כאן, אנו מציגים פרוטוקול להתפתחות ואפיון של מודל דג זברה של אפילפסיה הנובע מהעיכוב הארעי של הגן DEPDC5.
אפילפסיה מייצגת את אחת ההפרעות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר, המשפיעה על כ -50 מיליון אנשים ברחבי העולם. ההתקדמות האחרונה במחקר הגנטי חשפה קשת גדולה של גנים מעורבים בצורות שונות של אפילפסיה, המדגיש את האופי ההטרוגני של הפרעה זו. מודלים מתאימים של בעלי חיים חיוניים לחקירת המנגנונים הפתולוגיים המופעלים על ידי מוטציות גנטיות הכרוכות באפילפסיה ולפיתוח טיפולים ייעודיים וממוקדים. בשנים האחרונות, דגי זברה התגלו כאורגניזם בעל חוליות בעל ערך למידול אפילפסיות, עם שימוש הן במניפולציה גנטית והן בחשיפה לתרופות אפילפטוגניות ידועות, כגון פנטילנטטרזול (PTZ), כדי לזהות טיפולי אנטי אפילפטיים חדשניים. מוטציות מזיקות ברגולטור mTOR DEPDC5 קושרו לצורות שונות של אפילפסיות מוקדיות והפלה של האורתולוג של דג הזברה גורמת להיפראקטיביות הקשורה לפרקים ספונטניים דמויי התקפים, כמו גם פעילות אלקטרוגרפית משופרת ושחייה אופיינית לגלגל מסתובב. כאן תיארנו את השיטה הכרוכה ביצירת מודל אובדן התפקוד של DEPDC5 וממחישים את הפרוטוקול להערכת פעילות מוטורית במהירות של 28 ו-48 שעות לאחר ההפריה (hpf), וכן שיטה להקלטת פעילות שדה בקטקום אופטי של דגי הזברה. איור של ההשפעה של PTZ התרופה אפילפטוגנית על פעילות עצבית לאורך זמן מסופק גם.
בשל גודלו הקטן, התפתחותו ושקיפותו בשלבים המוקדמים של ההתפתחות, דגי זברה התגלו כאורגניזם בעל חוליות בעל ערך למידול מחלות אנושיות מגוונות כמו הפרעות לב וכלי דם, סרטן או נוירולוגיות1,2. דגי זברה משלבים את היתרונות של בעל חוליות, כולל שימור גבוה של ארכיטקטורת איברים וקוד גנטי, עם הגודל הקטן והקלות של מניפולציה גנטית של אורגניזמים מודל פשוט יותר, ולכן להקל הן מחקרים בסיסיים ויישומים תרגומיים. בפרט, הנוחות שלה סינון אוטומטי תפוקה גבוהה של התנהגות וסמנים פלואורסצנטיים של תהליכים תאיים הפכה את דגי הזברה למודל אטרקטיבי במיוחד למחקר אפילפסיה. זה הוכח על ידי עלייה גבוהה בעשור האחרון של מספר הפרסומים הכוללים מודלים כימיים ו / או גנטיים של אפילפסיה3,4,5 ולאחרונה, דיווחים על טיפולי מבטיחים שהתקבלו ממסכים כימיים בדגמים אלה6,7,8.
DEPDC5 הוא חבר במתחם GATOR1, רגולטור שלילי של איתות mTOR9. מוטציות בגן DEPDC5 התגלו לראשונה בשנת 2013 בפרובנדים הסובלים מאפילפסיה מוקדית אוטוזומלית דומיננטית10,11, ומאז דווחו במספר מצבים קליניים הקשורים לביטויים אפילפטיים מוקדיים ודיספלזיה קליפת המוח מוקד12. הרוב הגדול של המוטציות המדווחות צפויות לגרום לאובדן תפקוד של הגן12, וזה הוכח באופן רשמי עבור מספר תמלילים מוטציה DEPDC5 אשר ממוקדים על ידי שטויות בתיווך mRNA ריקבון12,13. בהסכמה, הפלה של אורתולוג הגן בדגי זברה באמצעות אנטיסנס מורפולינו אוליגונוקלאוטידים (AMOs) גורמת למספר תכונות הנפוצות במודלים אפילפטיים באורגניזם זה, כולל היפראקטיביות, שחייה דמוית גלגל מסתובב, התקפים ספונטניים ופעילות עצבית משופרת14,15,16,17,18. מעניין, טיפול עם rapamycin, מעכב של איתות mTOR, הפך את התכונות ההתנהגותיות של מודלזה 18, תמיכה בהשערה כי DEPDC5 אובדן תפקוד יכול לעורר אפילפסיה עקב misregulation של מסלול mTOR9,19.
הפלה חולפת של ביטוי גנים ב- vivo באמצעות אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס הנושאים את שינוי מורפולינו היה כלי רב ערך לחקר התפקיד של גנים ספציפיים, בדומה לטכניקות מבוססות si / shRNA. לאחרונה, אסטרטגיות מבוססות AMO מצאו גם יישומים קליניים, עם טיפול AMO הראשון שקיבל את אישור ה-FDA לטיפול בניוון שרירים Duchenne בשנת 201620. אמנם דווח כי בדגי זברה הפנוטיפ של נוק-אאוט גנטי חריף מבוסס AMO לא תמיד תואם עם מודלי נוק-אאוט מכוננים21, זה יכול להיות בשל לפחות במקרים מסוימים מנגנוני פיצוי נוצר על ידי שינויים גנטיים מכוננים22. עם זאת, הנושא של הספציפיות של פנוטיפ המושרה AMO הוא חשש בלתי מעורער כי יש לטפל בחריצות במחקרים באמצעות טכנולוגיה זו23. על מנת להבטיח את הספציפיות של פנוטיפ מבוסס AMO, מספר פקדי מפתח נחוצים. אלה כוללים עקומת תגובת מינון המאפשרת את הבחירה של המינון הנמוך ביותר של AMO יעיל עבור נוק-אאוט גנים, הימנעות רעילות כללית עקב כניסת עודף של חומר גנטי. השימוש AMO mismatch שאינו מכוון לאזור מסוים בגנום נדרש גם לביסוס מינון מתאים ובזיהוי פנוטיפ ספציפי. AMO שני אשר מכוון לאזור אחר של אותו גן, כגון AMO חסימת חיבור, יש צורך לאשר כי פנוטיפ נובע ההפלה של גן היעד. הצלת הפנוטיפ הנוק-אאוט עם ה- cDNA של הגן, האורתולוג האנושי או גרסה מותאמת קודון של גן דג הזברה שלא ניתן למקד על ידי ה- AMO, מספקת טיעון חזק לטובת הספציפיות הפנוטיפ. חוסר הצלה עם אותו cDNA המכיל מוטציות אובדן פונקציה (כגון הקדמה של קודונים עצירה מוקדמת) הוא הוכחה נוספת בכיוון זה.
כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת מודל אובדן תפקוד של דג זברה DEPDC5 והפרוטוקול עבור פנוטיפינג התנהגותי ב 28 ו 48 שעות לאחר ההפריה (hpf). ב 28 hpf, DEPDC5 אובדן תפקוד גורם היפראקטיביות כללית, כפי שמעיד על ידי סליל משופר ותנועות עוויתות של העוברים בתוך chorion. ניתן להשתמש במערכת אוטומטית לזיהוי תנועה בשלב זה כדי לכמת את הפעילות הכוללת לכל עובר. ב-48 כ”ס, דגי הזברה מציגים בריחה סטריאוטיפית בתגובה למגע. בדגי זברה עם ביטוי מופחת של DEPDC5, מסלול השחייה הוא הרבה יותר נזיקי מאשר בפקדים, הדגים המציגים “פקק בורג” או “גלגל מסתובב” כמו דפוס, בדומה לדגמים אחרים שדווחו אפילפסיה באורגניזם זה3,4. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות הושגו בקטטום האופטי בזחלי דגי זברה בין 4-6 ימים לאחר ההפריה (dpf) ומציגות עלייה בסיסית בפעילות העצבית בבעלי חיים נופלים DEPDC5. היתרון של מודל זה הוא שהוא מציג מספר תכונות פנוטיפיות בנקודות זמן שונות, אשר יכול להיות שימושי בניטור והערכה של היעילות של טיפולים תרופתיים במהלך הפיתוח.
אפילפסיה היא מחלה נוירולוגית מורכבת, הכוללת מגוון רחב של אטיולוגיות שמתחילות להתבהר עם הופעתן של טכנולוגיות ריצוף גנטי25,26,27. מודלים חייתיים מגוונים חיוניים לאסטרטגיה תרגומית יעילה שתניב הן תובנות למנגנונים הפתולוגיים של אפילפסיות המקושרות גנטית, כמו גם טיפולים ממוקדים לצורות הייחודיות של מצב זה. מודלים של דגי זברה היו יעילים מאוד בשחזור תכונות עיקריות של אפילפסיה ובספקת קריאות אמינות להקרנת תרופות אנטי-אפילפטיות5,28. התקפים ספונטניים ניתן לזהות דג זברה מהונדס גנטית15,29,30,31 וניתוח נוירופיזיולוגי במודלים אלה28 אישר את הבסיס העצבי של התנהגות דמוית אפילפטי32,33. זחלי דגי זברה קטנים ניתנים למסכים כימיים בפורמט של 96 טוב באמצעות זיהוי אוטומטי של התנהגות פשוטה, כגון שחייה ספונטנית, המאפשרת זיהוי מהיר של טיפולים פוטנציאליים.
מודל ההפלה של DEPDC5 המוצג כאן מתקבל על ידי הזרקת AMO לעובר דג הזברה כדי לחסום ביטוי גנים במהלך הפיתוח. מודל זה מציג מספר תכונות פנוטיפיות keystone במהלך נקודות זמן שונות של התפתחות זחל, אשר יכול לשמש אינדיקטורים של יעילות הטיפול במהלך פרוטוקול הקרנה כימית או גנטית. ההנמקה הגנטית בתיווך AMO היא טכניקה רבת עוצמה, המציגה יתרונות על פני מודלים של התקפים הנגרמים כימית, שכן היא מכוונת באופן ספציפי לביטוי גן מעניין, ובכך מאפשרת זיהוי של המנגנונים הפתוגניים הבסיסיים המופעלים על ידי מוטציה גנטית. תורמים כימיים, שהם בכל זאת כלים חזקים להקרנות סמים, יכולים לפעול דרך מסלולים תאיים מרובים שאולי לא תמיד רלוונטיים למוטציה הגנטית הנחקרת. בעוד הזרקת AMO היא כשלעצמה טכניקה פשוטה כאשר שולט על ידי הנסיין, זה גם מציג מספר מגבלות. הזריקות צריכות להתבצע בעובר שלב תא אחד; בידיים שלנו, זריקות בשלבים מאוחרים יותר הגדילו מאוד את השונות של פנוטיפ. זה מגביל את הזמן הזמין להזרקה; לכן, אסטרטגיה של יצירת ביצים להזרקה ברצף זמן היא שימושית. אנו משתמשים באופן שגרתי 4-5 צלבים שאנו פותחים במרווחים של 15-20 דקות, ומאפשרים הזרקה של מצמד אחד לפני קבלת הבא. יתר על כן, יש לנקוט זהירות כדי להעריך את הפנוטיפ בו זמנית נקודות בין ניסויים שונים, כמו התנהגויות סטריאוטיפיות להתפתח במהירות בימים הראשונים של ההתפתחות. הנפח והריכוז של AMOs חייב גם להיות נשלט בקפידה, כמו רעילות כללית עקב הזרקת כמויות מוגזמות יהיה להסוות את פנוטיפ ספציפי. הפקדים השונים המוצגים במבוא חיוניים לקביעת מינון ההזרקה הנכון והפנוטיפ המתאים.
הקלטות שדה של מוח דג הזברה הזחלי הן כלי שימושי לחקירת ההשפעות המזיקות של מוטציות גנטיות המעורבות בהפרעות מוחיות שונות על הפעילות העצבית העולמית34. אירועי דה-קוטביות שנראו בתנאים ניסיוניים אלה הם שיטה מבוססת להערכת השפעות אלקטרופיזיולוגיות של תרופות בתנאים אפילפטיים שונים15,35. עם זאת, ההערכה של השפעות אלה נעשתה בעיקר באופן איכותי ולא כמותי, ויש משקיף סובייקטיבי כשחקן בניתוח. כאן, אנו מפתחים אסטרטגיית זיהוי אוטומטית שיכולה לכמת באופן אובייקטיבי את קצב ההבהרה, המשרעת ומשך הזמן שלהם, ויכולה להעריך את ההתקדמות של פרמטרים אלה לאורך זמן, או עם התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות שונות.
התוצאות הייצוגיות המוצגות כאן מראות את פעילות השדה הצפויה של המודל הגנטי של DEPDC5 בהשוואה לבקרת אי התאמה בדגי זברה 4-6 dpf, לפני ואחרי היישום של PTZ להציג פעילות אלקטרוגרפית דמוית אפילפטיפורם. בעבר, הראינו עלייה משמעותית בפעילות בסיסית של מצב הנוקאאוט של DEPDC5 18. כאן, אנו מראים כי התגובה של שני תנאים אלה PTZ, תמריץ פעילות אפילפטיפורם כימי, יש מסלול דומה בזמן, החל בתקופה של תדירות נמוכה יחסית, אירועי פירוק משרעת גבוהה והמשך עם תקופה של תדירות גבוהה יותר, אירועי טיהור משרעת נמוכה יותר. לאירועי הקלטת שדות יש דינמיקה איטית (תדרים מעניינים נמצאים בטווח של 0.005-0.2s-1), ולכן הן מסנני מעבר נמוך והן מסנני מעבר גבוה משמשים בפרוטוקול זה כדי לבודד את אירועי העניין. לאחר ביטול רעש התדר הנמוך, זיהוי אירועי דה-פולאריזציה מתבצע באמצעות סף פשוט. מכיוון שהסטטיסטיקה של האות מושפעת מאוד מנוכחותם של אירועי דה-קוטביות, לא יכולנו להשתמש בסטיית התקן של האות הכולל כדי לקבוע סף זה. השונות בערך סטיית התקן בערכות נתונים הייתה גדולה מרמות רעש ההקלטה שנצפו. לכן, לאחר בדיקה חזותית של העקבות, השתמשנו בערך קבוע של הסף של 0.3 mV, על מנת למנוע את ההטיה הנגרמת על ידי רמות שונות של פעילות depolarization.
הפרוטוקול המתואר מספק שיטה סטנדרטית ופשוטה להערכת ההתנהגות המוטורית ופעילות השדה העצבי, באמצעות הקלטת מתח מלחציים זרם חוץ תאי בשילוב עם זיהוי אוטומטי של אירועי דה-פולאריזציה בקטטום האופטי, כדי לאפיין פנוטיפים דמויי אפילפטיפורם במודלים של דגי זברה.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לצוות פלטפורמת האלקטרופיזיולוגיה של ICM בה בוצעו הניסויים הנוירופיזיולוגיים. אנו מודים גם לאנקה מריאן על העזרה הטכנית. SC נתמך על ידי מענק טרמפולינה #21488. EK נתמך על ידי מענק AFM #18469 ומענק איחוד ERC (ALS-Networks). HC נתמך על ידי פרסי דוקטורט מן פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (PLP20141031462) ו ARSLA. עבור AD ו- RM, עבודה זו נתמכה על ידי שלושה מענקים מהרשות הלאומית הרומנית למחקר מדעי וחדשנות, CNCS-UEFISCDI (מספרי פרויקטים PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007, ו- COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), מענק מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי – הסכם מענק מס’ 668863-SyBil-AA, ומענק NSF-IOS-1656830 במימון ממשלת ארה”ב.
Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60mM in water |
Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution) |
Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
Zebralab | Viewpoint, France | N/A |