Biology
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Recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad
Chapters
Summary November 29th, 2018
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En este trabajo, nuestro objetivo es describir el funcionamiento de la técnica de centrifugación del gradiente de densidad y su aplicación en la investigación de fisiología de la esperma.
Transcript
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología espermática, como los determinantes químicos de la calidad del esperma. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad para separar grandes cantidades de muestras por calidad, así como adaptabilidad en comparación con métodos alternativos. Aunque este método puede proporcionar información sobre las diferencias en la calidad del esperma, también se puede aplicar a otras muestras como tipos de células mixtas o componentes subcelulares con diferentes densidades.
Para empezar, haga dos diluciones Percoll de 3 mililitros en dos tubos separados. En un tubo de ensayo limpio, diluir 1 mililitro de muestra de semen con 2 mililitros de PBS. Entuúcelo suavemente para mezclar la solución.
Añadir 3 mililitros de la menor densidad De la sollución Percoll a un tubo cónico estéril. A continuación, pipetee cuidadosamente 3 mililitros de la solución Percoll de mayor densidad por debajo de la solución Percoll de menor densidad. Mientras inclina el tubo cónico en un ángulo de 45 grados, pipeta 3 mililitros de la muestra de semen diluido en la parte superior del gradiente de densidad Percoll.
Después de preparar un tubo en blanco, centrifugar ambos tubos a 1500 Gs durante 20 minutos. Asegurar que se hayan formado tres capas distintas de semen en la bañera después de la centrifugación. Usando una pipeta recoger las tres capas de semen, comenzando con la capa superior, seguido por la capa media, y terminando con el pellet duro en la parte inferior del tubo.
Transfiera cada una de las capas a un tubo estéril de micro centrífuga. Diluir cada una de las muestras de semen con 1,5 mililitros de PBS y centrifugar las muestras a 1500 Gs durante diez minutos. Finalmente, verter el sobrenadante y reconstituir los pellets con tampón de motilidad.
En este protocolo, la técnica de centrifugación de gradiente de densidad Percoll, o PDGC, se utilizó para separar una muestra de semen en tres capas distintas. Los espermatozoides se separan en una capa de alta calidad por debajo de la solución de mayor densidad, una capa de calidad media entre las soluciones de densidad más alta y baja, y una capa de baja calidad por encima de la solución de menor densidad. Estas diferencias en la calidad del esperma se evidencian por diferencias en viabilidad, movilidad y penetrabilidad.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las muestras deben ser llevadas a temperatura ambiente. El éxito de PDGC depende de una cuidadosa preparación del gradiente, así como de una cuidadosa colección de las capas aisladas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para nuestra investigación en el campo de la perdiómica de espermatozoides para explorar marcadores biológicos de fertilidad en especies aviares.
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