Summary
このプロトコルでは、キイロショウジョウバエナノ注入法と基本的なテクニックを使用して、ウイルスとの相互作用を分析する生体内でウイルス感染を確立する方法について説明します。
Abstract
ウイルスの拡散は、流行病の主要な原因です。したがって、ウイルスとホスト間の相互作用を理解することは非常に重要なウイルス感染症の治療と予防の知識を拡張します。ミバエ ショウジョウバエ メランogasterが画面の抗ウイルスの要因と強力な遺伝学的ツールと非常に節約された生得の免疫のためのウイルス-宿主の相互作用を調査する最も効率的かつ生産的なモデル生物の一つであることが証明されてシグナル伝達経路。ここで説明する手順は、ウイルス感染を確立し、成虫の全身性抗ウイルス反応を引き起こすナノ射出方法を示します。この方法でウイルス注入量の正確なコントロールにより、実験再現性の高い。本研究では説明されているプロトコルには、ハエとウイルス、注入方法、生存率分析、ウイルス負荷測定、抗ウイルス経路評価の準備が含まれます。ハエの背景によってウイルス感染の影響効果はここで言及されました。この感染方法は行い易い定量的再現;それは、画面のウイルスとの相互作用におけるホスト/増殖因子、免疫シグナル伝達とウイルス感染への応答の他の生物学的経路間のクロストークを解剖に適用できます。
Introduction
特に、チクングニア ウイルス1などのアルボ ウイルスによるウイルス感染を新興デング熱ウイルス、黄熱ウイルス2とジカウイルス3がパンデミックを引き起こすことによって国民の健康に大きな脅威をされています。4します。 したがって、流行の制御と人間のウイルス性疾患の治療のためにますます重要なっているウイルスとの相互作用の理解を深める。この目標のためウイルス感染のメカニズムを調査するより適切かつ効率的なモデルを確立されなければなりません。
ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ (キイロショウジョウバエ)、ウイルス-宿主相互作用5,6を調査するための強力なシステムを提供し、人間のウイルス性疾患7を勉強する最も効率的なモデルの一つであると証明しました。,8,9します。 シグナル伝達経路と比類のない遺伝的ツールを作る非常に節約された抗ウイルス剤ハエ人間抗ウイルス研究にとって重要な意味を持つ重要な結果を生成する素晴らしいモデル。さらに、ハエ簡単で安価な実験室で維持するために、感染時に新規調節因子6,10ウイルスのホストの大規模スクリーニングに最適。
4 つの非常に節約された抗ウイルス経路 (e.g、RNA 干渉 (RNAi) 経路11、JAK-STAT 経路12、NF-κ b の経路、オートファジー経路13) 最近ではショウジョウバエの十分に研究。年6。RNAi の経路は、ウイルス感染症6,14のほとんどの種類を抑制することができます広範な抗ウイルス機構です。ダイサー 2 (Dcr-2)やアルゴノート 2 (AGO2)のような遺伝子の突然変異によって、この経路の障害は、大量のウイルス力価およびホスト死亡15,16,17につながります。JAK-STAT 経路はDicistroviridae家族と昆虫、例えばフラビ家族からウイルスによって感染の制御に関与している、ハエ16および西ナイル ウイルス (WNV) におけるショウジョウバエ C ウイルス (DCV)。蚊18,19のデング熱ウイルス。ショウジョウバエの通行料 (人間の NF-κ B の経路に相同性) と免疫不全 (IMD) 経路 (人間 NF-κ B と TNF 経路に類似) はウイルスの侵略20,21,を守るために関与して22. オートファジーはショウジョウバエ23,24のよく特徴付けられるウイルス感染の制御に関わる別の節約されたメカニズム。したがって、これらの経路と解離性クロストークこれら抗ウイルス シグナル伝達とその他の新規調節因子の同定ショウジョウバエの代謝、老化、神経反応などの生物学的経路が簡単に設定することができますシステム。
ショウジョウバエで最もよく確立されたウイルス感染モデルは RNA ウイルス、無脊椎動物の虹色ウイルス 6I による感染によって引き起こされるが (4-6) カリテア ウイルス飛んで25、DNA ウイルスの研究の可能性を示していると 26。さらに、ウイルスは、ショウジョウバエの遺伝学9インフルエンザ ウイルスなどの感染を許可するように変更もできます。これはショウジョウバエスクリーニング プラットフォームのアプリケーションを大きく拡げた。この手順では、DCV の使用例としてショウジョウバエのウイルス感染システムを開発するのに方法を説明します。DCV は約 9300 のヌクレオチドの肯定的な感覚単一鎖の RNA ウイルス 9 タンパク質27をエンコーディングします。キイロショウジョウバエ自然な病原体として DCV ホスト ウイルスの相互作用と共進化28における生理・行動・基礎免疫応答をホストに適切なウイルスとしてと見なされます。さらに、野生型のハエで感染の急速な死亡率は、DCV 耐性や影響を受けやすい遺伝子のスクリーニングに有用なホスト29です。
しかし、ショウジョウバエのウイルス感染症を勉強して懸念のいくつかの側面もあります。たとえば、共生細菌ボルバキアはショウジョウバエと蚊の30,31,32の RNA ウイルス増殖の広いスペクトルを抑制する能力を持っています。最近の証拠は、どのボルバキアブロック シンドビス ウイルス (SINV)、アップレギュレーションを介しての感染メチルトランスフェラーゼ ホスト33Mt2 式の可能なメカニズムを示しています。また、昆虫の遺伝的背景もウイルス感染のために重要です。たとえば、 pastrel (pst)、遺伝子の天然ポリモーフィズム決まりますショウジョウバエ34,35、DCV 感染に対する感受性間Ubc E2HとCG8492の軌跡コオロギ麻痺ウイルス (CrPV) とそれぞれ36群れ家ウイルス) 感染に関与しています。
ショウジョウバエのセル行37,38, 口腔のホスト細胞成分の高スループット画面など研究目的に応じて、ハエでのウイルス-宿主相互作用を確立する特定の方法を選択する必要があります。腸に特有な抗ウイルス応答22,39,40, 全身の免疫を刺激するために上皮性の障壁を渡すことによって41,42やナノ注射をチクチク針を勉強する感染症応答。正確に実験的再現性の高い44保証制御抗ウイルス反応と生理学的病変43を誘発するウイルスの線量がナノ注射によって制御できます。この研究では、ショウジョウバエ, ハエの背景効果の重要性を強調におけるウイルス-宿主間相互作用を研究するナノ注入法について述べる。
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Protocol
注: 実験を開始する前に細胞株およびはえの在庫を使用する必要がありますによって汚染されない他の病原体、特に X ウイルス (DXV) と鶏腎炎ウイルス (ANV) DCV、FHV、ショウジョウバエなどウイルスのため。理想的には、RNA シーケンスまたは簡単の PCR による同定は、汚染10,45を検出する使用されます。汚染が発生した場合、細胞およびはえの在庫は使用しないでください以上になるまでは完全に除染46。
1. ウイルスとフライの準備
- ウイルスの伝搬とコレクション
注:ショウジョウバエS2 * 細胞は DCV の伝播と滴定に使用されます。S2 * 細胞ラインは、後期段階のキイロショウジョウバエの胚の培養から派生されます。このセルの行になっている47を前述します。- 1 x 107実行可能な細胞/ml の密度で、10 cm の細胞培養ディッシュで緩い、半付着性単分子膜として S2 * 追加 CO2、25 ° C でシュナイダーのショウジョウバエ培地で細胞を成長します。S2 のセルの使用完全培地: シュナイダーのショウジョウバエ培 10% 熱不活化 FBS、100 単位/ml ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシン。
注: 健康な細胞が円形および展示物の均一なサイズ。 - -80 ° C の 25 ° C の水浴中から DCV 株式をすばやく解凍します。S2 * MOI で DCV の細胞に感染する細胞培養皿にウイルス溶液 1 mL を直接追加することによってすぐに 0.01 (成長分野: 55 cm2) S2 のセルの完全培地 10 mL で。
- 25 ° c の細胞を 3 〜 5 日にインキュベートします。ウイルスがコレクションの準備ができて、細胞の形態が異常 (細胞の形に見えるぼかし) 培養液は黒い粒子細胞の残骸を示す。
- ピペッティングを上下で 15 mL チューブの全細胞の培養を収集し、-80 ° C で凍結 (の年まで)。
注: DCV は、1 年間-80 ° C の時の感染、損失は最小限で長時間保存することができます。 - 一定の揺れで 25 の ° C の水浴で細胞培養を解凍し、4 ° C で 15 分間、6,000 × g で遠心分離滅菌 15 mL チューブと渦の上澄みを収集します。チューブあたりウイルス ソリューションの 200 μ L まで因数。
注:-80 ° C で最長 1 年間、4 ° C で最大 3 日間の短い期間のためにウイルスの因数が格納できます。凍結融解の繰り返しは避けてください。常に、一度にすべての因数を使用することをお勧めします。 - 細胞変性効果 (CPE) 法による平均ウイルスの組織培養感染量 (TCID50) を決定するための 5 のランダムなウイルスを含んでいるチューブを選ぶ (TCID50の 1 単位 = 0.7 プラーク形成単位 [PFU])。
注: CPE は、ウイルスの侵入によって引き起こされる宿主細胞の構造変化を指します。感染しているウイルスは、48を再現することができないのための溶解せずセルが死ぬときの宿主細胞の換散を引き起こします。- 1 日目、ピペッティングにより準備された S2 * 細胞を収集します。セル数をカウントします。4 分の 300 x g 細胞を遠心分離し、上澄みを廃棄します。S2 * セル 1.1.1 の手順で説明したように完全培地と 1 x 106細胞/ml の密度に細胞を希釈します。
- 種子 1 x 105 S2 * にフラット下 96-ウェル プレート (~ 30% の confluency) ウェルあたりの細胞 (100 μ L)。
- S2 のセルの完全培地で DCV 在庫のシリアルの 10 倍希釈を実行します。井戸の中に 50 μ L の希釈液を追加します。負の制御としても分類もせずウイルス培養液 50 μ L を追加します。
注: 各希釈率 8 井戸が使用されました。典型的な DCV 収量は約 108-109 PFU/mL、希釈する必要があります少なくとも 〜 10-5-10-10をカバーしています。 - 4 日目、20 X、40 X 目的明視野顕微鏡による CPE を観察します。セルがぼやけてよくを分類し、媒体はの「肯定的なまあ」と細胞の形態は「否定的な井戸」として、通常よく断片がいっぱい。
- マーク CPE の正または負の井戸 + または-、それぞれ。リードと Muench 法49ウイルス TCID50を計算します。
- すべての汚染物質と汚染除去パン手袋を破棄します。ウイルス、目的 TCID50に到達できない場合は 4 ° C で 1 時間 68,000 × g で遠心分離ウイルス溶液 100 mL を集中します。
注: 10 から用量の範囲、実験の目的によってウイルス感染2 106 TCID50 ユニットを使用できます。3 x 106 TCID50 単位を使います。 - 上澄みを廃棄し、再 1 mL のトリス塩酸バッファー (10 mM、pH 7.2) で中断します。チューブ、-80 ° C で店ごとウイルス ソリューションの 20 μ L 分注TCID50の平均のウイルスを再度決定するため 5 のランダムなチューブを選択します。
- 1 x 107実行可能な細胞/ml の密度で、10 cm の細胞培養ディッシュで緩い、半付着性単分子膜として S2 * 追加 CO2、25 ° C でシュナイダーのショウジョウバエ培地で細胞を成長します。S2 のセルの使用完全培地: シュナイダーのショウジョウバエ培 10% 熱不活化 FBS、100 単位/ml ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシン。
- 感染症のための準備を飛ぶ
注: 共生細菌ボルバキアは昆虫30,31,32,33,41RNA ウイルス感染症の多くの種類を抑制できます。したがって、体内のホスト ウイルス感染症33を勉強する前にハエからボルバキアをパージする不可欠です。- (食品の 1 L がコーンミール、32.19 グラム酵母、寒天、CaCl2 0.726 g の 10.6 g の 77.7 g 含まれている新鮮な標準のコーンミール フライ食品の 4 g (70% エタノール) で 50 μ g/mL テトラサイクリンの 400 μ L の追加によってテトラサイクリンを含んでいるはえの食糧を準備します。、スクロース、グルコース、ソルビン酸カリウム、5% C8H8O3の 15 mL の 2 g の 63.3 g の 31.62 g)。徹底的にミックスし、エタノールを蒸発させるため一晩に 4 ° C で食品を配置します。
注: エタノールの高用量フライ不妊、ので、この手順を省略しないでくださいがあります。 - 部屋の温度に食品を温めるし、バイアルに新しくこの成虫 (20 女性と男性 10 例) を置きます。25 ° C、通常の明暗サイクルの下で湿度 60% でハエを繁殖させます。
注: 一般に、それは十分な卵を産むハエの 3-4 日かかります。あまりにも多くの卵幼虫開発を阻害して、テトラサイクリンの効率を減らします。 - 新しくこの成虫を収集 (内 3 ~ 5 日) CO2、および手順の光の流れの下で ~ 1.2.1-1.2.2。通常、少なくとも 3 世代が完全にボルバキアの除去のため必要です。
- テトラサイクリンの治療、3 世代を収集後、5 はボルバキア感染テスト用の CO2の光の流れの下で飛ぶ。二重蒸留水 (ddH2O) の 250 μ L、圧力式ホモジナイザーを使用して 1.5 mL チューブにいくつか 0.5 mm 滅菌セラミック ビーズと 1 分のためハエを挽きます。2 倍の 250 μ L 別バッファー A を追加 (0.2 2 %sds; 0.2 M EDTA M トリス-HCl、pH 9.0) サンプルと渦に。
注: ので SDS は、ビーズの動きを妨げるが、バッファー × 1 直接使用できませんハエを挽く。ハエは、赤い目をしている、DNA 製品の色に影響を与える可能性があります、研削の前に頭を削除します。 - -80 ° C (最大 1 年間保管) でサンプルを凍結します。すぐに解凍、25 ° C の水浴溶解するまで-80 ° C からのサンプル。70 ° C、30 分でサンプルをインキュベートします。
- 追加 5 190 μ M KOAc、渦氷上に 15 分以上インキュベートして。
- 室温で 5 分間 13,000 x g でサンプルを遠心上清を収集し、新しいチューブに移してください。
- 1.2.7 より良い品質で DNA を取得する手順を繰り返します。
- 各サンプルにイソプロパノールの 750 μ L を追加し、そっと手で数回を反転します。5 分間室温でインキュベートします。
- 室温で 5 分間 13,000 x g でサンプルを遠心し、上澄みを廃棄します。白ゲノム DNA の餌は、管の底に留まるでしょう。
- ペレット、13,000 x g で 5 分間遠心する 70% エタノール 1 mL を追加し、上澄みを廃棄します。DNA は、それが透明になるまで風乾します。
- DdH2O の 100 μ L の DNA を溶解、紫外可視吸光法による DNA 濃度を滴定し、100 ng/μ L に DNA を希釈します。
- 使用 200 ng の DNA の PCR の反作用 (20 μ L システム材料の表を参照してください)。次のプログラムによって PCR を実行: 95 ° C、15 分;36 サイクル 95 ° C の 45 s、50 ° C の 45 秒、72 ° C 1 分;・ サーマルサイクラーに最終的な拡張ステップ (72 ° C 1 分)。
注: は、ボルバキア 16S rRNA に基づき、次のプライマーを使用: 5' TGAGGAAGATAATGACGG 3' (フォワード) と 5' CCTCTATCCTCTTTCAACC 3' (リバース)。Wsp、プライマーが 5' CATTGGTGTTGGTGTTGGTG 3' (フォワード) と 5' ACCGAAATAACGAGCTCCAG 3' (リバース)。 - 1% の agarose のゲルの電気泳動で PCR の製品を分析します。ボルバキア16S rRNA とwspの PCR の製品のサイズは約 200 bp と 600 bp、それぞれ。
- 標準のコーンミール フライ食品のボルバキア無料フライ ストックをリア.3-5 日新しくこの男性が飛ぶ感染症の収集。
注: テトラサイクリンの治療は、その後ホストの抗ウイルス応答に影響を与える腸内細菌叢構成にも影響を及ぼします。すべてのハエがテトラサイクリンの同じ処置を受け取ることをお勧めします。ボルバキア無料ハエの腸内細菌叢を復元するのには、少なくとも 3 世代のための標準的な条件の下で成長を続けます。
- (食品の 1 L がコーンミール、32.19 グラム酵母、寒天、CaCl2 0.726 g の 10.6 g の 77.7 g 含まれている新鮮な標準のコーンミール フライ食品の 4 g (70% エタノール) で 50 μ g/mL テトラサイクリンの 400 μ L の追加によってテトラサイクリンを含んでいるはえの食糧を準備します。、スクロース、グルコース、ソルビン酸カリウム、5% C8H8O3の 15 mL の 2 g の 63.3 g の 31.62 g)。徹底的にミックスし、エタノールを蒸発させるため一晩に 4 ° C で食品を配置します。
- Pastrelジェノタイピング
注:ショウジョウバエ34,35DCV 感染に影響を与える遺伝的背景でpst遺伝子の S または R の対立遺伝子の存在を報告されています。DCV 感染症の特に、 pst遺伝子をチェックする必要があります。ウイルス感染に影響を与えることができますpstを少数 Snp がある、主要な SNP が 512 C/t.温度勾配 PCR は、 pstの遺伝子型を識別するために迅速な方法です。- 抽出は、(ステップ 1.2.4 - 1.2.15) 上記のようにゲノム DNA を飛ぶ。
- 使用 100 ng のテンプレート、512 C プライマー 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTC として DNA の 3' (フォワード) と 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (リバース) R 対立遺伝子、512T プライマー 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTT を検出する 3' (フォワード) と 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (リバース) を検出するため、S 対立遺伝子。
- Tm (溶ける温度) グラデーションを次のように設定: 54 ° C、54.7 ° C、55.5 ° C、58 ° C、59.7 ° C、62.2 ° C、63.7 ° C、および 64 ° C (45 s 各温度で)。
注: PCR の連鎖反応の 30 サイクルが (20 μ L システム) をお勧めします。 - 2% の agarose のゲルの電気泳動によって 100 bp の PCR の製品を視覚化します。
2 ショウジョウバエでウイルス感染症
-
ナノ注入によるハエに感染し、生存アッセイを実行します。
- 注射針を準備する毛細血管を引っ張って、注射針のオイルとインジェクターを組み立てる埋戻し前述したように50。
- CO2の光の流れの下のパッドにハエを anaesthetize します。胸腔内圧注入44 50.6 のハエを接種ウイルス ソリューション (pH 7.2 トリス塩酸バッファーで希釈 100 PFU) の nL。ハエ (バイアルあたり 20 ハエ) の少なくとも 3 バイアルを注入します。
注: 注射は時間がかかる (時間あたり通常 100 ハエ)、DCV レプリケーションは非常に急速なので一度仕上げ各バイアル (20 ハエ) チューブの正確な時刻を記述する非常に重要です。バッファーのみ注入は、モック コントロールとして設定されます。通常、オス成虫が最寄りより安定し、交配と繁殖ホルモン変動は女性51の読み出しに影響を与えるので、女性を使用するよりも再現性のある結果のとおり。 - 25 ° C で注入されたハエ、通常明暗周期下の湿度を 60% 育ちます。毎日新鮮な食材を使ってハエを供給し、死んだ害獣の数を記録します。
- 少なくとも 3 生物的複製を実行し、生存曲線をプロットします。
- 生存データの統計解析、統計ソフトウェアでカプラン ・ マイヤー生存曲線を生成します。ログランク検定 P 値を計算するを実行します。生存表各件名の情報を入力します。ソフトウェアは、各時にパーセントの生存を計算し、カプラン ・ マイヤー生存率プロットをプロットします。
注: は、バイアルに追加酵母を追加しないでください。モックのコントロールと比較して、DCV 感染ハエ時折腹水、不器用なそれらに粘着性の酵母に脆弱性が存在しています。感染したハエの大量死が起こる時間枠を確認する予備実験でより多くの時間ポイントを記録することをお勧めします。一般的に、感染したハエめったDcr 2突然変異系統のも最初の 2 日以内に死にます。この時間枠は、ボルバキア無料 w1118 (ブルーミントン 5905) フライ感染 DCV の 100 PFU と、約 3-5 日の感染症記事。0.5 h のポスト噴射時間以内に死ぬショウジョウバエいないとしてカウントすべき死亡彼らは針のけがで殺される可能性がありますのでウイルス感染ではなく。
-
DCV は、CPE 法で測定をロードします。
注: ウイルス負荷ウイルス株 (ステップ 1.1.6) の滴定で同様に測定追加試料 (ステップ 2.2.1-2.2.4) が必要です。- 1 日目、2.1.1-2.1.2 の手順で説明するよう男性のハエに感染します。20 のグループに挿入されたハエをグループ化し、それらを保つため新鮮なはえの食糧 (通常は 24 h または 3 日) 希望の時間のために成長しています。毎日新鮮な食材をハエを提供します。
- 2 日目、シードショウジョウバエS2 * 約 5 の密度に 10 cm 細胞培養皿の細胞 x106 1 x 107セル/mL 1.1.1 の手順で説明するように。
- 3 日目、5 ハエ (下 CO2の光の流れ) を収集し、30 1.5 mL 遠心管で挽く Tris バッファーは、ホモジナイザーを使用してセラミック ビーズの 200 μ L と s。-80 ° c のサンプルを格納またはすぐに次のステップに進みます。
- 徹底的に渦サンプル。使用 1 mL 注射器、0.22 μ m フィルターを新しい 1.5 mL チューブに上清。手順 1.1.6.1-1.1.6.5 で説明したように、滴定を続行します。
-
QRT pcr 法による測定 DCV 負荷
- 1 日に前述の通りハエに感染します。グループ挿入された男性 (20 ハエ/グループ) に飛ぶし、希望の時間は、通常 24 h または 3 日間新鮮なはえの食糧の成長します。毎日新鮮な食材をハエを提供します。
- 3 日目、換散バッファーと 20 セラミック ビーズの 200 μ L と 1.5 mL チューブに CO2の光の流れ下 5 のハエを収集 (直径 0.5 mm の =)、各管に追加換散バッファーの 30 s. 追加 800 μ L の高速ホモジナイザーによる試料を挽く、店舗、s-80 ° c またはすぐにサンプルは、RNA の抽出および qRT PCR を行います。
- RNase フリーのヒントは、チューブを準備し、純水、ジエチルピロカーボネート (DEPC) で処理し、0.22 μ m 膜フィルター水。200 μ L のクロロホルム (≥99.5%) を追加します。サンプルと精力的に 15 の振る手で s。水相と有機相を明確に分離するまで 5 分以上を室温でインキュベートします。
注: クロロホルムが非常に危険で、注意して処理する必要があります。ボルテックスにかけないでください DNA 汚染の危険性を増加するサンプルです。 - 4 ° C で 15 分間 13,000 × g で遠心分離機サンプル
- 上清の 400 μ L を収集し、上清を新しいチューブに転送します。同じボリューム イソプロパノール (≥ 99.5%) を混ぜて、軽く手で 20 回のサンプルを反転、室温で 10 分間以上を沈殿します。
注:-20 ° C で降水量は RNA の収穫になります。 - 4 ° C で 10 分間 13,000 × g で遠心分離機サンプル白 RNA ペレットが管の下部に表示されます。
- 上澄みを廃棄し、70% エタノール (エタノール DEPC 水で) の 1 つの mL を追加し、RNA を洗うために数回を反転します。
- 4 ° C で 5 分間 13,000 × g で遠心分離機サンプル5-10 分のため清と乾燥の RNA を破棄します。RNA は、透明になる必要があります。
- 50 μ L の DEPC 水ピペット、サンプルのいくつかの時間と渦を追加します。
- RNA 濃度を滴定のためには、RNA の 3 μ L を取る。260 で RNA を定量化する nm。通常、このプロトコルによって抽出した RNA 濃度は、約 100-500 μ g/μ L、cDNA 合成に適しています。
- CDNA を合成する RNA の 2 μ g を使用します。DdH2O、-20 ° C でストアの 100 μ L のサンプルを希釈します。
- 製造元の指示に従って qRT PCR を行い、qRT PCR を実行します。
注: DCV の cDNA 合成、任意プライマー働いたポリ A プライマーより私たちの手で。DCV mRNA 発現は 49 (rp49) mRNA の内因性のリボソームタンパク質に正規化されます。このパーツで使用のオリゴヌクレオチドのプライマー: rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (フォワード) と 5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (逆) になります。DCV、5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (フォワード) と 5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (逆) になります。迷走神経、5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (フォワード) と 5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (逆) になります。ウイルス性 RNA 1 (vir-1) 5' 3' GATCCCAATTTTCCCATCAA (フォワード) と 5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (リバース)。
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Representative Results
キイロショウジョウバエの DCV 感染後は、このセクションの結果が得られます。図 1は、ショウジョウバエのウイルス感染のフロー チャートを示します。ハエは内 thoracically ただ、注入され、ウイルス TCID50とゲノム RNA レベル (図 1) の測定のためのサンプルの収集し。ウイルス感染細胞の換散を引き起こすことができるし、CPE は 3 日間ポスト感染症 (図 2 a) で観測されました。ウイルス負荷を CPE 法で測定するに伴い qPCR (図 2 b) によって測定されます。図 3に示すとおり、ボルバキアはショウジョウバエの DCV 感染を抑制します。wol 16 s rRNA 、 wspのプライマーを使用してボルバキアの存在 (図 3 a) とボルバキアを検出-無料ハエ DCV 感染症 (図 3 b) 後に有意に減少した生存率を表示します。図 4は、特異的プライマーを用いた勾配 PCR によってpst多型を確認する方法を示しています。図 5は、野生型フライで線量の DCV 感染の依存効果を示します。図 5 aの生存率およびウイルス記事感染は図 5 bに示すように 3 日で読み込まれます。図 6に示します DCV 感染がホスト52における情報伝達システム Dcr2/RNAi、JAK/STAT 抗ウイルスをアクティブ化できます。Dcr2/RNAi 経路の記者迷走神経発現遺伝子の発現レベルは、高 3 日ポスト感染症 (図 6 a) です。JAK-STAT 経路はまたレポーター遺伝子vir 1 (図 6 b) の発現レベルによって示されますが DCV 感染時にアクティブになります。図 7は、Dcr2/RNAi 経路がショウジョウバエ52抗ウイルス感染症のため重要であることを示します。Dcr 2変異ハエ DCV 感染後減少生存率 (図 7 a) と大量のウイルス負荷 (図 7 b) があります。
図 1:ショウジョウバエ感染とウイルス負荷解析のフローチャート。
ナノ注入によるショウジョウバエ感染を確立します。スキーマ チャートは、ハエが thoracically ただ口腔内に感染していることを示し CPE アッセイおよび qRT PCR によってウイルスの負荷を測定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: DCV 負荷分析。
ウイルス負荷を CPE 法で測定するに伴い qPCR によって測定されます。(A) S2 のセルは、別のウイルスの希釈 (50 μ L) で 3 日間の 25 ° C で培養します。ウイルスの 1 ユニット TCID50は 4.29 x 109 (3 x 109 PFU/mL に相当)。最初のパネル、10-3希釈。2 番目のパネル、10-7希釈。3 番目のパネル、10-10希釈。パネルなど、感染なし。1 と 2 のパネルで細胞は典型的な CPE 肯定的な表現型を示す (細胞の残骸を示す白い矢印)、パネル 3 と 4 の細胞は典型的な否定的な表現型を示すと。スケール バーは、数字で示されます。(B) DCV の測定は、qPCR で読み込みます。DCV のシリアルの 10 倍希釈を行い、S2 * 細胞株に感染します。感染細胞の総 RNA を抽出し、DCV RNA レベルを測定する qPCR を実行します。グラデーション ウイルス感染量 (CPE アッセイによって決まります) 細胞の一致し、qPCR による測定に積極的に関連 (r2= 0.999)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ハエボルバキアの有無のウイルス感染。
ボルバキア感染は、ショウジョウバエの DCV 抵抗に貢献しています。(A) ボルバキアwol 16 s rRNA 、 wspのプライマーによって存在が検出されました。G1、G2、G3 の表される鉱石rハエ (オレゴン州 R) (ブルーミントン 5) によって治療テトラサイクリン 1 つは、2 〜 3 世代それぞれ。PCR の製品のサイズは約 200 bp (wol 16s rRNA) と 600 bp (wsp)。(B)ボルバキア無料ハエが DCV 感染症に敏感。3 ~ 5 日古いオス成虫は DCV の 100 PFU が注入されます。ボルバキア保護は DCV 感染 (線分) を飛ぶよりも、ボルバキア無料飛ぶ (実線) を大幅に削減生存です。2 つの異なる野生型線、鉱石rとw1118生存の試金のため使用され、同様の結果を表示します。すべての誤差範囲を表す少なくとも 3 つの独立したテストの標準誤差 (東南)* P < 0.05 * * P < 0.01 * * * P < 0.001、* * * P < 0.0001、ns、重要ではないです。カプラン-マイヤー (B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: Pastrelは勾配 pcr 法による遺伝子型。
pstポリモーフィズムは、勾配 PCR によって検証されます。Pst R (512 C) と S (512T) 対立遺伝子ショウジョウバエ成人を区別するために勾配 PCR を行ったTm の勾配は a: 54 ° C, b: 54.7 ° C, c: 55.5 ° C、d: 58 ° C、e: 59.7 ° C、f: 62.2 ° C、g: 63.7 ° C, h: 64 ° c. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 生存率と DCV の異なる投与量で感染した鉱石rハエの DCV 価。
鉱石rハエは DCV、10 PFU/フライ、50 PFU/フライ 100 PFU/フライの 3 つの異なる用量が注入されます。(A) ハエの生存率は有意に低い感染用量が高いほど感染のとき。(B) 全体で DCV RNA レベル体示されたハエは示された時に qRT pcr 法による測定し、10 PFU/フライ接種群に正規化されました。すべての誤差範囲を表す少なくとも 3 つの独立したテストの標準誤差 (東南)* P < 0.05 * * P < 0.01 * * * P < 0.001、* * * P < 0.0001、ns、重要ではないです。カプラン-マイヤー (A) または (B) 一方通行 anova。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: Dcr2/RNAi とシグナル伝達経路の DCV 感染後にアクティブに JAK/STAT 抗ウイルス。
鉱石rハエは DCV の 100 PFU に感染していた。迷走神経 (A) と全身で表現 vir-1 (B) mRNA は、示された時間ポイント記事感染で qRT PCR によって測定されます。感染する前に基底レベルの発現の変化を正規化します。すべての誤差範囲を表す少なくとも 3 つの独立したテストの標準誤差 (東南)* P < 0.05 * * P < 0.01 * * * P < 0.001、* * * P < 0.0001、ns、重要ではないです。一方通行 ANOVA (a、B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: Dcr 2 変異ハエ DCV 感染症に敏感。
Dcr 2 変異ハエし、その遺伝的制御w1118ハエは DCV の 100 PFU に感染していた。(A) Dcr 2欠損や野生型 (w1118) 蠅の生存率ポスト DCV 感染。指定されたハエの全身の (B) DCV RNA レベルは qRT PCR 2 日ポスト感染で測定し、 w1118の正規化します。すべての誤差範囲を表す少なくとも 3 つの独立したテストの標準誤差 (東南)* P < 0.05 * * P < 0.01 * * * P < 0.001、* * * P < 0.0001、ns、重要ではないです。カプラン-マイヤー (A) またはスチューデント T 検定 (B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この記事で詳細な手順で紹介アダルトキイロショウジョウバエでウイルス感染システムを確立する方法ナノ注射を使用します。プロトコルには、適切なフライラインとウイルスの株式市場、感染手法、感染の指標の評価と抗ウイルス応答の測定の準備が含まれます。DCV ウイルス性病原体の例として使用されますが、ウイルスの種類の数十はショウジョウバエ システムの研究のため正常に適用されています。さらに、規制の要因は、ウイルスまたはホストのどちらかの数百はハエの大規模スクリーニングを介して識別されています。したがって、このメソッドは、適応性の高いは、DCV に限らず/ショウジョウバエの相互作用。
正常に伝達し高価 DCV の収穫は、いくつかの対策が取られなければなりません。適当な密度で培養、時間に収穫、細胞は健康なはずです。細胞培養のボリュームを減らすことは、ウイルス抗体価に大きな影響を与えません。通常、MOI で DCV に感染して 10 の7セル = 0.01 は最終的に降伏、おおよそ 108-109 TCID50 DCV、ほとんどの生体内および生体外での実験の要求を満たすことができます。CPE アッセイと qRT PCR 法は、ウイルス負荷の測定のためこのプロトコルで説明します。CPE 試験は何とかトリッキーです。細胞の適切な密度と正/負 CPE 差別の経験豊富な標準迅速かつ成功した CPE 法ができます。したがって、CPE アッセイをマスタリングする前に CPE 試験のカットオフ希釈ポイントを決定するためにここで簡単 qRT PCR アッセイを提供します。
しかし、DCV は大人のフライとショウジョウバエ細胞ラインのための非常に強力なウイルスです。のみ 100 PFU/フライの接種は、5 日以内、野生のハエの 50% を殺すことができます。過剰感染用量は、野生型フライおよび潜在的な影響を受けやすい線の意義をシャドウ可能性があります。新しい画面を開始するとき、少なくとも 2 つの感染用量を適用することが重要です。ショウジョウバエの大量死は、DCV の高致死率のため非常に短い時間の] ウィンドウで起きるかもしれませんので予備実験で多くの死亡数を記録は強くお勧めします。DCV 感染後いくつかのハエは時折腹水症候群を持っています。特に、これは不適切な針注入損傷によって引き起こされるかもしれない 0.5 h ポスト感染で死ぬハエが除外すべき。
DCV の伝染性の強度は、実験を開始する前に考慮すべき多くのホストの要因によっても影響されます。ボルバキアは垂直転送ハエ32のウイルス感染は、大きな影響を与える細胞内共生細菌です。はえの食糧のテトラサイクリンの治療は、ボルバキア感染を除去するために一般的な使用方法です。ただし、このメソッドは、腸内細菌叢の組成は、抗ウイルス応答53に順番に影響を与える可能性がありますも変更されます。いくつかの研究は、ウイルス感染症36、 ubc e2h、 cg8492 pstなどの遺伝的差異の重要性を強調しています。たとえば、ほとんどの野生型フライ ラインpst S 対立遺伝子があるし、我々 はブルーミントンのストック センターからテストほとんどの突然変異系統pst R 対立遺伝子がこうしてあるが、picorna のようなウイルスに敏感は耐性表現型を有する。野生型制御29と比較する抵抗性遺伝子をスクリーニングする場合は特に、 pst ファイルの影響を除外するため非常に重要です。
全身性ウイルス感染を誘発するナノ射出、ほか他の方法はハエでウイルス感染症の研究に利用可能です。ショウジョウバエ細胞は、ウイルス感染を選別する高スループット方法関連ホスト細胞成分37,38を証明しています。ただし、培養システムは、 in vivoを確認するとき、偽陽性の率が高いと常に伴います。のみ制限され、穏やかな感染症を誘発できるに対し、DCV をショウジョウバエを経口感染する適用もできます。幼虫の 20% が 12 時間以内に感染した 14% 死亡率が観察されただけで、大人で 20 日間の死亡率は 25% で、22 を飛ぶ。直径 0.15 mm のピンを使ってハエをチクチク ウイルス感染を設定する別の方法ですが、正確な伝染の線量と定量再現性を確保することができないそれ。ハエの遺伝子操作によってウイルス蛋白質を過剰発現は、生体内で分子 interactomes7を勉強する良い方法です。ただし、感染時にホストの生理学および病理学の現実を描く可能性がありますないそれ。一方、ナノ注入法も、欠点、感染症の自然なルートではなく、直接キューティクル、最初の抗ウイルス防衛線をバイパス、感染直後に強いシステムの免疫応答を刺激することができます。合計では、特定の研究の目的と使用可能な実験条件がさまざまな方法で選択の決定要因です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
IPS で全体のパン研究室に感謝したいと思います。CAS。コメントの博士ハンセン朱 (IPS、パリ) 博士ジェシカ ・ バルガス (IPS、パリ) と博士 Gonalo コルドバ スティーガー (スプリンガー自然) 実験支援博士ランコウ王 (IPS, CA) をありがちましょう。この作品は、中国科学アカデミーの戦略的な重点研究課題からを結んだ (XDA13010500) と同 H.T (XDB29030300)、結んだ (31870887 と 31570897) と同し J.Y (31670909) 中国の国家自然科学基金助成金によって支えられました。結んだと同 CA 青年革新推進協議会 (2012083) のフェローであります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
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