Summary
Bu yazıda, yoğunluk gradient Santrifüjü tekniği ve sperm Fizyoloji araştırma kendi uygulamasında performansını açıklayan hedefliyoruz.
Abstract
Eşeyli üreme ile fertilizasyon hakkında getirmek için kadın bir gamet bir erkek gamet ya da sperm hücresi sigortalar. Ancak, çok sayıda sperm hücresi yetenek gübreleme ile fertilizasyon emin olmak için bir kadın gamet ile etkileşim gerekir. Bu nedenle, tek tek sperm hücresi gübreden yeteneği başarılı üreme için önemlidir. Yoğunluk gradient Santrifüjü için onlarca yıl yardımlı üreme teknolojisi içinde kullanılmak üzere yalnızca yüksek kaliteli sperm toplamak için tekrarlanabilir, hızlı, verimli, etkili ve son derece uyarlanabilir bir yöntem olarak kullanılmıştır. Biz burada açıklanan protokoller üç ayrı nüfus horoz sperm kalitesini tarafından yalıtmak için kesintili Percoll yoğunluğu degrade Santrifüjü (PDGC) tekniği kullanımı odaklanmak. Düşük, orta ve yüksek kaliteli sperm toplamak başardık. Biz de onların canlılık, hareketlilik ve penetrability değerlendirilmesi sperm belirleyici doğurganlık potansiyelini gerektirecektir tekrarlanabilir iletişim kuralları açıklar. Koleksiyon sperm kalitesini PDGC tekniği kullanarak tarafından doğru bir şekilde için yararlı olacağını ve iyice sperm potansiyel fark doğurganlık ile karakterize.
Introduction
Omurgalılar, Erkek gamet yoğun seçici basınç geçmesi; Bu nedenle bir erkek üreme fitness başarılı fertilizasyon ulaşmak için çok önemli. Herhangi bir belirli omurgalı türün erkek fertilizasyon ihtiyaçlarını karşılamak için sperm hücrelerinin büyük miktarlarda ve yeterli kalitede üretmek gerekir. Sperm hücresi sperm baş ve bir kamçı sahip, vücuttaki en polarize hücrelerdir. Onlar da çok sperm kalitesinde heterojen vardır (canlı ve ölü, morfolojik normal ve anormal ve hareketsiz, düşük mobil ve yüksek mobil), hangi geniş varyasyon erkeklerin üreme verimliliği saptandı. Yüksek kaliteli sperm, daha az sayıda başarıyla ovum döllemek için gerekli matings büyük oranda. Ancak, doğurganlık elde etmek için morfolojik normal sperm hücresi İtici güçlerini gübreleme de zona pelusida1 nüfuz olarak sitesine ulaşmak için onların kamçı tarafından oluşturulan dayanır (ZP; memeliler durumunda) veya iç perivitelline katman2 (IPVL; durumunda kuşlar ve sürüngenler) doğal çiftleşme veya suni tohumlama (AI) aşağıdaki ovum. Sperm belirleme kalite yardımlı üreme teknikleri3 (sanat) kullanmak için gerekli ve AI kullanılmak üzere damızlık erkek yelpazesi4programları. Öte yandan, sanat başarısı sadece sperm kalitesi doğru değerlendirilmesi dayanır. Laboratuvar testleri bir dizi sperm fonksiyonel özelliklerini belirlemek için geliştirilmiştir. En önemli parametreleridir sperm morfolojisi, canlılık, hareketlilik, capacitation (kuş sperm gerektirir değil capacitation5), acrosome reaksiyon (AR; ekzositozu ve proteolitik enzim sürümünden sperm kafa acrosome), sperm penetrasyon ZP veya IPVL ve döllenme6,7,8,9,10,11. Önlemler doğurganlık yalnız bir sperm nüfus11gübreden yeteneği doğru bir değerlendirme sağlar. Önlemler çeşitli olayların bir yumurta döllenme için çıkılan bireysel spermatocytes7performansını uygun bir gösterimi için izin.
Sperm fonksiyonu ölçmek için geliştirilen metodoloji öncelikle species-specific. Örneğin, kuş sperm, sperm kalitesi8,11,12değerlendirmek için kullanılan en yaygın parametreleri canlılık, hareketlilik ve IPVL penetrasyonu vardır. Varlığı çok sayıda ölü sperm meni, sperm kalitesini etkilediğinden boşalmak canlı sperm sayısı sperm hayatta kalmak için önemli bir rol oynar. Bu reaktif oksijen türleri içinde sperm üretimini artırır ve canlı sperm13oksidatif hasara neden olur. Sperm hareketliliği, vücut sıcaklığında direnç karşı kuş sperm kamçı hareket için kapasite fertilizasyon8hakkında getirerek doğrudan bir rol oynamak için bilinir. İyi hareket eden olumlu doğurganlık ile ilişkili ve olduğunu, bu nedenle, birincil belirleyicisi doğurganlık8kuruldu. Ancak, bir mobil sperm de bir AR geçmesi ve IPVL11nüfuz yeteneği olması gerekir. IPVL penetrasyon deneyleri fertilizasyon11sürecinde yer alan her bir sperm için dikkate alacak.
Sanat uygulamada, boşalmak genellikle yüksek kaliteli sperm konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak ve düşük kaliteli sperm konsantrasyonu en aza indirmek için işlenir. Meni toplandıktan sonra yüksek kaliteli sperm oranı sperm ayrılık yordamları Sanayi ve araştırma uygulamalarında yaygın olarak kullanılan zenginleştirilmiş. Bu yordamları birçoğu, tüm ilgili faydaları ve sınırlamaları, ile geliştirilmiştir ancak tüm türdeş olmayan doğa sperm ile yüksek gübre yetenek sadece sperm toplamak için kullanmak. Sperm geçiş yöntemleri, bağlılık sütun filtrasyon ve yoğunluk gradient Santrifüjü (DGC)14,15,16,17,18,19 bu yordamları içerir , 20. kullanılabilir teknikleri arasında çok basit, tekrarlanabilir, maliyet-etkin ve verimli yüksek kaliteli sperm sanat kullanmak için en fazla şans fertilizasyon14 en üst düzeye çıkarma amacı ile izole olmak DGC bulundu , 15. Buna ek olarak, DGC sperm hücre membran için zararlı değildir. Buna ek olarak, sperm geçiş yöntemleri yalnızca kademeli mobil sperm18,19toplamak, ancak toplanan sperm miktarı çok düşük, yapım o verimsiz sperm18, geniş hacimli toplama konusunda 20. bağlılık sütun filtrasyon son derece mobil sperm meni17; filtreleri bölümünde çok etkili Ancak, bu sperm membran20,21' e zararlı olma eğilimindedir.
DGC teknikte yoğunluğu degrade oluşturmak için en sık kullanılan substrat kolloidal silika partikülleri içinde polyvinylpryrolidone kaplı oluşur Percoll olduğunu. Percoll yoğunluğu degrade Santrifüjü (PDGC) ya da sürekli veya süreksiz olabilir ama kesintili bir degrade çoğunlukla son derece mobil sperm13,16,20yüksek verimli yalıtım için kullanılır. İş öğelerinin sürekli olmayan bir gradyan içerisinde daha yüksek yoğunluk ortamı bir konik tüp alt üst yoğunluğu artar bir degrade oluşturma, yukarıda daha düşük yoğunluklu medya yüzer. Bu sınırları farklı yoğunluk iki ortam arasında arayüz oluşturur. PDGC verimliliğini iki faktör elde edilir: 1) tek tek sperm hücresi ve artan bir yoğunluk var 2) eğilimi yüksek yapısal bütünlüğü ile sperm hücrelerinin itici yeteneği. Sperm daha yüksek hareket yeteneği ile daha iyi daha düşük yoğunluklu ortamdan geçmek ve daha yüksek bir yoğunluk medya içine nüfuz edebiliyoruz. Alt mobilite sperm medya farklı yoğunluğu arasındaki arabirimi tarafından oluşturulan sınır, tuzak haline olasılığı daha yüksektir. Sperm hücreleri yüksek yapısal bütünlük ve hareketlilik ölü, anormal veya düşük mobil sperm hücreleri daha yüksek yoğunluklu sahip olma eğilimi. Merkezkaç kuvveti PDGC uygulandığında, bu ilgili yerlerini degradedeki farklı yoğunlukları ile sperm hareketi kolaylaştırır.
Genel uygulamada PDGC gerçekleştirildikten sonra sperm yüksek doğurganlık konik tüp alt kısmında potansiyel ile yumuşak Pelet toplanır ve kalan atılır. Ancak, bu tekniğin atıl bir avantaj sperm hücresi kalite farkı göre çeşitli gruplara ayırmak için onun yetenek var. Gibi fizyolojik, metabolomic ve proteomik farklılıklar ilgilidir araştırma amaçlı, sperm kalitesi çalışma için sperm tarafından PDGC tekniği kullanan kalite derecesini ayırma verir. Burada, biz ne kadar bu teknik yanı sıra sperm kalitesi ile ayrı kalite, bu farklılıkları göstermek için kullanılabilir ayrıntı daha önce kurulan eozin-nigrosin canlılık için hayati boyama, Accudenz tahlil hareket eden ve sperm-IPVL kullanarak amacı etkileşim tahlil penetrability için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Gürcistan Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. yıkama geleneksel Santrifüjü kullanarak
- Fosfat tampon çözüm (PBS) hazırlayın. NaCl, 8.0 g KCl, 1.44 g Na2HPO4 ve KH2PO4 800 ml distile su (dH2O) 0,24 g 0.2 g ekleyin. PH 7.4 0.1 N HCl kullanarak için ayarlamak ve çözüm getirmek için 1 dH2O. kullanarak L
- Motilite arabellek hazırlayın. NaCl, 6.5 g glikoz, 0,444 g CaCl2 ve n - tris-[hydroxymethyl] 11,5 g 4,5 g ekleyin dH2O. 800 ml metil-2-amino-ethanesulfonic asit (TES) pH 7.4 1 M NaOH kullanarak için ayarlamak ve çözüm getirmek için 1 dH2O. kullanarak L
- 0.5 mL sperm Polipropilen microcentrifuge tüpüne pipet. PBS 1.0 mL ekleyin ve karışımı yavaşça.
- 1.500 x g (RT) Oda sıcaklığında 10 dakika, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. PBS ile sperm Pelet resuspend 1,5 mL.
- Sperm hareketliliği ile cips dik Resuspend, 10 min için 1.500 x g, santrifüj tampon 0.5 mL.
2. PDGC teknik gerçekleştirme
Not: oda sıcaklığında PDGC tüm süreci gerçekleştirmek.
- 1.08 g/mL ve 1.07 g/mL Percoll çözümleri 3,0 mL iki ayrı tüplerde olun.
- Temiz bir test tüpü içinde 1.13 g/mL 1,712 mL ekleyin 0.3 mL 1,5 M NaCl çözeltisi için orijinal Percoll. DH2O 0.988 mL ve nazik INVERSION tarafından yoğunluk çözüm olarak 1.08 g/mL 3,0 mL yapmak karıştırın.
- Temiz bir test tüpü içinde 1.13 g/mL 1.482 mL ekleyin 0.3 mL 1,5 M NaCl çözeltisi için orijinal Percoll. DH2O 1.218 mL ve nazik INVERSION tarafından yoğunluk çözüm olarak 1.07 g/mL 3,0 mL yapmak karıştırın.
- Temiz bir test tüpü içinde PBS 2.0 mL ile 1.0 mL sperm örnek 1:2 oranında seyreltin. Pipetting tarafından karışımı yavaşça.
- Damlalıklı 3,0 mL steril 15 mL konik tüp içine 1.07 g/mL yoğunluğu çözeltisi. Dikkatle 1.08 g/mL yoğunluğu çözüm 1.07 g/mL yoğunluğu çözüm altında 3,0 mL damlalıklı. İki kat değil mix emin olun. Bir uzun formlu (9 inç) Pasteur pipet Bu adım daha kolay yapabilirsiniz.
- Seyreltilmiş meni örneği 3,0 mL damlalıklı PDG katmayın. Meni örnek PDG ile karıştırmak değil emin olmak için yavaşça 45 ° açıyla PDG içeren konik tüp eğ. Damlalıklı tüp duvar boyunca örnek ve tüp aşağı ve PDG üzerinden akışı sağlar.
- PDG ile overlaid örnek kütlesinin eşleştirmek için boş bir tüp hazırlayın. 1500 x g de her iki tüpler santrifüj kapasitesi 20 dk. denge ve sonra santrifüj kürsüye tüpler aktarma sırasında kesintili degrade korumak için dikkatli olmak için.
Not: fren Santrifüjü sonunda kullanmayın. - Sonuçları gözlemlemek. Üç ayrı meni katmanları tüp içinde oluşmuş Şekil 1' de görüldüğü gibi olun.
- Bir pipet katmanlarla izole sperm Aspire edin. Meni üst tabakası ilk toplamak, Orta ikinci katman ve tüpün dibinde zor Pelet son. Her bir temiz ve steril polipropilen için transfermicrocentrifuge tüp.
- Her örnek için PBS ile 1,5 mL seyreltik. 1500 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant dökün. Sperm Pelet hareketliliği arabelleği ile nazik pipetting tarafından yeniden oluşturma.
Not: Alternatif yoğunlukları araştırmacı gereksinimlerinize uyacak şekilde kullanılabilir. V0 stok yoğunluğu çözüm hacmi nerede Aşağıdaki denklemle kullanılan maddeler miktarda kullanıldığında, istenen, çözüm p son hacim istenen son yoğunluk çözüm yoğunluğudur ve hisse senedi yoğunluk yoğunluğu p0 v belirlemek Çözüm:
Her zaman 1.5 M NaCl 0.3 mL NaCl konsantrasyon fizyolojik serum eşleştirmek için yoğunluk çözümleri hazırlanmasında kullanın.
3. Sperm kalitesini belirleme
- Sperm konsantrasyonu daha önce22açıklandığı gibi hesaplayın.
- Eozin-nigrosin aşağıdaki değişiklikler ile yukarıda açıklanan12 olarak boyama hayati gerçekleştirin:
- Sperm çözüm konsantrasyonu 1 x 108 hücre/mL, 100 µL hazırlayın.
- Damlalıklı 50 µL sperm çözüm eozin-nigrosin leke eşit bir birimi içeren bir polipropilen microcentrifuge tüp. Karışımı oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- 20 µL lekeli sperm örneği bir cam slayt bir ucundaki bırakma ve düzgün bir şekilde kan için kullanılan benzer smear yer smear. 3-5 dakika oda sıcaklığında lekeli slaytlar kuruması.
- Mikroskop altında karalama gözlemlemek. Canlı sperm (hiçbir leke) ve (pembe lekeli) ölü sperm sayısını ve canlı sperm yüzdesi hesaplamak.
- Daha önce aşağıdaki değişiklikler ile sperm hareketliliği8 objektif değerlendirmek için tavuk sperm için doğrulanmış Accudenz tahlil gerçekleştirin:
- Damlalıklı 1.0 mL % 6 Şekil 2' de gösterildiği gibi çözüm polistren cuvettes tahlil. 41 ° C'ye kuluçkaya
Not: 41 ° C tavuk iç sıcaklık eşleştirmek için kullanılır. İnkübasyon sıcaklığı bu kadın üreme sistemi soruşturuluyor türlerinin eşleşmesi gerekir. - Meni örneği konsantrasyonu 5 x 108 hücre/mL, 100 µL önceden ısıtılmış tahlil çözümle yerleşimi.
- Küvet içeren yer spektrofotometre sperm örneği overlaid. 550, absorbans değeri kayıt nm.
- Damlalıklı 1.0 mL % 6 Şekil 2' de gösterildiği gibi çözüm polistren cuvettes tahlil. 41 ° C'ye kuluçkaya
- IPVL-penetrasyon tahlil aşağıdaki değişiklikler ile yukarıda açıklanan11 olarak gerçekleştirin:
- Bir parça (0.5 cm x 0.5 cm) olduğu gibi IPVL germinal disk bölgesinin kes.
- 4 x 106 hücre/ml sperm konsantrasyonu ayarlamak
- Sperm hareketliliği arabelleği IPVL küçük cam şişe 37 ° C'de 15 dakika içinde Şekil 3' te gösterildiği gibi kuluçkaya.
- IPVL parça halinde % 3 bırakın NaCl IPVL ve sperm arasındaki etkileşimi durdurmak için.
- Schiff'ın reaktif 10 dk %20 10 formalin ile fiksasyon takip ile leke ve mikroskop slayt üzerinde IPVL parça monte s.
- IPVL başarılı sperm için mikroskop altında penetrasyon delik gözlemlemek ve tüm görünür delik başına 0,25 mm2 , 40 X büyütme saymak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDGC tekniği sperm sayısı üç ayrı ayrımı arasında tüm parametreleri tarafından kalite derecesi sonuçlandı. Yüksek kaliteli katman daha yüksek yoğunluklu çözüm, Orta kalite arasındaki bir katmanda yüksek ve düşük yoğunluklu çözüm daha düşük yoğunluklu çözüm üzerinde bir düşük kaliteli katman aşağıda içine sperm ayırır. Kalite bu farklılıklar (Şekil 4) canlılık, hareketlilik (Şekil 5) ve penetrability (Şekil 6) net farklılıklar göstermiştir. PDG yüksek kaliteli katmandan izole sperm o geleneksel yıkanmış örnek göre tüm üç parametre artış sergiledi. Belirtildiği gibi orta - ve düşük-ayrılık PDGC tarafından üzerine orta ve dramatik, sırasıyla, görüntü kalitesini katmanları tüm test parametreleri arasında azaltır.
Resim 1 : Sperm PDGC kullanarak fark kalitesi ile yalıtım. 3 mL sperm çözeltisi hazır PDG çözüm üzerinde yerleşimi. 20 dakika süreyle santrifüj 1500 x g de sperm düşük, orta ve yüksek kalite ile üç farklı gruplar toplamak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Accudenz tahlil kullanarak sperm hareketliliği belirlenmesi. Sperm örneği bir küvet içinde % 6 tahlil çözüm üzerinde 100 µL yerleşimi. 550 absorbans bir fonksiyonu olarak 41 ° c 5 dk. kayıt hareketliliği sperm için kuluçkaya nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : IPVL sperm penetrasyon delik oluşumu modeli. Sperm ile IPVL küçük bir bölümü için 15dk 37 ° C'de kuluçkaya. IPVL, IPVL ile sperm hücresi bağlama ile temas üzerine acrosome reaksiyon geçmesi ve penetrasyon delik oluşturmak IPVL nüfuz. Penetrasyon delik sayısını ve sperm penetrability ölçün. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Eozin-nigrosin hayati boyama tarafından değerlendirildi olarak sperm canlılığı. Eozin-nigrosin geleneksel yıkama (A) ve (B, düşük hareketli sperm; PDGC bir işlemi boyunca elde edilen sperm hayati boyama gösterilen dijital filmler C orta hareketli sperm; D, yüksek hareketli sperm). Ölçek çubuğu 40 x büyütme, 50 µm =. Pembe boyama eozin leke kadar almış ölü sperm gösterir. Veri tek yönlü ANOVA, Kramer Tukey testi ile takip için tabi tutuldu. Hata çubukları demek (SEM) standart hatasını gösterir. Değerleri ortalama ± SEM sunulmaktadır (n = 5). a-d Ortak bir üst simge farklılık olmadan değerleri (P < 0,05). Sperm tarafından PDGC (E) düşük, orta ve yüksek kaliteli gruplar halinde izole sırasıyla yüzde canlılığı, 66.0 ± 4.7, 77.0 8,9 ve 92.8 ± ± 3.4, önemli farklılıklar ortaya koyuyor. Geleneksel yöntemlerle yıkanıp sperm daha yüksek kaliteli grubu ama orta ve düşük kalite grupları daha yüksek bir 81,6 ± % 4.9 canlılığı, alt görüntülenen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Accudenz tahlil tarafından değerlendirildi olarak sperm hareketliliğini. Absorbans değerleri Accudenz tahlil tarafından değerlendirme içinde sperm hareketliliği için bir proxy ölçü olarak hareket ederler. Veri tek yönlü ANOVA, Kramer Tukey testi ile takip için tabi tutuldu. Hata çubukları demek (SEM) standart hatasını gösterir. Değerleri ortalama ± SEM sunulmaktadır (n = 5). a-d Ortak bir üst simge farklılık olmadan değerleri (P < 0,05). PDGC tekniği ile düşük, orta ve yüksek kaliteli gruplar halinde izole sperm belirgin farklı düşük (0.11 ± 0,03), Orta (0.34 ± 0,01) ve yüksek (0,87 ± 0,03) absorbans değerleri, sırasıyla sergiledi. Geleneksel yöntemlerle yıkanıp sperm bir absorbans 0,71 ± 0.03, yüksek kaliteli grubunun orta ve düşük kalite gruplarının daha yüksek ama daha düşük bir absorbans sergiledi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Sperm-iç perivitelline katman (IPVL) etkileşim tahlil tarafından değerlendirildi olarak sperm penetrability. 15 dk. filmler temsil IPVL geçirmiş sperm tarafından nüfuz için 37 ° C'de hareketliliği arabellekte kuluçka sırasında tavuk sperm (4 x 106 hücre/mL) tarafından IPVL yüzeyinde delik oluşumu vitro gösteren dijital filmler geleneksel yıkama (A) ve düşük - (B), Orta (C) ve yüksek - (D) kalite gruplarından PDGC sperm. Ölçek çubuğu 40 X büyütme, 50 µm =. Veri tek yönlü ANOVA, Kramer Tukey testi ile takip için tabi tutuldu. Hata çubukları demek (SEM) standart hatasını gösterir. Değerleri ortalama ± SEM sunulmaktadır (n = 5). a-d Ortak bir üst simge farklılık olmadan değerleri (P < 0,05). Penetrasyon delik başına 0,25 mm2 (E) sayısı yoğunluk medya farklı degradeler izole sperm arasında farklılık. Sperm tarafından PDGC düşük, orta ve yüksek kaliteli gruplar halinde izole bir düşük (24.40 ± 1.1), Orta (33.20 ± 1.4) ve yüksek (51.20 ± 1.3) sayı-in penetrasyon delik, sırasıyla üretti. Geleneksel yöntemle yıkanmış sperm 46.40 ± 1.8 penetrasyon delik, ama orta ve düşük kalite grupları daha yüksek kaliteli grup daha düşük bir değer üretti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doğurganlık sadece hayvansal üretim karlılığını belirler ama aynı zamanda, bunun doğal seleksiyonun türlerin varlığı için bir araç olarak görür. Bir sperm hücresi nihai bir yumurta döllemek için fonksiyonudur. Bir erkek ovidukt fittest o sperm yumurta23,24fertilizasyon sağlamak için seçer. Vitro çalışmalar da nitel sperm özellikleri ve döllenme başarı4,11,23,24arasında yakın bir ilişki ortaya koymuştur. Düşük doğurganlık kalitesiz sperm4,11,25ile ilişkilidir. Bu nedenle, sperm sperm kalitesinin iyileştirilmesi için işleme gerektirir. Sanat, insan ve tarım önemli hayvanlar13,16,20,26doğurganlık tamamlamak için yalnızca yüksek kaliteli sperm toplamak için PDGC uygulanmıştır. Bu tekniği kullanarak, biz, ancak, düşük, orta ve yüksek kaliteli sperm yerli tavuk modelindeki ayıran bir nazik, non-invaziv tekniği gösterdi.
Ne zaman doğru gerçekleştirilen PDGC, sunulan Protokolü sadece yüksek kaliteli sperm ayrılması, aynı zamanda etkili düşük ve orta kalitede sperm ayrılması sağlar. PDGC başarı derecesi dayanan dikkatli hazırlık kesintili geçişin yanı sıra aynı derecede dikkatli izole katmanları topluluğu. Kullanılan konik tüp çapı de PDGC başarısını etkiler. Biz daha büyük bir boru çapları teknik azalmış verimliliğini sonuçlar gözlemledik. PDGC oda sıcaklığında PDG bütünlüğünü korumak amacıyla gerçekleştirilir önemlidir. Herhangi bir daha önce buzdolabında örnekleri üzerinde PDG yer önce oda sıcaklığına ayarlanmalıdır. PDGC yaptıktan sonra gözlenen en yaygın sorun verimsiz ayrılmasıdır; izole katmanları birbirinden farklı olmayacaktır. Bu sorun oluşursa, yukarıdaki kritik adımları ele ek olarak numune dilüsyonu azaltarak düzeltilebilir, birimler artan yoğunluğu çözümleri kullanılan ve kullanılan çözümler hacimleri sağlanması eşittir.
PDGC çok uyarlanabilir. Yoğunlukları 1,00 ve 1.13 g/mL arasında herhangi bir dizi geçişin hazırlık için kullanılabilir. 1,07 ve 1.08 g/mL yoğunluğu çözümleri de tavuk sperm ayrılması için kalitesi ile çalışır, ancak bu yoğunluğu diğer örnek türleri veya Deneysel amaçlar için ayarlama gerekebilir bulduk. Gradyan içerisinde kullanılan yoğunluk çözümleri sayısı da deneyci gereksinimlerine uyacak şekilde ayarlanabilir. İzole kalite grup sayısı her zaman bir olacaktır kullanılan yoğunluk çözümleri sayıdan daha fazla.
PDGC örnek ayrılık örnek büyük miktarlarda olduğu durumlarda alternatif yöntemlere göre çok daha etkili13,16,20,26gereklidir. Geçiş deneyleri etkili bir şekilde en yüksek kaliteli sperm bir örnek18,19ayrı. ancak herhangi bir daha fazla örnek çözmek için kullanılamaz. Geçiş deneyleri de çok sayıda örnek18,20hazırlama aciz. Bağlılık sütun deneyleri etkili örnek17geniş hacimli ayırmak; Ancak, kalite grupların onay alındıktan sonra ayrılık zor20,21yapma toplanan, sperm kalitesi için zararlı bir süreçtir. PDGC, ancak, kendi sınırlamaları vardır. Memeli sperm olması durumunda o vitro fertilizasyon, endotoxins27olası bulaşma nedeniyle için örnek hazırlanması için kullanılmamalıdır. Endotoxins ile Percoll kirlenme etkisi diğer hayvan sınıflarda soruşturma değil. Endotoxins PDGC araştırma amaçlı hala uygun olduğu anlamına gelir, sperm performansı etkilenmez.
Sperm kalitesini PDGC tekniği kullanarak tarafından topluluğu çeşitli uygulamalar dahil sperm fizyolojik içeren çalışmalar, metabolomic, transcriptomic ve proteomik araştırma için vesile olacaktır. Bu tekniğin uygulanması için kullanım marker yardımıyla doğurganlık geliştirme programları içinde sperm kalitesinin biyolojik keşfi katkıda bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Hiçbiri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | P7828 | |
| Schiff’s reagent | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | No catalogue is found | |
| Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope | Olympus America Inc., PA, USA | No catalogue is found |
References
- Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
- Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus. Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).
- Henkel, R., et al. Sperm function and assisted reproduction technology. Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).
- Reddy, R. P. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. Bakst, M. R., Wishart, G. J. , Savoy, Il. 73-89 (1995).
- Howarth, B. Jr An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl. Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).
- Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. Measurement and significance of sperm morphology. Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).
- Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls. Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).
- Froman, D. P., McLean, D. J. Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz. Poultry Science. 75, 776-784 (1996).
- Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. Human sperm capacitation and the acrosome reaction. Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).
- Ahammad, M. U., et al. Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme. Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract. Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).
- Chalah, T., Brillard, J. P. Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence. Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).
- Aitken, R. J., West, K. M. Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients. International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).
- Mortimer, D., Mortimer, S. T. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. Carrell, D., Aston, K. , Humana Press. Totowa, NJ, USA. 927 (2013).
- Qingling, Y., et al. Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques. Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).
- Moohan, J. M., Lindsay, K. S. Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up. Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).
- Paulson, J. D., Polakoski, K. L. A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate. Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).
- Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. World's Poultry Science Association Proceedings. , Cambridge University Press. (2010).
- Lucena, E., et al. Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme. Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).
- Henkel, R. Sperm Processing for IVF. Clinical Embryology: A Practical Guide. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).
- Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa. Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).
- Freund, M., Carol, B. Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen. Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).
- Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry. Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).
- Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct. Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract. Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).
- Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).
- Chen, M. J., Bongso, A. Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception. Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).
