Her presenterer vi en protokoll for utvikling og karakterisering av en sebrafiskmodell av epilepsi som følge av den forbigående hemmingen av DEPDC5-genet.
Epilepsi representerer en av de vanligste nevrologiske lidelsene, og påvirker anslagsvis 50 millioner mennesker over hele verden. Nylige fremskritt innen genetisk forskning har avdekket et stort spekter av gener involvert i ulike former for epilepsi, og fremhever den heterogene naturen til denne lidelsen. Egnede dyremodeller er avgjørende for å undersøke de patologiske mekanismene utløst av genetiske mutasjoner implisert i epilepsi og for å utvikle spesialiserte, målrettede terapier. I de senere år har sebrafisk dukket opp som en verdifull virveldyrorganisme for modellering av epilepsier, med bruk av både genetisk manipulasjon og eksponering for kjente epileptogene legemidler, som pentylenetetrazol (PTZ), for å identifisere nye antiepileptika. Skadelige mutasjoner i mTOR-regulatoren DEPDC5 har vært assosiert med ulike former for fokale epilepsier og nedslag av sebrafisk orthologue forårsaker hyperaktivitet forbundet med spontane anfallslignende episoder, samt forbedret elektrografisk aktivitet og karakteristisk svinghjulssvømming. Her beskrev vi metoden som er involvert i å generere DEPDC5 tap av funksjonsmodell og illustrere protokollen for å vurdere motoraktivitet ved 28 og 48 h post befruktning (hpf), samt en metode for registrering av feltaktivitet i sebrafiskoptiske tectum. En illustrasjon av effekten av det epileptogene stoffet PTZ på nevronal aktivitet over tid er også gitt.
På grunn av sin lille størrelse, oviparous utvikling og åpenhet i tidlige stadier av utviklingen, har sebrafisk dukket opp som en verdifull virveldyrorganisme for modellering av menneskelige sykdommer så forskjellige som kardiovaskulære, kreft- eller nevrologiske lidelser1,2. Sebrafisk kombinerer fordelene ved en virveldyr, inkludert høy bevaring av organarkitektur og genetisk kode, med den lille størrelsen og enkel genetisk manipulering av enklere modellorganismer, og letter derfor både grunnleggende studier og translasjonelle applikasjoner. Spesielt har dens manglende evne til automatisert screening av atferd og fluorescerende markører av cellulære prosesser gjort sebrafisk til en spesielt attraktiv modell for epilepsiforskning. Dette har blitt demonstrert av en høy økning i det siste tiåret av antall publikasjoner med kjemisk induserte og / eller genetiske modeller av epilepsi3,4,5 og, mer nylig, rapporter om lovende terapeutiske midler hentet fra kjemiske skjermer i disse modellene6,7,8.
DEPDC5 er medlem av GATOR1-komplekset, en negativ regulator av mTOR-signalering9. Mutasjoner i DEPDC5-genet har først blitt oppdaget i 2013 i proband som lider av autosomale dominerende fokale epilepsier10,11, og har siden blitt rapportert i en rekke kliniske forhold forbundet med fokal epileptiske manifestasjoner og fokal kortikale dysplasi12. Det store flertallet av rapporterte mutasjoner er spådd å forårsake tap av funksjon av genet12, og dette ble formelt demonstrert for en rekke DEPDC5 muterte transkripsjoner som er målrettet av tull mediert mRNA forfall12,13. I samsvar resulterer nedslag av genet orthologue i sebrafisk ved hjelp av antisense morpholino oligonukleotider (AMOer) i en rekke funksjoner som er felles for epileptiske modeller i denne organismen, inkludert hyperaktivitet, svinghjullignende svømming, spontane anfall og forbedret nevronal aktivitet14,15,16,17,18. Interessant, behandling med rapamycin, en hemmer av mTOR-signalering, reverserte atferdsfunksjonene i denne modellen18, støtter hypotesen om at DEPDC5 tap av funksjon kan utløse epilepsi på grunn av en feilregulering av mTOR-banen9,19.
Forbigående nedslag av genuttrykk in vivo ved hjelp av antisense oligonukleotider som bærer morpholino modifikasjon har vært et uvurderlig verktøy for å studere rollen som spesifikke gener, på linje med si / shRNA-baserte teknikker. Nylig har AMO-baserte strategier også funnet kliniske applikasjoner, med en første AMO-terapi som mottar FDA-godkjenning for behandling av Duchenne muskelatrofi i 201620. Mens det ble rapportert at i sebrafisk fenotypen av akutt AMO-basert gen knock-down ikke alltid korrelere med de konstitutive knock-out modeller21, dette kan skyldes i det minste i noen tilfeller kompenserende mekanismer som fremkalles av konstitutive genetiske modifikasjoner22. Imidlertid er spørsmålet om spesifisitet av den AMO-induserte fenotypen en ubestridelig bekymring som må tas opp flittig i studier ved hjelp av denne teknologien23. For å sikre spesifisiteten til den AMO-baserte knock-down fenotypen, er det nødvendig med flere nøkkelkontroller. Disse inkluderer en doseresponskurve som gjør det mulig å velge den laveste dosen av AMO effektiv for gen-knock-down, og unngår generell toksisitet på grunn av innføring av et overskudd av genetisk materiale. Bruk av en mismatch AMO som ikke retter seg mot noen bestemt region i genomet er også nødvendig for å etablere en passende dose og i å identifisere en bestemt fenotype. En annen AMO som retter seg mot en annen region av samme gen, for eksempel en skjøteblokkerende AMO, er nødvendig for å bekrefte at fenotypen skyldes nedslag av målgenet. Redning av knock-down fenotypen med cDNA av genet, enten den menneskelige orthologue eller en codon-modifisert versjon av sebrafiskgenet som ikke kan målrettes av AMO, gir et sterkt argument til fordel for fenotype spesifisiteten. Mangel på redning med samme cDNA som inneholder tap av funksjon mutasjoner (som innføring av en tidlig stopp codons) er et ytterligere bevis i denne retningen.
Her presenterer vi en metode for å generere en sebrafisk DEPDC5 tap av funksjonsmodell og protokollen for atferdsfenotyping ved 28 og 48 h etter befruktning (hpf). Ved 28 hkf forårsaker DEPDC5 tap av funksjon generell hyperaktivitet, som det fremgår av forbedrede spole- og rykningsbevegelser av embryoene i koret. Et automatisert bevegelsesdeteksjonssystem kan brukes på dette stadiet for å kvantifisere den totale aktiviteten per embryo. Ved 48 hk viser sebrafisk stereotypt rømningssvømming som svar på berøring. I sebrafisk med nedregulert uttrykk for DEPDC5er svømmebanen betydelig mer tortuous enn i kontroller, fisken viser en “kork-skrue” eller “svinghjul” som mønster, ligner andre rapporterte epilepsimodeller i denne organismen3,4. Elektrofysiologiske opptak ble oppnådd i det optiske tectum i sebrafisk larver mellom 4-6 dager etter befruktning (dpf) og viser en baseline økning i nevronaktivitet i DEPDC5 knock-down dyr. Fordelen med denne modellen er at den presenterer flere fenotypiske egenskaper på forskjellige tidspunkter, noe som kan være nyttig for å overvåke og vurdere effekten av narkotikabehandlinger under utvikling.
Epilepsi er en kompleks nevrologisk sykdom, med et bredt spekter av etiologier som begynner å bli belyst med fremkomsten av genetisk sekvenseringsteknologi25,26,27. Allsidige dyremodeller er avgjørende for en effektiv translasjonsstrategi som vil gi både innsikt i de patologiske mekanismene til genetisk koblede epilepsier, samt målrettede terapier for de distinkte formene for denne tilstanden. Sebrafiskmodeller har vært svært effektive til å reprodusere store egenskaper ved epilepsi og gi pålitelige avlesninger for antiepileptikascreening5,28. Spontane anfall kan påvises i genetisk modifisert sebrafisk15,29,30,31 og nevrofysiologisk analyse i disse modellene28 har bekreftet det nevronale grunnlaget for epileptisk-lignende oppførsel32,33. Små zebrafish larver er egnet til kjemiske skjermer i 96-brønns format ved hjelp av automatisert deteksjon av enkel oppførsel, for eksempel spontan svømming, noe som muliggjør rask påvisning av potensielle terapeutiske midler.
DEPDC5-nedslagsmodellen som presenteres her, oppnås ved injeksjon av AMO i sebrafiskembryoet for å blokkere genuttrykk under utvikling. Denne modellen presenterer flere keystone fenotypiske egenskaper under forskjellige tidspunkter for larvutvikling, som kan brukes som indikatorer på terapieffektivitet under en kjemisk eller genetisk screeningprotokoll. Den AMO-medierte gen-knock-down er en kraftig teknikk som viser fordeler i forhold til kjemisk induserte anfallsmodeller, da det spesifikt retter seg mot uttrykket av et gen av interesse, og dermed tillater identifisering av de underliggende patogene mekanismene utløst av en genetisk mutasjon. Kjemiske indusere, som likevel er potente verktøy for narkotikascreening, kan virke gjennom flere cellulære veier som kanskje ikke alltid er relevante for den genetiske mutasjonen som studeres. Mens AMO-injeksjon i seg selv er en enkel teknikk når den mestres av eksperimentet, presenterer den også en rekke begrensninger. Injeksjonene må utføres på ett cellestadium embryo; i våre hender økte injeksjoner på senere stadier sterkt variasjonen av fenotypen. Dette begrenser tiden som er tilgjengelig for injeksjon; Derfor er en strategi for å generere egg til injeksjon i en tidssekvens nyttig. Vi bruker rutinemessig 4-5 kryss som vi åpner med 15-20 min intervaller, slik at injeksjon av en clutch før du får den neste. Videre må det tas hensyn til å vurdere fenotypen samtidig mellom ulike eksperimenter, da stereotype atferd utvikler seg raskt i løpet av de første utviklingsdagene. Volumet og konsentrasjonen av AMOer må også kontrolleres nøye, da generell toksisitet på grunn av injeksjon av store mengder vil maskere den spesifikke fenotypen. De ulike kontrollene som presenteres i innledningen er avgjørende for å bestemme riktig injeksjonsdose og den tilsvarende fenotypen.
Feltopptak av larval sebrafiskhjernen er et nyttig verktøy for å undersøke de skadelige effektene av genetiske mutasjoner involvert i forskjellige hjernesykdommer på den globale nevronaktiviteten34. Depolariseringshendelser sett under disse eksperimentelle forholdene er en etablert metode for å vurdere elektrofysiologiske effekter av legemidler under forskjellige epileptiske forhold15,35. Vurderingen av disse effektene er imidlertid for det meste gjort kvalitativt i stedet for kvantitativt, og har en subjektiv observatør som aktør i analysen. Her utvikler vi en automatisk deteksjonsstrategi som objektivt kan kvantifisere depolariseringshastigheten, deres amplitude og varighet, og kan evaluere fremdriften av disse parametrene over tid, eller med forskjellige genetiske eller farmakologiske intervensjoner.
De representative resultatene som presenteres her viser den forventede feltaktiviteten til DEPDC5 knock-down genetisk modell i forhold til en Mismatch kontroll i 4-6 dpf sebrafisk, før og etter anvendelsen av PTZ for å introdusere epileptiform-lignende elektrografisk aktivitet. Tidligere har vi vist en betydelig økning i basalaktiviteten til DEPDC5 knockdown tilstand18. Her viser vi at responsen fra disse to forholdene til PTZ, en kjemisk epileptiform aktivitets induser, har en lignende bane i tide, starter med en periode med relativt lav frekvens, høy amplitude depolarisering hendelser og fortsetter med en periode med høyere frekvens, lavere amplitude depolarisering hendelser. Feltregistreringshendelser har langsom dynamikk (frekvenser av interesse er i området 0,005-0,2 s-1), derfor brukes både lavpass- og høypassfiltre i denne protokollen for å isolere hendelsene av interesse. Etter å ha eliminert lavfrekvent støy, utføres påvisning av depolariseringshendelser ved hjelp av en enkel terskel. Siden statistikken over signalet er sterkt påvirket av tilstedeværelsen av depolariseringshendelser, kunne vi ikke bruke standardavviket til det totale signalet for å bestemme denne terskelen. Variasjonen av verdien av standardavviket på tvers av datasett var større enn de observerte registreringsstøynivåene. Derfor, etter visuell inspeksjon av sporene, brukte vi en fast verdi av terskelen på 0,3 mV, for å unngå skjevheter forårsaket av forskjellige nivåer av depolariseringsaktivitet.
Den beskrevne protokollen gir en standardisert og enkel metode for evaluering av motorisk oppførsel og nevronal feltaktivitet, via ekstracellulær strømspenningsopptak kombinert med automatisk deteksjon av depolariseringshendelser i det optiske tectum, for å karakterisere epileptiformlignende fenotyper i sebrafiskmodeller.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke de ansatte i ICM elektrofysiologiplattformen der nevrofysiologieksperimentene ble utført. Vi takker også Anca Marian for teknisk hjelp. SC ble støttet av Trampoline Grant #21488. EK ble støttet av AFM Grant #18469 og ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC ble støttet av PhD Awards fra Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) og ARSLA. For AD og RM ble dette arbeidet støttet av tre tilskudd fra den rumenske nasjonale myndigheten for vitenskapelig forskning og innovasjon, CNCS-UEFISCDI (prosjektnummer PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007, og COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), et stipend fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 – tilskuddsavtale nr.
Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60mM in water |
Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution) |
Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
Zebralab | Viewpoint, France | N/A |