Her præsenterer vi en protokol for udvikling og karakterisering af en zebrafisk model af epilepsi som følge af den forbigående hæmning af DEPDC5-genet.
Epilepsi repræsenterer en af de mest almindelige neurologiske lidelser, der påvirker en anslået 50 millioner mennesker på verdensplan. Nylige fremskridt inden for genetisk forskning har afsløret et stort spektrum af gener impliceret i forskellige former for epilepsi, der fremhæver den heterogene karakter af denne lidelse. Passende dyremodeller er afgørende for at undersøge de patologiske mekanismer, der udløses af genetiske mutationer, der er impliceret i epilepsi, og for at udvikle specialiserede, målrettede behandlinger. I de senere år har zebrafisk vist sig som en værdifuld hvirveldyr organisme til modellering epilepsi, med brug af både genetisk manipulation og eksponering for kendte epileptogenice lægemidler, såsom pentylentetrazol (PTZ), at identificere nye anti-epileptiske therapeutics. Skadelige mutationer i mTOR regulator DEPDC5 har været forbundet med forskellige former for fokal epilepsi og knock-down af zebrafisk ortolog forårsager hyperaktivitet forbundet med spontane beslaglæggelse-lignende episoder, samt forbedret elektrografisk aktivitet og karakteristisk svinghjul svømning. Her beskrev vi den metode, der er involveret i at generere DEPDC5-tabsmodellen og illustrere protokollen til vurdering af motoraktivitet ved 28 og 48 timer efter befrugtning (HPF), samt en metode til registrering af feltaktivitet i zebrafiskoptisk tectum. En illustration af virkningen af det epileptogenice lægemiddel PTZ på neuronal aktivitet over tid er også forudsat.
På grund af sin lille størrelse, oviparous udvikling og gennemsigtighed på tidlige stadier af udviklingen, zebrafisk har vist sig som en værdifuld hvirveldyr organisme til modellering af menneskelige sygdomme så forskellige som hjerte-kar-, kræft eller neurologiske lidelser1,2. Zebrafisk kombinerer fordelene ved et hvirveldyr, herunder høj bevarelse af organarkitektur og genetisk kode, med den lille størrelse og lethed af genetisk manipulation af enklere modelorganismer, hvilket letter både grundlæggende undersøgelser og translationelle anvendelser. Især dens amenability til high-throughput automatiseret screening af adfærd og fluorescerende markører af cellulære processer har gjort zebrafisk en særlig attraktiv model for epilepsi forskning. Dette er blevet påvist ved en høj stigning i det sidste årti af antallet af publikationer med kemisk inducerede og / eller genetiske modeller af epilepsi3,4,5 og for nylig rapporter om lovende terapier fremstillet fra kemiske skærme i disse modeller6,7,8.
DEPDC5 er medlem af GATOR1-komplekset, en negativ regulator af mTOR-signalering9. Mutationer i DEPDC5-genet er første gang blevet opdaget i 2013 i probands, der lider af autosomal dominerende fokal epilepsi10,11, og er siden blevet rapporteret i en række kliniske tilstande forbundet med fokale epileptiske manifestationer og fokal kortikale dysplasi12. Langt de fleste rapporterede mutationer forventes at forårsage tab af funktion af genet12, og dette blev formelt påvist for en række DEPDC5 muterede udskrifter, som er målrettet af nonsens medieret mRNA henfald12,13. I enighed resulterer nedslidning af genortologen hos zebrafisk ved hjælp af antisense morpholino oligonucleoides (AMOs) i en række funktioner, der er fælles for epileptiske modeller i denne organisme, herunder hyperaktivitet, svinghjullignende svømning, spontane anfald og forbedret neuronal aktivitet14,15,16,17,18. Interessant, behandling med rapamycin, en hæmmer af mTOR signalering, vendt adfærdsmæssige funktioner i denne model18, understøtter hypotesen om, at DEPDC5 tab-of-funktion kan udløse epilepsi på grund af en fejlregulering af mTOR vej9,19.
Forbigående knock-down af genekspression in vivo ved hjælp af antisense oligonukleoider bærer morpholino modifikation har været et uvurderligt redskab til at studere den rolle, specifikke gener, på lige fod med si / shRNA-baserede teknikker. For nylig har AMO-baserede strategier også fundet kliniske anvendelser, med en første AMO-behandling, der modtager FDA-godkendelse til behandling af Duchenne muskelatrofi i 201620. Selv om det blev rapporteret, at i zebrafisk kan fænotypen af akut AMO-baseret gen knock-down ikke altid korrelere med de konstituerende knock-out-modeller21, men dette kan i det mindste i nogle tilfælde skyldes kompenserende mekanismer, der er forårsaget af konstituerende genetiske modifikationer22. Spørgsmålet om specificitet af AMO-induceret fænotype er imidlertid en ubestridelig bekymring, der skal behandles omhyggeligt i undersøgelser ved hjælp af denne teknologi23. For at sikre specificiteten af den AMO-baserede knock-down fænotype er flere nøglekontroller nødvendige. Disse omfatter en dosis-respons kurve, der gør det muligt at vælge den laveste dosis af AMO effektiv til gen knock-down, undgå samlede toksicitet på grund af indførelsen af et overskud af genetisk materiale. Brugen af en Mismatch AMO, der ikke er rettet mod et bestemt område i genomet, er også nødvendig for at fastsætte en passende dosis og identificere en bestemt fænotype. En anden AMO, der er rettet mod en anden region af samme gen, såsom en splejs-blokerende AMO, er nødvendig for at bekræfte, at fænotypen skyldes knock-down af målgenet. Redning af knock-down fænotype med cDNA af genet, enten den menneskelige ortolog eller en codon-modificeret version af zebrafisk genet, der ikke kan målrettes af AMO, giver et stærkt argument til fordel for fænotype specificitet. Manglende redning med den samme cDNA, der indeholder tab af funktion mutationer (såsom indførelsen af en tidlig stop codons) er et yderligere bevis i denne retning.
Her præsenterer vi en metode til at generere en zebrafisk DEPDC5 tab-of-funktion model og protokollen for adfærdsmæssige phenotyping på 28 og 48 timer efter befrugtning (HPF). Ved 28 hk forårsager DEPDC5 tab af funktion samlet hyperaktivitet, som det fremgår af forbedrede opspolings- og trækninger af embryonerne i chorionen. Et automatiseret bevægelsesdetekteringssystem kan på nuværende tidspunkt bruges til at kvantificere den samlede aktivitet pr. embryo. Med en 48 hk udviser zebrafisk stereotype flugtsvømning som reaktion på berøring. I zebrafisk med nedreguleret udtryk for DEPDC5er svømmebane betydeligt mere tortuous end i kontroller, fisken udviser et “korkskrue” eller “turn-wheel” lignende mønster, svarende til andre rapporterede epilepsimodeller i denne organisme3,4. Elektrofysiologiske optagelser blev opnået i den optiske tectum i zebrafisk larver mellem 4-6 dage efter befrugtning (dpf) og viser en baseline stigning i neuronal aktivitet i DEPDC5 knock-down dyr. Fordelen ved denne model er, at det præsenterer flere fænotypiske funktioner på forskellige tidspunkter, hvilket kan være nyttigt til overvågning og vurdering af effekten af lægemiddelbehandlinger under udvikling.
Epilepsi er en kompleks neurologisk sygdom, der byder på en bred vifte af ætiologier, der begynder at blive belyst med fremkomsten af genetisk sekventering teknologier25,26,27. Alsidige dyremodeller er afgørende for en effektiv translationel strategi, der vil give både indsigt i de patologiske mekanismer af genetisk forbundne epilepsier, samt målrettede behandlinger for de forskellige former for denne tilstand. Zebrafisk modeller har været meget effektive til at reproducere store træk ved epilepsi og giver pålidelige udlæsninger til anti-epileptisk lægemiddelscreening5,28. Spontane anfald kan påvises i genetisk modificerede zebrafisk15,29,30,31 og neurofysiologiske analyser i disse modeller28 har bekræftet det neuronale grundlag for den epileptiske-lignende adfærd32,33. Små zebrafisk larver er modtagelige for kemiske skærme i 96-brønds format ved hjælp af automatiseret påvisning af enkel adfærd, såsom spontan svømning, som giver mulighed for hurtig påvisning af potentielle terapier.
DEPDC5 knock-down modellen, der præsenteres her, opnås ved injektion af AMO i zebrafiskembrynet for at blokere genekspression under udvikling. Denne model præsenterer flere keystone fænotypiske funktioner i løbet af forskellige tidspunkter af larve udvikling, som kan bruges som indikatorer for terapi effektivitet under en kemisk eller genetisk screening protokol. Den AMO-medierede gen knock-down er en kraftfuld teknik, der viser fordele i forhold til kemisk inducerede beslaglæggelsesmodeller, da det specifikt er rettet mod ekspressionen af et interessegen, hvilket gør det muligt at identificere de underliggende patogene mekanismer udløst af en genetisk mutation. Kemiske inducere, som ikke desto mindre er potente værktøjer til lægemiddelscreeninger, kan fungere gennem flere cellulære veje, der måske ikke altid er relevante for den genetiske mutation, der undersøges. Mens AMO injektion er i sig selv en simpel teknik, når mestres af experimenter, det præsenterer også en række begrænsninger. Injektionerne skal udføres på et celletrin embryo; i vores hænder øgede injektioner på senere stadier i høj grad fænotypens variabilitet. Dette begrænser den tid, der er til rådighed til injektion. Derfor er en strategi for at generere æg til injektion i en tidssekvens nyttig. Vi bruger rutinemæssigt 4-5 kors, som vi åbner med 15-20 minutters mellemrum, så injektion af en kobling, før vi får den næste. Endvidere skal man sørge for at vurdere fænotypen på samme tid punkter mellem forskellige eksperimenter, som stereotype adfærd udvikler sig hurtigt i løbet af de første dage af udviklingen. Mængden og koncentrationen af AMOs skal også kontrolleres omhyggeligt, da generel toksicitet på grund af injektion af store mængder vil maskere den specifikke fænotype. De forskellige kontroller, der præsenteres i indledningen, er afgørende for at bestemme den rigtige injektionsdosis og den tilsvarende fænotype.
Feltoptagelser af larve zebrafiskhjernen er et nyttigt værktøj til at undersøge de skadelige virkninger af genetiske mutationer, der er involveret i forskellige hjernesygdomme på den globale neuronale aktivitet34. Depolariseringshændelser, der ses under disse eksperimentelle forhold , er en etableret metode til vurdering af elektrofysiologiske virkninger af lægemidler under forskellige epileptiske tilstande15,35. Vurderingen af disse virkninger er imidlertid for det meste sket kvalitativt snarere end kvantitativt og har en subjektiv observatør som aktør i analysen. Her udvikler vi en automatisk detektionsstrategi, der objektivt kan kvantificere hastigheden af depolariseringer, deres amplitud og varighed, og kan evaluere udviklingen af disse parametre over tid eller med forskellige genetiske eller farmakologiske interventioner.
De repræsentative resultater, der præsenteres her, viser depdc5’s forventede feltaktivitet i DEPDC5-knock-down genetisk model i forhold til en Mismatch-kontrol i 4-6 dpf zebrafisk før og efter anvendelsen af PTZ til at indføre epileptiform-lignende elektrikeraktivitet. Tidligere har vi vist en betydelig stigning i den basale aktivitet i DEPDC5 knockdown tilstand18. Her viser vi, at reaktionen af disse to betingelser til PTZ, en kemisk epileptiform aktivitet inducer, har en lignende bane i tide, begyndende med en periode med relativt lav frekvens, høj amplitude depolarization begivenheder og fortsætter med en periode med højere frekvens, lavere amplitude depolarization begivenheder. Feltregistreringshændelser har langsom dynamik (interessefrekvenser ligger i intervallet 0,005-0,2 s-1), derfor bruges både low-pass og high-pass filtre i denne protokol til at isolere interessehændelser. Efter at have elimineret lavfrekvent støj udføres påvisning af depolariseringshændelser ved hjælp af en simpel tærskel. Da statistikken for signalet er stærkt påvirket af tilstedeværelsen af depolariseringshændelser, kunne vi ikke bruge standardafvigelsen af det samlede signal til at bestemme denne tærskel. Variationen af værdien af standardafvigelsen på tværs af datasæt var større end de observerede registreringsstøjniveauer. Derfor brugte vi efter visuel inspektion af sporene en fast værdi af tærsklen på 0,3 mV for at undgå biasing forårsaget af forskellige niveauer af depolariseringsaktivitet.
Den beskrevne protokol giver en standardiseret og enkel metode til evaluering af motorisk adfærd og neuronal feltaktivitet, via ekstracellulær strømspændingsregistrering kombineret med automatisk påvisning af depolariseringshændelser i det optiske tectum, for at karakterisere epileptiformlignende fænotyper i zebrafiskmodeller.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke personalet på ICM’s elektrofysiologiplatform, hvor neurofysiologiforsøgene blev udført. Vi takker også Anca Marian for teknisk hjælp. SC blev støttet af Trampolin grant #21488. EK blev støttet af AFM Grant # 18469 og ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC blev støttet af ph.d.-priser fra Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) og ARSLA. For AD og RM blev dette arbejde støttet af tre bevillinger fra den rumænske nationale myndighed for videnskabelig forskning og innovation, CNCS-UEFISCDI (projektnumre PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 og COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), et tilskud fra EU’s Horisont 2020 forsknings- og innovationsprogram – tilskudsaftale nr. 668863-SyBil-AA og et nationalt videnskabsfondstilskud NSF-IOS-1656830 finansieret af den amerikanske regering.
Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60mM in water |
Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution) |
Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
Zebralab | Viewpoint, France | N/A |