Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sæd samling av differensial kvalitet bruker tetthet gradert sentrifugering

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/58833
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Poultry Science, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

I dette papiret, vi tar sikte på å beskrive tetthet gradert sentrifugering teknikken og dens anvendelse i sperm fysiologi forskning.

Abstract

I seksuell reproduksjon, en mannlig Kjønnscelle eller sperm celle sikringer med en kvinnelig Kjønnscelle å få befruktning. Et stort antall sædceller med gjødsling evne kreves imidlertid å samhandle med en kvinnelig Kjønnscelle å sikre befruktning. Slik er gjødslende evne til individuelle sædceller avgjørende for vellykket reproduksjon. Tetthet gradert sentrifugering blitt benyttet i flere tiår som reproduserbare, rask, effektiv og ekstremt fleksibel metode for å samle inn bare høy kvalitet sperm i Assistert befruktning. Protokollene vi beskrevet her fokus på utnyttelse av usammenhengende Percoll tetthet gradert sentrifugering (PDGC) teknikken å isolere tre forskjellige populasjoner av hane sæd ved sin kvalitet. Vi kunne samle lite, middels og høy kvalitet sperm. Vi beskriver også reproduserbar protokoller som innebærer avgjørende fruktbarhet potensialet av sæd ved å vurdere deres levedyktighet, mobilitet og penetrability. Samling av sæd av kvaliteten bruke PDGC teknikken ville være nyttig å nøyaktig og grundig karakterisere sperm med differensial fruktbarhet potensielle.

Introduction

I virveldyr gjennomgå mannlige gameter intens seleksjonspress; Derfor er reproduktive fitness om menn avgjørende for å oppnå vellykket befruktning. Menn av Alle virveldyr artene må kunne produsere sædceller i store mengder og av tilstrekkelig kvalitet for å møte behovene til befruktning. Sædceller, har både en sædceller hode og en flagell, er de mest polarisert cellene i kroppen. De er også svært heterogen i kvaliteten på sæden (levende og døde morphologically normale og unormale og immobile, lav mobile og høy mobil), som er avdekket gjennom variasjonen i reproduktive effektiviteten av menn. Jo større andel av høy kvalitet sperm, mengde parring må vellykket gjødsle ovum. Men for å oppnå fruktbarhet, morphologically normal sædceller stole på propulsive styrker generert av deres flagella å komme til stedet for befruktning så vel som å trenge gjennom zona pellucida1 (ZP; i pattedyr) eller indre perivitelline Lag2 (IPVL, fugler og reptiler) av egget etter naturlig mating eller kunstig insemination (AI). Bestemme sperm kvalitet er nødvendig for bruk i assistert reproduktive teknologier3 (ART) og utvalg av avl menn i AI programmer4. Derimot, avhengig suksess for kunst utelukkende av nøyaktig vurdering av kvaliteten. En rekke laboratorietester er utviklet for å fastslå funksjonelle egenskaper av sæd. De viktigste parameterne er sperm morfologi, levedyktighet, mobilitet, capacitation (avian sperm krever ikke capacitation5), acrosome reaksjon (AR; exocytosis og utgivelsen av et proteolytisk enzym fra acrosome av sæden hodet), sperm penetrasjon ZP eller IPVL, og gjødsling6,7,8,9,10,11. Tiltak av fruktbarhet alene gi ikke en nøyaktig vurdering av gjødslende evnen til en sæd befolkningen11. Tiltak av flere hendelser som førte til befruktning av et egg gir en riktig representasjon av ytelsen til enkelte spermatocytes7.

Metodene som er utviklet for å måle sperm funksjon er primært artsspesifikke. For eksempel i avian sperm er levedyktighet, mobilitet og penetrasjonen av IPVL de vanligste parameterne brukes til å vurdere sperm kvalitet8,11,12. Antall levende sædceller i ejakulere spiller en avgjørende rolle for overlevelse av spermier fordi tilstedeværelsen av et stort antall døde sperm i sæd påvirker kvaliteten på sæden. Dette øker produksjonen av reaktive oksygen arter i sæd til oksidative skader den levende sædceller13. Sperm mobilitet, kapasiteten for flagellar flytting av avian sæd mot motstand ved kroppstemperatur, er kjent for å spille en direkte rolle i å bringe om befruktning8. Det er godt etablert at mobilitet er positivt korrelert med fruktbarhet og er derfor en primær determinant av fruktbarhet8. En mobil sperm må imidlertid også ha muligheten til å gjennomgå en AR og trenge IPVL11. IPVL penetrasjon analyser ta hensyn til alle sædcellene som deltar i prosessen med befruktning11.

Anvendelsen av kunst, er ejakulerer vanligvis behandlet for å maksimere konsentrasjonen av høy kvalitet sperm og minimere konsentrasjon av lav kvalitet sperm. Etter samling av sæd, kan andelen av høy kvalitet sperm bli beriket gjennom sperm separasjon prosedyrer brukt i både industri og forskning. Mange av disse prosedyrer har blitt utviklet, med respektive fordeler og begrensninger, men alle utnytte heterogene natur sædcellene å samle bare sperm med høy gjødslende evne. Disse prosedyrene omfatter sperm overføringsmetoder, tilslutning kolonnen filtrering og tetthet gradert sentrifugering (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. blant de tilgjengelige teknikkene, DGC er funnet for å være svært enkel, repeterbare, kostnadseffektiv og effektiv hjelpe maksimale høykvalitets sæd til bruk i kunst med mål om å maksimere sjansen for befruktning14 , 15. I tillegg DGC er ikke skadelig for sperm celle membran. Derimot sperm overføringsmetoder samle bare gradvis mobile sperm18,19, men mengden av sæd samlet er svært lav, noe som gjør det ineffektivt å samle inn store mengder sæd18, 20. tilslutning kolonnen filtrering er svært effektiv i filtrering ultramobile sperm fra sæd17; men pleier det å være skadelig for sperm membraner20,21.

I DGC teknikken er mest brukte underlaget for å generere tetthet graderingen Percoll, som består av kolloidal silika partikler belagt i polyvinylpryrolidone. Percoll tetthet gradert sentrifugering (PDGC) kan enten være kontinuerlig eller usammenhengende men usammenhengende graderinger brukes vanligvis for høy avkastning isolering av svært mobile sperm13,16,20. I en usammenhengende gradering flyter lavere tetthet media over høyere tetthet medier, lage en gradering som øker tetthet fra toppen til bunnen av en konisk rør. Dette skaper grenser på grensesnittet mellom to media av ulik tetthet. Effektiviteten av PDGC er avledet fra to faktorer: 1) propulsive evne til individuelle sperm celler og 2) tendensen av sædceller med høy strukturelle integritet å ha en økt tetthet. Spermier med høyere mobilitet er bedre i stand til å krysse fra lavere tetthet media og trenge inn i en høyere tetthet media. Lavere mobilitet sæd er mer sannsynlig å bli fanget på grensen laget av grensesnittet mellom media av ulik tetthet. Sædceller med høy strukturelle integritet og mobilitet pleier å ha en høyere tetthet enn døde, unormal eller lav mobile sædceller. Når sentrifugalkraften brukes i PDGC, forenkler dette flytting av sæd med forskjellige tettheter til sitt respektive i forløpningen.

I generell fremgangsmåte når PDGC er utført, den myke pellet av spermier med høy fruktbarhet potensielle nederst konisk røret samles og resten er forkastet. Men er en underutnyttet fordel av denne teknikken dens evne til å skille sædceller i flere grupper basert på kvalitet forskjellene. Til forskningsformål tillater separasjon av sæd ved grad av kvalitet utnytte PDGC teknikken studie av kvaliteten som gjelder fysiologiske, metabolomic og proteomic forskjeller. Her, ønsker vi å detalj hvordan denne teknikken kan brukes til å skille sperm kvalitet, i tillegg til å vise disse forskjellene i kvalitet, bruk av tidligere etablert eosin-nigrosin viktig flekker for levedyktigheten Accudenz analysen for mobilitet og sperm-IPVL samhandling analysen for penetrability.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Georgia.

1. vask med tradisjonelle sentrifugering

  1. Forberede fosfat buffer løsning (PBS). Legge 8.0 g av NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 og 0,24 g KH2PO4 800 mL destillert vann (dH2O). Justere pH 7,4 bruker 0,1 N HCl og få løsningen til 1 L bruker dH2O.
  2. Forberede motilitet buffer. Legge 6.5 g av NaCl, 4.5 g av glukose, 0.444 g av CaCl2 og 11,5 g n - tris-[hydroxymethyl] metyl-2-amino-ethanesulfonic syre (TES) til 800 mL av dH2O. justere pH 7,4 med 1 M NaOH og ta løsningen å 1 L bruker dH2O.
  3. Pipetter 0,5 mL av sæd inn i et polypropylen microcentrifuge rør. Tilsett 1,0 mL av PBS og bland forsiktig.
  4. Sentrifuge 1500 x g i 10 min ved romtemperatur (RT) og kast nedbryting. Resuspend sperm pellets med PBS opptil 1,5 mL.
  5. Sentrifuger 1500 x g i 10 min på RT. Resuspend sperm pellets med motilitet bufferen til 0,5 mL.

2. utfører PDGC teknikken

Merk: Utføre hele prosessen med PDGC ved romtemperatur.

  1. Gjøre 3.0 mL av 1,08 g/mL og 1,07 g/mL Percoll i to separate rør.
    1. Legg 1.712 mL 1.13 g/mL i en ren test tube, opprinnelige Percoll til 0,3 mL av 1,5 M NaCl løsning. Legg 0.988 mL av dH2O og bland ved mild inversjon å 3.0 mL av en 1,08 g/mL tetthet løsning.
    2. Legg 1.482 mL 1.13 g/mL i en ren test tube, opprinnelige Percoll til 0,3 mL av 1,5 M NaCl løsning. Legg 1.218 mL av dH2O og bland ved mild inversjon å 3.0 mL av en 1,07 g/mL tetthet løsning.
  2. I en ren reagensrør, fortynne 1,0 mL av sæd eksempel 1:2 med 2.0 mL PBS. Bland forsiktig ved pipettering.
  3. Pipetter 3.0 mL 1,07 g/mL tetthet løsningen i et sterilt 15 mL konisk rør. Nøye Pipetter 3.0 mL 1,08 g/mL tetthet løsningen under 1,07 g/mL tetthet løsningen. Kontroller at de to lagene ikke blander. En lang-form (9 in) Pasteur pipette kan gjøre dette trinnet enklere.
  4. Pipetter 3.0 mL utvannet sædprøve overtop av PDG. For å sikre at sæden ikke blandes med PDG, forsiktig tilt konisk røret som inneholder PDG i 45° vinkel. Pipetter prøven langs røret og la den flyte ned røret og over PDG.
  5. Forberede en tom tube å matche masse PDG med overlappet prøve. Sentrifuge både rør på 1500 x g for 20 min. være nøye med å opprettholde usammenhengende graderingen ved overføring rørene fra benken til balansen og deretter til en sentrifuge.
    Merk: Ikke bruk bremsen på slutten av sentrifugering.
  6. Observer resultatene. Kontroller at tre distinkte sæd lag har dannet i røret, som vist i figur 1.
  7. Sug opp isolert sæd lag med en pipette. Samle det øverste laget av sæd først, midten laget andre og siste hard pellet nederst på røret. Overføre til en ren og sterile polypropylenmicrocentrifuge tube.
  8. Fortynn hver prøve til 1,5 mL med PBS. Sentrifuge 1500 x g i 10 min.
  9. Hell av nedbryting. Rekonstituer sperm pellets med motilitet buffer av mild pipettering.
    Merk: Alternative tettheter kan brukes etter etterforsker behov. Bestemme mengder av ingrediensene som brukes med denne formelen, der v0 er lager tetthet løsningen brukes, v er siste bind i løsningen ønsket, p er tettheten av siste tetthet løsning ønsket og p0 er tettheten av lager tetthet løsning:
    Equation 1
    Bruk alltid 0,3 mL 1,5 M NaCl forberedelse av tetthet løsninger for å matche NaCl konsentrasjonen av fysiologiske saline.

3. bestemme kvaliteten

  1. Beregne sæd konsentrasjon som tidligere beskrevet22.
  2. Utføre eosin-nigrosin viktig flekker som beskrevet tidligere12 med følgende endringer:
    1. Forberede 100 µL av sæd løsning i en konsentrasjon av 1 x 108 celler/mL.
    2. Pipetter 50 µL av sæd løsning i et polypropylen microcentrifuge rør som inneholder en lik mengde eosin-nigrosin flekken. Inkuber blandingen for 5 min ved romtemperatur.
    3. En 20 µL dråpe farget sperm utvalg i enden av et glass lysbilde og smøre jevnt på en måte som brukes for blod smøres utover. Air-Dry smurte lysbildene ved romtemperatur for 3-5 minutter.
    4. Observere smear under mikroskop. Telle antall levende sædceller (ingen flekker) og døde sperm (farget rosa) og beregne den levende sædceller.
  3. Utføre Accudenz analysen, som tidligere godkjent for kylling sperm, å objektivt vurdere sperm mobilitet8 med følgende endringer:
    1. Pipetter 1,0 mL av 6% analysen løsning i polystyren cuvettes, som vist i figur 2. Inkuber til 41 ° C.
      Merk: 41 ° C til å matche temperaturen av en høne. Inkubasjon temperaturen skal matche den kvinnelige reproduktive område av arten etterforsket.
    2. Overlappe forvarmet analysen løsningen med 100 µL av sædprøve i en konsentrasjon av 5 x 108 celler/mL.
    3. Sted cuvette som inneholder kledde sperm prøve i spektrofotometeret. Posten absorbans verdien 550 nm.
  4. Utføre IPVL-gjennomtrenging analysen som beskrevet tidligere11 med følgende endringer:
    1. Klipp et stykke (0,5 cm x 0,5 cm) ikke-germinal disk regionen intakt IPVL.
    2. Justere sæd konsentrasjon til 4 x 106 celler/mL
    3. Inkuber sperm motilitet buffer med IPVL i en liten hetteglass i 15 min ved 37 ° C, som vist i Figur 3.
    4. Fordype IPVL stykket i 3% NaCl stoppe samspillet mellom IPVL og sperm.
    5. Montere IPVL stykke microscope skyve og beis med Schiff's reagens i 10 min etter fiksering med 10% formalin for 20 s.
    6. Observere IPVL under et mikroskop for vellykket sædcellene penetrasjon hull og antall alle synlige hull PR 0,25 mm2 på 40 X forstørrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PDGC teknikken resulterte i forskjellige separasjon av tre lag av sæd ved grad av kvalitet over alle parametere. Sperm skiller til høy kvalitet lag under høyere tetthet løsningen, et middels kvalitet lag mellom høyere og lavere tetthet løsning og en lav kvalitet lag over lavere tetthet løsningen. Disse forskjellene i kvalitet er dokumentert av klare forskjeller i levedyktighet (Figur 4), transportabel (figur 5) og penetrability (figur 6). Sperm isolert fra det høy kvalitet laget av PDG utstilt økninger i alle tre parametere i forhold til de av tradisjonelt vasket prøven. Disse lagene som middels og lav-kvalitet på separasjon av PDGC vise moderat og dramatisk, henholdsvis reduseres over alle testparametrene.

Figure 1
Figur 1 : Isolering av spermier med differensial kvalitet bruker PDGC. Overlappe 3 mL av sæd løsning på PDG løsningen. Sentrifuger 1500 x g i 20 min. samle tre distinkte grupper av spermier med lav, middels og høy kvalitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Bestemmelse av sæd mobilitet med Accudenz analysen. Overlappe 100 µL av sæd prøve på en 6% analysen løsning i søppel. Ruge på 41 ° C i 5 min. post mobilitet av sæd som en funksjon av absorbans ved 550 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : En modell for dannelsen av sæd penetrasjon hull i IPVL. Inkuber spermier med en liten del av IPVL på 37 ° C i 15 min. Ved kontakt med IPVL, sædceller bind med IPVL, gjennomgår en acrosome reaksjonen og trenge IPVL, opprette penetrasjon hull. Teller antall penetrasjon hull og måle penetrability sæd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Levedyktighet av sæd som vurdert av eosin-nigrosin viktig farging. Digital micrographs viser eosin-nigrosin viktig farging av sæd fra tradisjonelle vask (A) og PDGC (B, lav motile sperm; C, middels motile sperm; D, høy motile sperm). Skala bar = 50 µm på 40 x forstørrelse. Rosa flekker angir døde sæden som har tatt opp eosin flekken. Dataene ble utsatt for enveis ANOVA, etterfulgt av Tukey-Kramer testen. Feilfelt viser standard feil av gjsnitt (SEM). Verdier presenteres som gjennomsnittlig ± SEM (n = 5). a-d Verdier uten en felles hevet ulik (P < 0,05). Sperm isolert av PDGC i lav, middels og høy kvalitet grupper (E) avslører betydelige forskjeller i prosent livskraft, 66.0 ± 4.7, 77.0 ± 8,9 og 92.8 ± 3.4, henholdsvis. Sperm vasket av tradisjonelle metoder vises en 81,6 ± 4,9% levedyktighet, lavere enn gruppen høy kvalitet, men høyere enn middels og lav-kvalitet gruppene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Mobilitet av sæd som vurdert av Accudenz analysen. Absorbansen verdier fungere som en proxy-mål for sperm mobilitet i vurderingen av Accudenz analysen. Dataene ble utsatt for enveis ANOVA, etterfulgt av Tukey-Kramer testen. Feilfelt viser standard feil av gjsnitt (SEM). Verdier presenteres som gjennomsnittlig ± SEM (n = 5). a-d Verdier uten en felles hevet ulik (P < 0,05). Sperm isolert i lav, middels og høy kvalitet grupper av PDGC teknikken viste markant forskjellige lav (0,11 ± 0,03), medium (0.34 ± 0,01) og høy (0.87 ± 0,03) absorbansen verdier, henholdsvis. Sperm vasket av tradisjonelle metoder utstilt en absorbansen 0.71 + 0,03, en absorbansen lavere enn høy kvalitet gruppen, men høyere enn for middels og lav-kvalitet gruppene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Penetrability sæd som vurdert av sæd-indre perivitelline lag (IPVL) samhandling analysen. Digital micrographs viser i vitro formasjon hull på overflaten av IPVL av kylling sperm (4 x 106 celler/mL) under inkubasjonen motilitet buffer ved 37 ° C i 15 min. Micrographs representerer IPVL gjennomsyret av sperm har gjennomgått tradisjonelle vask (A) og sperm fra lav - (B), medium (C) og høy (D) kvalitetsgrupper fra PDGC. Skala bar = 50 µm på 40 X forstørrelse. Dataene ble utsatt for enveis ANOVA, etterfulgt av Tukey-Kramer testen. Feilfelt viser standard feil av gjsnitt (SEM). Verdier presenteres som gjennomsnittlig ± SEM (n = 5). a-d Verdier uten en felles hevet ulik (P < 0,05). Antall penetrasjon hull per 0,25 mm2 (E) differansen imellom sperm isolert fra de ulike graderingene av tetthet media. Sperm isolert i lav, middels og høy kvalitet grupper av PDGC produsert en lav (24.40 ± 1.1), medium (33.20 ± 1.4) og høy (51.20 ± 1.3) antall penetrasjon hull, henholdsvis. Sperm vasket med den tradisjonelle metoden produsert 46.40 ± 1,8 penetrasjon hull, en lavere verdi enn gruppen høykvalitets men høyere enn middels og lav-kvalitet gruppene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fruktbarhet ikke bare bestemmer lønnsomheten i dyr produksjonen, men også fungerer som en naturlig utvalg av arter for eksistens. Den ultimate funksjonen til en sperm celle er å befrukte egget. Oviduct en kvinne velger bare de fittest sperm slik befruktning av egget23,24. In vitro studier har også avdekket en nær sammenheng mellom kvalitativ sædceller egenskaper og gjødsling, suksess,4,,11,,23,,24. Redusert fruktbarhet er assosiert med dårlig kvalitet på sædceller4,11,25. Som sådan, krever det behandling sæd for forbedring av kvaliteten. I kunst, er PDGC brukt for å samle inn bare høy kvalitet sperm for å supplere fruktbarhet mennesker og agriculturally-viktig dyr13,16,20,26. Bruker denne teknikken, viste vi imidlertid en mild, ikke-invasiv teknikk skille lite, middels og høy kvalitet sperm i innenlandsk kylling modellen.

Presentert protokollen for PDGC, når fremført korrekt, kan separasjon av ikke bare høy kvalitet sperm, men også effektiv separasjon av lav - og middels kvalitet sperm. Graden av suksess av PDGC er avhengig av nøye planlegging av usammenhengende graderingen som like forsiktig samling av isolerte lag. Diameter av koniske rør brukes også påvirker suksessen til PDGC. Vi har observert at større rør diameter resulterer i redusert effektivitet av teknikken. Det er viktig at PDGC er utført ved romtemperatur for å opprettholde integriteten til PDG. Noen tidligere nedkjølt eksempler bør justeres til romtemperatur før den blir plassert på PDG. Det vanligste problemet som kan observeres etter at PDGC er ineffektiv separasjon; isolert lagene vil ikke være forskjellige fra hverandre. Hvis dette problemet oppstår, i tillegg til adressering kritisk ovenfor, det kan rettes ved å redusere utvalget fortynning, økende volumer av løsninger brukes og sikre volum av løsninger brukes er like.

PDGC er svært tilpasningsdyktige. En rekke tettheter mellom 1.00 og 1.13 g/mL kan brukes for utarbeidelse av graderingen. Vi har funnet at 1.07 og 1,08 g/mL tetthet løsninger fungerer godt for separasjon av kylling sperm kvalitet, men disse tettheter trenger justering for andre prøve typer eller eksperimentelle formål. Antall tetthet løsninger brukes i forløpningen kan også justeres for å passe behovene til eksperimentator. Antall kvalitetsgrupper isolert vil alltid være en mer enn tetthet løsninger brukes.

PDGC er mye mer effektivt enn alternative metoder for eksempel separasjon i situasjoner hvor store mengder av eksempel er behøvde13,16,20,26. Migrasjon analyser skille effektivt høyeste kvalitet sperm fra en prøve18,19, men de kan ikke brukes til å løse utvalget ytterligere. Migrasjon analyser er også i stand til å forberede store mengder eksempel18,20. Tilslutning kolonnen analyser skille effektivt store mengder eksempel17; men er prosessen skadelig for kvaliteten på sæden samlet, gjør bekreftelse av kvalitetsgruppene etter separasjon vanskelig20,21. PDGC, men har sine egne begrensninger. I pattedyr sæd, bør det ikke brukes for utarbeidelse av prøver for i vitro fertilisering, på grunn av mulig forurensning med endotoxins27. Effekten av Percoll forurensning med endotoxins har ikke blitt undersøkt i andre dyr klasser. Sperm ytelsen påvirkes ikke av endotoxins, betyr PDGC er fortsatt passer for forskningsformål.

Samlingen av sæd av kvaliteten med PDGC teknikk vil være instrumentell for en rekke applikasjoner, inkludert studier med sperm fysiologiske, metabolomic, transcriptomic og proteomic. Bruk av denne teknikken vil bidra til oppdagelsen av biomarkers sperm kvalitet for bruk i markør-assistert fruktbarhet produktforbedring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accudenz Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA AN7050
Percoll  Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA P7828
Schiff’s reagent Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA 3952016
TES Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA T1375
Eosin Y Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA E4009
Nigrosin Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA 198285
ST 40R Centrifuge  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter, Brea, CA, USA No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope Olympus America Inc., PA, USA No catalogue is found

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
  2. Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus. Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).
  3. Henkel, R., et al. Sperm function and assisted reproduction technology. Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).
  4. Reddy, R. P. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. Bakst, M. R., Wishart, G. J. , Savoy, Il. 73-89 (1995).
  5. Howarth, B. Jr An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl. Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).
  6. Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. Measurement and significance of sperm morphology. Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).
  7. Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls. Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).
  8. Froman, D. P., McLean, D. J. Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz. Poultry Science. 75, 776-784 (1996).
  9. Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. Human sperm capacitation and the acrosome reaction. Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).
  10. Ahammad, M. U., et al. Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme. Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).
  11. Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract. Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).
  12. Chalah, T., Brillard, J. P. Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence. Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).
  13. Aitken, R. J., West, K. M. Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients. International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).
  14. Mortimer, D., Mortimer, S. T. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. Carrell, D., Aston, K. , Humana Press. Totowa, NJ, USA. 927 (2013).
  15. Qingling, Y., et al. Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques. Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).
  16. Moohan, J. M., Lindsay, K. S. Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up. Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).
  17. Paulson, J. D., Polakoski, K. L. A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate. Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).
  18. Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. World's Poultry Science Association Proceedings. , Cambridge University Press. (2010).
  19. Lucena, E., et al. Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme. Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).
  20. Henkel, R. Sperm Processing for IVF. Clinical Embryology: A Practical Guide. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).
  21. Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa. Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).
  22. Freund, M., Carol, B. Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen. Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).
  23. Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry. Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).
  24. Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct. Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).
  25. Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract. Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).
  26. Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).
  27. Chen, M. J., Bongso, A. Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception. Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).

Tags

Biologi problemet 141 Sperm mobilitet tetthet gradert usammenhengende
Sæd samling av differensial kvalitet bruker tetthet gradert sentrifugering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahammad, M. U., Jarrell, Z. R.,… More

Ahammad, M. U., Jarrell, Z. R., Benson, A. P. Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (141), e58833, doi:10.3791/58833 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter