne unna) ved hjelp av kirurgisk saks. Ikke slipp tang holder blæren ennå.
    9. Bytte fra saksen til smalere avrundet Tang fra den tredje konisk rør (fra trinn 2.1.2), stikk en aksel av avrundet pinsett inn i åpningen av blæren der det var bare kuttet i forrige trinn (figur 2D). Spissen av avrundet pinsett trygt inn i åpningen av blæren, slipp par tang gripende toppen av blæren og returnere det til andre konisk røret.
    10. Bruker sekundet par av Tang fra tredje røret, forsiktig slå blæren "innenfra og ut", først trekke utenfor slutten av munningen av blæren fra avrundet tang (figur 2D, pil 1) og guiding det rundt og over andre spissen av avrundet tang (figur 2D, pilen 2).
      Merk: Handlingen kan sammenlignes med å fjerne en sokk fra en fot og dra den over den andre.
      1. Under inversjon prosess, opprettholde de første avrundede par tang nesten helt lukket. Dette gir nok bevegelsesfrihet å trekke blæren av fra første skaftet av avrundet pinsett, men også bringer andre skaftet av avrundet pinsett nærmere første og tillater blæren overføres lett. Resultatet av dette trinnet er at blæren bør ende opp blir omvendt og spissen av andre akselen av de første par pinsett (figur 2E).
      2. Bruker sekundet par av tang, forsiktig lokke invertert blæren tipset tang i 1 mL av kaldt PBS.
        Merk: (Valgfritt) Dette er anledning til å ta bilder av hele invertert, infiserte blæren overholde de generelle frekvens og distribusjon av IBCs, eventuell.
    11. Gjenta trinn 2.1.1-2.1.10 for hver blæren i forsøksgruppen (til maksimalt fem dyr).
  2. Blæren epithelial celle skraping
    1. Bruker to clean par pinsett, forsiktig skrape utsiden av invertert blæren (som interne epitelcellelaget). Omkringliggende PBS skal vises cloudier som skraping inntektene og epitelceller slippes PBS løsningen.
    2. (Valgfritt) Visuelt Bekreft at blære skrape har lansert celler til løsning ved hjelp av dissecting mikroskop. Figur 3 A, B). PBS skal vises skyet for det blotte øye, og skrapte personlige blæren epitelceller sees på 10 x forstørrelse.
    3. Gjenta trinn 2.2.1-2.2.2 for hver høstet blæren fra trinn 2.1.

3. intracellulær bakterielle samfunnet (IBC) isolasjon: munnen pipettering av IBCs

Merk: Alle metodene som er beskrevet i denne delen har gjennomgått en institusjonell risikovurdering. Munnen pipettering bærer risikoen ved inntak av løsningen som overføres. Denne risikoen er stort sett motvirket av nanoliter volumer som bruker denne protokollen, og vi anbefaler at alle brukere av protokollen betale akt de forholdsregler og praksis notater oppført her og i diskusjonen.

  1. Etter cellene har vært scraping i PBS, sette opp munnen micropipetting apparatet (Figur 3C).
    1. Inn gummi pluggen (hvit slutten) av aspirator rør tykkere slutten av trakk glasset kapillær (unpulled slutten).
    2. Den smale enden av en 1 mL pipette tips inn den andre åpne (rød) enden av aspirator røret, slik at det er trangt.
    3. Sett den smale enden av en 2 mL aspirating pipette inn i den åpne, bredere enden 1 mL pipette tips, igjen slik at det er en tett passform.
      Merk: Resulterende oppsettet kan forskeren munnen pipette fra bredere, åpne slutten av den aspirating pipette opprette en mild sugekraft kraft fra den smale enden av kapillær rør i den andre enden av apparatet.
    4. Teste den endelige munn micropipetting apparatet bruker en 100 mm Petriskål inneholder ferske deionisert vann. En liten suge handling på den åpne enden av aspirating Pipetter (lik du nipper til en drink gjennom en halm) bør øke nivået av væske i av kapillær, men ikke forårsake deionisert vann til overflyt i aspirator røret. Bruk én hånd for å styre kapillær røret, mens derimot for å justere plasseringen av Petriskål.
      Merk: Styrken på sugekraft kreves for munn-pipettering en enkelt IBC varierer blant forskere. Men anbefales det at hver forsker forsøker denne teknikken starter med en svak sugekraft og Øk det sakte hvis ingen væsken flyter opp av kapillær. Det er ikke behov for en større enn suge på et strå drikke. Hvis av kapillær ikke synes å plukke opp væske under testen i trinn 3.1.4, er det mulig at enten av kapillær eller aspirating røret er okkludert og må erstattes. Videre anbefaler at alle nye forskere første praksis kontrollere sug i munnen pipettering apparatet bruker sterilisert vann. I tillegg Merk at kontroll av volumet tatt opp av munnen pipettering apparatet ved hjelp av forskerens tungen. Tungen kan fint justere styrke sugekraft brukt, samt opptre som en Nødstopp.
    5. Etter å oppnå vellykket opptak av væske, teste muligheten for å utvise dem fra av kapillær ved forsiktig blåse i den åpne enden av aspirating pipette. Sikre at ingen bobler opprettes under utviste væske for å hindre forurensning av IBCs under trinn 3.5.
      Merk: Som med suging, vil styrken av positivt trykk av forskeren å utvise IBC inn i sentrifuge røret variere blant forskere. Det anbefales for forskere ny på denne protokollen til praksis trinn 3.1 noen dager før den faktiske infeksjonen. Et forslag for praktiserende munnen micropipetting er å øve overføre små mengder sterilisert vann blandet med noen dråper mat fargestoff (for synlighet) bruker munnen brønnene apparatet.
  2. Plasser skrapte celle suspensjon under dissecting mikroskopet og identifisere IBCs som store fluorescerende aggregater (Figur 3A, B). Den ideelle forstørrelse er 20-40 x. Dyppe fine slutten av glasset kapillær i en fersk tube PBS for 1 s å redusere opptaket av uønskede volum gjennom kapillære handling.
  3. Se gjennom mikroskopet, identifisere IBC rundt og sakte bringe den åpne enden av kapillarrør mot IBC. Bruke fine slutten av glasset kapillær for å feie vekk ekstra celler i hver IBC å hindre aspirasjon av to eller flere celler, eller bryte fra hverandre større mengder av celler.
  4. Mens du ser gjennom mikroskopet, bruk en liten sugekraft kraft på enden (aspirating pipette) av munnen micropipetting apparater å veilede IBC i glass kapillær.
  5. Etter plukke opp IBC, flytte av kapillær til en tom 1,5 mL sentrifuge rør og bruke en liten positivt trykk å utvise slippverktøyet og IBC inn i sentrifuge røret (Figur 3D).
  6. Gjenta trinn 3.3-3.6 på mange IBCs er nødvendig fra gjeldende blæren, før du fortsetter til neste blæren. Endre aspirating Pipetter og kapillærer ofte å hindre oppbygging av spytt.
    Forsiktig: Når du arbeider med smittsomme (eller klinisk) stammer av bakterier, Overvåk konstant nivået av løsning av kapillær. Ikke la nivået av væske blir pipetted overløp fra kanten av kapillær inn i aspirator røret. Hvis dette skjer, umiddelbart bytte til en annen aspirator rør, og forkaste forrige opp.
  7. Gjenta trinn 3.2-3.6 på alle høstet blærer eller til tilstrekkelig antall biologiske prøver er samlet for forsøksgruppen.
  8. (Valgfritt) Gjenta trinn 3.6 og 3.7 til alle eksperimentelle grupper (eller mus) ha blitt euthanized og tilstrekkelig biologiske prøver har vært høstet fra hver gruppe.

Representative Results

Bortsett fra bekreftelse (Figur 3D) av tilstedeværelsen av en enkelt isolert IBC i samlingen røret via dissecting mikroskopet, kan renheten av isolerte IBC også bli bekreftet av AC confocal mikroskopi. Som vist i Figur 4A, isolerte cellene skulle besudle både E. coli og uroplakin, og er den forventede størrelsen for IBCs (50-120 µm)17. Videre er E. coli flekker ikke tilstede i omkringliggende væsken. Basert på våre data, er mer enn 90% av celler isolert med denne teknikken IBCs18. Etter isolasjon, kan tilstedeværelse og levedyktigheten til bakterieceller i individuelle IBC bekreftes gjennom kolonien danner unit (CFU) nummerering (Figur 4B) eller kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR) for genomisk ekvivalenter ( Figur 4 C). Figur 4C demonstrerer også at infisert epitelceller isolert med samme protokoll ikke har målbare mengder av bakterier. Basert på disse dataene, anslår vi at utvalget av CFUs i en enkelt IBC er 102-10-3 i murine modell av urinveisinfeksjon. En av de viktigste målene for enkelt IBC isolasjon er å utføre nedstrøms analyser som RNA sekvensering. For å bekrefte at vår isolasjon metoden kunne få RNA fra bakterier i IBCs for analyse, vi utført kvantitative omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR) kvantifisering av tre gener (16S, cyoB, og frdA) for en rekke individuelt isolert og grupperte IBCs (Figur 4D). Alle dataene i Figur 4 har blitt tilpasset med tillatelse fra Duraiswamy et al.18. En oversikt over skjematisk av våre IBC isolasjon protokollen kan ses i figur 5, som er gjengitt fra Duraiswamy et al.18.

Figure 1
Figur 1 : Håndtappet kapillærene beholde smale åpninger. (A) prøver av håndtappet kapillær rør vises på en svart bakgrunn for kontrast. Fra bunn til topp, en unpulled kapillær, en kapillær som var ikke i tilstrekkelig grad, vises det en kapillær som kan brukes til enkelt blæren epithelial cellen høsting og en kapillær som ble trukket for tynn (og dermed adskilt i to deler). En 15 cm hersker plasseres nederst på bildet for skala. Det estimerte punktet for festing av av brukbare kapillær angis på figuren av den røde pilen. (B) bilde tatt med dissecting mikroskop bekrefter hul interne diameteren på en trakk kapillær (nederst). En unpulled kapillær er plassert over å demonstrere den relative størrelse forskjellen av to kapillærer. Skala bar = 4.0 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Disseksjon av musen å høste blæren epitelceller. (A) et bilde av en mus med hvite linjer til å angi anslått plassering og vinkel på snitt til å avsløre murine bukhulen og blære. (B) et bilde av den utsatte musen bukhulen etter snitt. (C) et bilde av den utsatte blæren (rød pil) stikker fra mellom fett pads. (D) et bilde av murine blæren med spissen av Tang inn lumen, med piler for å angi retning for å invertere blæren. Blæren trekkes først litt utover, deretter rundt og av første skaftet av pinsett. Skiltene av bevegelse for begge handlingene er angitt av hvite pilene nummerert 1 og 2. (E) et bilde som viser den endelige plasseringen av invertert blæren satt inn andre skaftet av pinsett. Skaft av Tang er merket i både panelene D og E med røde piler og tekst. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : IBC høsting fra blæren celler. (A) en infisert og invertert blæren i kalde PBS løsning før cellen skraping. (B) et bilde viser skrapte blæren celler sett under et mikroskop. IBCs kan identifiseres som store grønne fluorescerende mengdefunksjoner i både bilder (se røde piler). (C) et bilde av det fullførte munnen micropipetting apparater. Den aspirating pipette, pipette tips, aspirator rør og trakk kapillær tube identifiseres med nummererte piler som vist til høyre. (D) et bilde av en enkelt isolert IBC innenfor en 1,5 mL samling rør (uthevet i rødt). Skala barer (som angitt) representeres av hvite linjer i paneler A, B og D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Høstet IBCs er rene og kan brukes til nedstrøms. Dette tallet er endret med tillatelse fra Duraiswamy et al18. (A) bilder av to isolerte GFP-positive celler som var farget med anti-uroplakin og anti -E.coli antistoffer. Den første cellen (IBC 1) har bilder av individuelle kanaler (på lav-forstørrelse) til venstre, og en høy forstørrelse sammenslåtte bildet er til høyre. Den andre cellen (IBC 2) vises i forstørring flettede og individuelle kanaler. Skala barer er angitt. DNA er farget med 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og representert i den blå kanalen. Anti -E. coli er farget med en sekundær antistoff konjugert til fluorescein isothiocyanate (FITC) og representert i den grønne kanalen. Anti-uroplakin er farget med en sekundær antistoff konjugert til tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) og representert i den røde kanalen. (B) bakteriell CFUs fra isolert IBCs. IBCs var behandlet umiddelbart, eller ruges i 0,1% Triton-X for 10 eller 30 min. samlet CFU teller personlige IBCs isolert fra n = 3 separate forsøk er vist. Grensen for påvisning = 0,7 Logg10 CFUs/IBC. Røde prikkene plottet på grensen for påvisning angir prøver som ingen kolonier ble gjenopprettet. Alle IBC inneholder prøver er ikke vesentlig forskjellig (p > 0,05, Mann-Whitney test); infisert epitelceller er signifikant forskjellig fra IBC (10 min) data (p < 0,001, Mann-Whitney test). (C) qPCR kvantifisering av bakterier på individuelle IBCs og infisert epitelceller etter en 10 min inkubasjon i 0,1% Triton-X (*, p < 0,0001, Mann-Whitney test, n = 4). Grensen for påvisning = 1,18 Logg10 bakteriell genomet ekvivalenter/IBC. Røde prikkene angir prøver som ingen kolonier ble gjenopprettet på titering i panelet B. (D) kvantifisering av 16S rRNA, cyoB, og frdA gener for varierende antall individuelt isolert og grupperte IBCs (n = 1 eksperimentet, som hver punktet viser middelverdien av 3 teknisk replikat). NC = ingen DNA negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : En skjematisk og dens tilknyttede bilder som representerer isolasjon IBCs via munnen micropipetting fra infiserte mus blærer. Dette tallet er gjengitt fra Duraiswamy et al.18. (A) A høstet hele blæren; (B) en omvendt hele blæren utsette GFP uttrykke IBCs; (C) et nærbilde av kanten av en scraping blæren viser individuelle IBCs i suspensjon i tilstøtende buffer; (D) en enkelt isolert IBC pipetted inn i et rør. Røde piler i B-panelet viser eksempler på GFP-positive IBCs på luminal overflaten av blæren. Den røde prikkede linjen i C-panelet angir høyre kant av invertert blæren (angitt som "BL"); røde piler i C-panelet viser tydelig personlige GFP-positive epitelceller som har vært scraping av blæren overflaten. Hvite stiplede linjen i D-panelet angir en micropipetted sub-mikroliter dråpe som inneholder en isolert IBC, som angis av en hvit pil. Skalere barer = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Protokollen vi har beskrevet gir isolasjon av enkelt IBCs fra en murine modell til UTI. Denne protokollen isolerer IBCs som inneholder levedyktig intracellulære bakterier, som kan verifiseres ved dyrking for CFU. Protokollen resultatene i intracellulære bakterier fra IBCs med liten forurensning av ekstracellulære bakterier, slik at ytterligere karakterisering av både bakterier og vert celle fra en IBC (Figur 4C). Vi viser også at bakterier fra en enkelt IBC kan brukes i nedstrøms programmer som qPCR (Figur 4C), tyder på at våre teknikken kan brukes å behandle IBCs for andre i vitro analyser. Ved pooling bakterier høstet fra så lite som 5 IBCs, demonstrerer vi ytterligere vår evne til å utføre qRT PCR analyse på tre bakteriell gener, antyder at god kvalitet RNA kan høstes fra bakterier i vår isolerte IBCs (Figur 4D). Kombinert, angir dataene vi har vist at utføre genomet hele RNA analyse (for eksempel RNA sekvensering) på enkelt IBCs kan være mulig med denne isolasjon teknikken.

I denne protokollen, har vi fokusert på 6 h tidspunktet for det er da IBC tall topp i blærer svart 6 mus infisert av UTI8927. Videre har vi også brukt en statisk bakteriell kultur system for å forbedre nivået av type 1 pilus uttrykk i UTI89. Uttrykk for type 1 pilus er avgjørende for E. coli å knytte til og infisere blæren epitelceller28. Men denne uttrykket er strengt regulert29 og miljømessige signaler er kjent for å endre den30. For å opprettholde en konsistent infeksjon fenotypen og tilstrekkelig antall IBCs, anbefaler vi å bruke en 2 x 24 h statisk bakteriell kultur (litt modifisert Hung et al.8) og 6 h infeksjon tidspunktet når arbeider med tidligere testet E. coli stammer som NU14 og UTI8928,29. Det er imidlertid mulig at disse variablene må justeres i andre UTI stammer eller andre mus stammer få ideelt antall IBCs fra hver infeksjon.

Mens protokollen Hung et al.8 bruker bare kvinnelige mus, vært andre etablerte protokoller for å etablere urinveisinfeksjon i mannlige mus rapportert31. I denne modellen fulgt cystitt i mannlige mus også IBC veien. Blærer mannlige og kvinnelige mus er lik i størrelse, forventer vi at våre IBC isolasjon protokollen kan brukes på infiserte mannlige mus også.

Den relativt enkle teknologien benyttet i denne protokollen sikrer også at den kan brukes i de fleste laboratorier. En av de viktigste trinnene involvert i denne protokollen er det å trekke glass kapillærer å opprette microcapillaries for å velge celle interesse. Dette trinnet gir fleksibilitet i diameter på microcapillaries laget, og dermed metoden utvides til flere ulike celletyper. Men på grunn av iboende variasjoner i å lage disse kapillærene, må hensyn tas for å sikre at den endelige diameteren i en brukbar rekkevidde. Hvis kapillærene er for smal, de klarer ikke å plukke opp cellen rundt, men hvis de er laget for bred, flere celler kan velges i én omgang. Videre bærer bruk av åpen flamme under av kapillær trekke en iboende risiko for forbrenninger og brann, så hun forsøker å skape microcapillaries burde ta for å forhindre slike hendelser oppstår. For å redusere variasjon som åpen ild risikoen involvert i å gjøre disse kapillærene, hun kunne gjøre bruk av tradisjonelle brønnene trekke maskin, som brukes for elektrofysiologiske eksperimenter (f.eks PC-100, Narishige gruppe). Disse maskinene gjøre bruk av tyngdekraften eller robot-plattformer for å trekke kapillærene, de kan tilpasses for å møte behovene til infeksjon modellen. Imidlertid menes rekke brønnene trekke maskiner tilgjengelige at personlige forskeren må gå gjennom del prøving og feiling å bestemme riktig siste kapillær diameteren for bruk med denne protokollen.

Presentert protokollen gjør bruk av bakterier uttrykke en fluorescerende kode å visuelt identify IBC. Derfor, denne teknikken er begrenset av forskernes muligheten til å endre genetisk smittsomme organismen. Spesielt for UPEC, har IBC-forming stammer som CFT073 og NU14 blitt vellykket forvandlet med GFP-uttrykke plasmider32,33,34; disse skal derfor være brukbare i samme protokoll. Basert på musen blæren (70 mm2)35, lengden på individuelle epitelceller (50-120 µm)17og hyppigheten av IBCs i en enkelt blæren16, et konservativt anslag for forekomsten av IBCs er om 1 i 1000 cellene (eller 0,1%). Dette anslaget viser verktøyet av vår celle isolasjon protokollen å målrette sjeldne hendelser. Presisjonen for celleutvalget gjennom våre protokollen og rekke kapillær diameter som kan trekkes tyder på at denne protokollen kan brukes til å isolere intracellulære bakterier fra andre i vivo og in vitro modeller av infeksjon. Faktisk har vi brukt denne teknikken for å isolere infiserte kulturperler blæren epitelceller (data ikke vist).

En av de mer teknisk utfordrende trinn i protokollen er invertere blæren for å avsløre epitelceller for skraping. Vi har funnet at det er også mulig å lage et snitt i blæren til splay det for skraping. Imidlertid grunn bekymre burde være tatt å redusere skadene til epitelceller av blæren under prosessen med å klippe det åpen. ideelt skal en enkelt kutt benyttes for å splay blæren open. I tillegg bør kuttet gjøres i kalde PBS, å forhindre tap av celler eller blæren vev under prosessen.

Munnen pipettering IBCs i denne protokollen gir større kontroll over cellen utvelgelsesprosessen, samt begrense det siste bindet løsning overført cellen. Fin kontroll og store separasjon av løsning fra forskernes munn også maksimerer sikkerhet forskeren, som volumene overføres i nanoliter til mikroliter område. Vår erfaring med moderne brønnene er derimot at det pleier å overføre mer omkringliggende væske og celler med IBC, kan føre til forurensning med ekstracellulære luminal bakterier. Våre funn at munnen pipettering gir en høyere ytelse over andre enkeltcelle isolasjon metoder har også rapportert andre labs22,23,24. Bortsett fra enkelt celle isolasjon, har munnen pipettering selv brukt i én celle electroporation for neurons25, som ytterligere viser verktøyet og minutt kontrollen som trente forsker kan oppnå med teknikken. Imidlertid sikkerhet er av primær betydning, og vi foreslå potensielle ytterligere tiltak som kan tas avhengig av patogener brukes: (i) forlengelsen av luft buffer mellom forskeren og biologisk materiale, for eksempel ved å bruke en aspirating Pipetter med større volum (f.eks 5 mL) eller (ii) å legge et fysisk filter som bomull i aspirating pipette å fungere som en ekstra sperre.

I tilfeller der en risikovurdering fører til konklusjonen at munnen pipettering er fortsatt risikabelt kan kommersielt tilgjengelig robot setups (som de som brukes for nanoinjections) kombineres med de andre delene av vår teknikk en sikrere metode for isolere infiserte celler fra blandet populasjoner. Det bør bemerkes at vår opplevelse med en robot micromanipulator har vist en redusert rate på IBC isolasjon sammenlignet munnen pipettering, store intra eksperimentelle variasjonen i blæren epithelial Cellestørrelse gjør det utfordrende for brukeren av en robotarm å bestemme kraften som er nødvendig å plukke opp enkelt IBCs. Likevel er det fortsatt en levedyktig, men dyrere, alternativ for dem som arbeider med svært smittsomme stoffer av sykdom.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av National Research Foundation, Statsministerens kontor, Singapore, under sin NRF forskning Fellowship ordningen (NRF prisen nei. NRF-RF2010-10); Singapore helsedepartementets National Medical Research Council (NMRC/CIRG/1358/2013); og Genome Institute i Singapore (GIS) / Agency for vitenskap, teknologi og forskning (A * STAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL eppendorf tube For static bacterial culture and OD measurement
100% ethanol For Alcohol Burner
15 mL conical tube For static bacterial culture and OD measurement
1 mL Tuberculin Syringe BD Biosciences  302100
3% Bacterial Agar For static bacterial culture and OD measurement
70% ethanol For static bacterial culture and OD measurement
Aesculap anatomic forceps Braun/Kruuse BD222R For initial dissection of mouse (skin, fascia)
Alcohol Burner Wheaton 237070
Aspirating pipette BD Biosciences  357558
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177
Bacterial loops For static bacterial culture and OD measurement
Benchtop centrifuge Eppendorf 5424 Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes
Conical flasks For static bacterial culture and OD measurement
Digital camera for microscope Olympus DP71 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Glass Capillaries Kimax 6148K07
Iris Scissors STR SS 110MM Braun BC110R
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein Animal Health 29405
Kanamycin Sulfate Calbiochem 420311 For static bacterial culture and OD measurement
LB broth (Miller) Thermo/Gibco 10855021 For static bacterial culture and OD measurement
Light source unit for microscope Olympus LG-PS2 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Lubricant  KY Any similar commercial medical lubricant will suffice
Macro fluorescence microscope Olympus MVX10 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Micropipette + micropipette tips For static bacterial culture and OD measurement
PBS 1x For static bacterial culture and OD measurement
Pipette controller + Pipettes For static bacterial culture and OD measurement
Polyethylene Tubing BD Intramedic 427401
Precision Glide needle 30 G BD Biosciences  305107 Possibly under new catalogue number (305106)
Splinter forceps curved Braun BD312R
Spray bottle (for ethanol) For static bacterial culture and OD measurement
Square cuvettes Elkay 127-1010-400 For static bacterial culture and OD measurement
Sterilgard III Advance Safety Cabinet Baker SG403 Any biosafety cabinet with a UV irridiator
Sterilin 90mm Standard Petri Dish Thermo 101VR20 Any sterile petri dish
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm Braun OK366R Recommended for harvesting of bladder
Surgical Scissors STR S/B 105MM Braun BC320R
Tabletop Centrifuge Eppendorf 5810R Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals
WPA C08000 cell density meter Biowave (Biochrom) 80-3000-45 For static bacterial culture and OD measurement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  2. Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).
  3. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).
  4. Foxman, B., Barlow, R., D'Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs. Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).
  5. Zowawi, H. M., et al. The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology. Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).
  6. Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections. Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).
  7. Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract. Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).
  8. Hung, C. -S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).
  9. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science Translational Medicine. , (2011).
  10. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. PLoS Pathogens. , (2009).
  11. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).
  12. Hunstad, D. A., Justice, S. S. Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli. Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).
  13. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Medicine. , (2007).
  14. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  15. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  16. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection. Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).
  17. Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal). International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).
  18. Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir. Infection and Immunity. , (2018).
  19. Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).
  20. Tang, F., et al. Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres. PLoS One. , (2011).
  21. Wells, J. M., Melton, D. A. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development. 127, 1563-1572 (2000).
  22. Guo, H., et al. Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing. Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).
  23. Zhao, R., et al. The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
  24. Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).
  25. Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2017).
  26. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), 52892 (2015).
  27. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
  28. Mulvey, M. A., et al. Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli. Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).
  29. Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).
  30. Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media. Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).
  31. Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).
  32. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  33. Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli. Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).
  34. Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073. Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).
  35. Jost, S. P. Postnatal growth of the mouse bladder. Journal of Anatomy. 143, 39-43 (1985).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 146 urinveisinfeksjon encellede isolasjon intracellulær bakteriell samfunn uropathogenic Escherichia coli Trouble UTI
Isolering av enkelt intracellulær bakteriell samfunn generert fra en Murine modell av urinveisinfeksjon for nedstrøms encellede analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, E., Chee, J. L. Y.,… More

Yang, E., Chee, J. L. Y., Duraiswamy, S., Chen, S., Lees, K., Chen, S. L. Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis. J. Vis. Exp. (146), e58829, doi:10.3791/58829 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter