在这里,我们提出了一个协议,开发和定性斑马鱼模型的癫痫,由于 DEPDC5 基因的暂时抑制。
癫痫是最常见的神经系统疾病之一,影响全世界估计有5000万人。基因研究的最新进展揭示了与各种形式的癫痫有关的大量基因,突出了这种疾病的异质性。适当的动物模型对于研究与癫痫有关的基因突变引发的病理机制以及开发专门的、有针对性的疗法至关重要。近年来,斑马鱼已成为一种有价值的脊椎动物,用于模拟癫痫,同时利用基因操作和接触已知的癫痫药物,如五角星(PTZ),来识别新的抗癫痫疗法。mTOR 调节器 DEPDC5 中的有害突变与各种形式的聚焦癫痫有关,斑马鱼矫形器的击倒会导致与自发发作样发作相关的多动性,以及增强的电图活动和特征转轮游泳。在这里,我们描述了生成 DEPDC5 功能丧失模型所涉及的方法,并说明了在受精后(hpf)评估28小时和48小时运动活动的协议,以及记录斑马鱼光学结节中现场活动的方法。此外,还提供了癫痫药物PTZ对神经元活动的影响的说明。
斑马鱼由于体积小、发育不全、发育不透明,已成为一种有价值的脊椎动物体,用于模拟心血管疾病、癌症或神经系统疾病等各种人类疾病。斑马鱼结合了脊椎动物的优势,包括器官结构和遗传密码的高度保护,以及更简单的模型生物体的较小尺寸和易于遗传操作,从而促进基础研究和转化应用。特别是,它对细胞过程的行为和荧光标记的高通量自动筛查的便利性使斑马鱼成为癫痫研究特别有吸引力的模型。过去十年来,以化学诱发和/或癫痫3、4、5等基因模型为特色的出版物数量大幅增加,最近,关于这些模型6、7、8的化学屏幕获得有希望的治疗方法的报告也证明了这一点。
DEPDC5是 GATOR1 复合体的成员,该复合体是 mTOR 信号 9 的负调节器。DEPDC5基因的突变于2013年首次在患有10、11号体外显性焦点癫痫的前列腺中发现,此后在一些临床疾病中报告与焦点癫痫表现和焦皮质发育不良相关的12。绝大多数报告的突变被预测导致基因12的功能丧失,这被正式证明为一些DEPDC5突变的脚本,这是由废话调解mRNA衰变12,13的目标。根据协议,使用抗感性形态寡核苷酸(AMOs)敲击斑马鱼中的基因矫形器,可产生该生物体中癫痫模型常见的许多特征,包括多动、转轮式游泳、自发发作和增强神经元活动14、15、16、17、18。有趣的是,使用拉帕霉素(mTOR信号的抑制剂)治疗逆转了该模型18的行为特征,支持了DEPDC5功能丧失可能因mTOR通路9、19的失调而引发癫痫的假设。
使用携带形态改变的抗感性寡核苷酸在体内短暂地敲击基因表达,是研究特定基因作用的宝贵工具,与基于si/shRNA的技术相当。最近,基于AMO的策略也发现了临床应用,第一个AMO疗法在2016年20日获得FDA批准治疗杜氏肌萎缩。虽然据报道,在斑马鱼中,急性AMO基因敲击的表型并不总是与构成淘汰模型21相关,但至少在某些情况下,这可以归功于构成基因改造22产生的补偿机制。然而,AMO引起的表型的特异性问题是一个无可争议的问题,必须努力解决的研究使用这项技术23。为了确保基于 AMO 的击倒表型的特殊性,需要几个关键控件。其中包括一个剂量反应曲线,允许选择最低剂量的AMO有效基因击倒,避免整体毒性由于引入过量的遗传物质。还需要使用不针对基因组中任何特定区域的 不匹配 AMO 来确定适当的剂量和识别特定表型。第二个针对同一基因不同区域的 AMO(如拼接阻断 AMO)是确认表型是由于目标基因的击倒而必需的。用基因的cDNA(人类矫形器或无法被AMO瞄准的斑马鱼基因的科顿修改版本)来拯救被击倒的表型,为表型特异性提供了有力的论据。缺乏与包含功能丧失突变的相同 cDNA 的救援(如引入早期停止科顿)是这一方向的进一步证明。
在这里,我们提出了一个生成斑马鱼DEPDC5功能丧失模型的方法和行为表型在28和48小时施肥后(hpf)的方案。在28马力时,DEPDC5功能丧失会导致整体多动,在胆汁中胚胎的盘绕和抽搐运动增强就证明了这一点。在这个阶段,可以使用自动运动检测系统来量化每个胚胎的整体活性。在48马力,斑马鱼表现出刻板的逃生游泳回应触摸。在斑马鱼与DEPDC5的低调节表达,游泳轨迹明显比在控制,鱼表现出”软螺丝”或”转轮”一样的模式,类似于其他报告癫痫模型在这个有机体3,4。在受精后4-6天(dpf)内,在斑马鱼幼虫的光学结节中获取了电生理记录,并显示DEPDC5击倒动物的神经元活动基线增加。该模型的优点是,它在不同的时间点呈现了几个表型特征,可用于监测和评估药物疗法在开发过程中的疗效。
癫痫是一种复杂的神经系统疾病,其特征是多种病因,随着基因测序技术25、26、27的出现,这些病因开始被阐明。多功能动物模型对于有效的转化策略至关重要,该策略将同时深入了解基因联系癫痫的病理机制,并为此情况的不同形式提供有针对性的治疗方法。斑马鱼模型在复制癫痫的主要特征和提供可靠的读数抗癫痫药物筛查5,28。在转基因斑马鱼15、29、30、31和神经生理分析中可以检测到自发性癫痫发作,这些模型28证实了癫痫样行为的神经元基础32、33。小型斑马鱼幼虫可以采用96井格式的化学屏幕,可自动检测简单行为,如自发游泳,从而能够快速检测潜在的治疗方法。
这里介绍的 DEPDC5 击倒模型是通过将AMO注射到斑马鱼胚胎中以阻止基因表达而获得的。该模型在幼虫发育的不同时间点呈现几个基石表型特征,可在化学或基因筛选协议期间用作治疗效率指标。AMO介导基因击倒是一项强大的技术,它比化学诱导的癫痫发作模型显示出优势,因为它特别针对感兴趣的基因的表达,从而能够识别由基因突变触发的潜在致病机制。化学诱导剂是药物筛选的有力工具,它可以通过多个细胞通路起作用,这些通路可能并不总是与正在研究的基因突变相关。虽然 AMO 注射本身是实验者掌握的简单技术,但它也存在许多局限性。注射必须在一个细胞阶段胚胎进行:在我们手中,后期注射大大增加了表型的变异性。这限制了注射的时间;因此,按时间顺序生成卵子进行注射的策略是有用的。我们通常使用 4-5 十字架,我们以 15-20 分钟间隔打开,允许在获得下一个离合器之前注射一个离合器。此外,由于成见行为在发育的最初几天发展迅速,因此必须注意在不同实验之间的同时点评估表型。AMO 的体积和浓度也必须仔细控制,因为注射过量导致的一般毒性会掩盖特定表型。介绍中提出的不同对照对于确定正确的注射剂量和相应的表型至关重要。
幼虫斑马鱼大脑的现场记录是研究不同脑部疾病涉及的基因突变对全球神经元活动34的有害影响的有用工具。在这些实验条件下看到的去极化事件是评估不同癫痫条件下药物电生理作用的既定方法。然而,对这些影响的评估大多在质量上而不是定量上进行,并在分析中具有主观观察者的作用。在这里,我们开发一个自动检测策略,可以客观地量化去极化的速度,其振幅和持续时间,并可以评估这些参数的进展,随着时间的推移,或通过不同的基因或药理干预。
这里提出的代表性结果表明,与4-6 dpf斑马鱼的不匹配控制相比 ,DEPDC5 击倒基因模型的预期场活动,在PTZ应用引入癫痫状电图活动之前和之后。此前,我们已显示 DEPDC5 击倒条件18的基底活动显著增加。在这里,我们表明,这两种情况对PTZ(一种化学癫痫活动诱因)的反应在时间上具有类似的轨迹,从频率相对较低、振幅较高的去极化事件开始,并持续一个频率较高、振幅较低的去极化事件。现场记录事件具有缓慢的动态(感兴趣的频率在 0.005-0.2 s-1之间),因此本协议中使用低通和高通滤镜来隔离感兴趣的事件。消除低频噪声后,使用简单的阈值进行去极化事件的检测。由于信号的统计数据受到去极化事件的极大影响,因此我们无法使用总信号的标准偏差来确定此阈值。数据集中标准偏差值的变异性大于观察到的记录噪声水平。因此,在对痕迹进行目视检查后,我们使用了0.3mV阈值的固定值,以避免不同水平的去极化活动引起的偏差。
所述协议提供了一个标准化和简单的方法来评估运动行为和神经元场活动,通过细胞外电流夹电压记录,以及自动检测光结节中的去极化事件,以描述斑马鱼模型中的癫痫状表型。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢进行神经生理实验的ICM电生理学平台的工作人员。我们还感谢安卡玛丽安的技术帮助。SC 得到了电车赠款 #21488 的支持。EK 得到了 AFM 赠款 #18469 和 ERC 合并剂授予 (ALS-网络) 的支持。HC 得到了梅迪卡莱基金会 (PLP20141031462) 和 ARSLA 的博士学位支持。在广告和RM方面,这项工作得到了罗马尼亚国家科学研究和创新局、国家科学研究中心-UEFISCDI(项目编号PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010、PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007) 的三笔赠款的支持。 和COFUND-神经-NMDAR-PSY),由欧盟地平线2020研究与创新计划赠款 – 赠款协议第668863-SyBil-AA,以及由美国政府资助的国家科学基金会赠款NSF-IOS-1656830。
Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60mM in water |
Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution) |
Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
Zebralab | Viewpoint, France | N/A |