Summary

Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Published: March 14, 2019
doi:

Summary

Ce protocole décrit comment établir une infection virale in vivo chez Drosophila melanogaster en utilisant la méthode de nano-injection et les techniques de base pour analyser l’interaction virus-hôte.

Abstract

Propagation du virus est une cause majeure de maladies épidémiques. Ainsi, la compréhension de l’interaction entre le virus et l’hôte est très important d’élargir nos connaissances de la prévention et le traitement de l’infection virale. La drosophile Drosophila melanogaster s’est avéré pour être un des organismes de modèle plus efficace et productif pour dépister les facteurs antiviraux et d’étudier l’interaction virus-hôte, grâce à puissants outils génétiques et immunitaire innée hautement conservée voies de signalisation. La procédure décrite ici illustre une méthode de nano-injection afin d’établir une infection virale et induisent des réponses antivirales systémiques chez les mouches adultes. Le contrôle précis de la dose d’injection virale dans cette méthode permet de haute reproductibilité expérimentale. Protocoles décrits dans la présente étude comprennent la préparation des mouches et le virus, la méthode d’injection, analyse du taux de survie, la mesure de la charge virus et une évaluation de la voie antivirale. Les effets de l’influence d’une infection virale par le fond des mouches ont été mentionnés ici. Cette méthode d’infection est facile à réaliser et quantitativement reproductible ; Il peut être appliqué à l’écran pour hôte/virale facteurs impliqués dans l’interaction virus-hôte et à disséquer la diaphonie entre immunitaire innée de signalisation et autres voies biologiques en réaction à l’infection virale.

Introduction

Emerging infections virales, surtout par les arbovirus, telles que le Chikungunya virus1, virus de la Dengue, la fièvre jaune virus2 et levirusde Zika3, ont été une énorme menace pour la santé publique en causant des pandémies 4. ainsi, une meilleure compréhension de l’interaction virus-hôte a pris une importance croissante pour la lutte contre les épidémies et le traitement des maladies virales chez l’homme. Pour atteindre cet objectif, des modèles plus adéquate et efficaces s’impose pour étudier les mécanismes sous-jacents d’infection par le virus.

La mouche à fruit, Drosophilamelanogaster (d. melanogaster), fournit un système puissant pour étudier les interactions de virus-hôte5,6 et s’est avéré pour être un des modèles plus efficaces pour étudier des maladies virales humaines7 , 8 , 9. antiviral hautement conservée de signalisation des voies et incomparables outils génétiques font vole un excellent modèle pour produire des résultats significatifs ayant des implications réelles pour études antivirale chez l’homme. En outre, les mouches sont faciles et peu coûteux de maintenir en laboratoire et sont confortables pour un dépistage à grande échelle de nouveaux facteurs de régulation6,10 dans le virus et l’hôte au cours de l’infection.

Quatre grandes voies antivirales hautement conservées (e.g., le RNA interférence (Arni) voie11, la voie de JAK-STAT12, la voie NF-κB et l’autophagie voie13) sont bien étudiés chez la drosophile au cours des dernières années6. La voie de l’ARNi est un mécanisme d’antiviraux large qui peut supprimer la plupart des types de virus infection6,14. Perturbation de cette voie de mutation des gènes comme Dicer-2 (Dcr-2) ou 2 Argonaute (AGO2) peut conduire à une augmentation des virus titre et hôte mortalité15,16,17. La voie de JAK-STAT a été impliquée dans la lutte contre l’infection par un virus de la famille des Dicistroviridae et de la famille des Flaviviridae chez les insectes, par exemple., Drosophila C virus (DCV) mouches16 et le virus du Nil occidental (VNO) et le Virus de la Dengue moustique18,19. Les frais de drosophile (homologue à la voie NF-κB humaine) et les voies de déficit immunitaire (IMD) (semblables à la voie NF-κB et TNF humaine) sont tous deux impliqués dans la défense de virus invasion20,21, 22. autophagie est un autre mécanisme conservé impliquée dans la régulation de l’infection virale, qui est bien caractérisée dans drosophile23,24. Ainsi, l’identification de nouveaux facteurs de régulation de ces voies et dissection diaphonie entre ces antiviraux de signalisation et d’autres voies biologiques, tels que le métabolisme, vieillissement, réaction neurale et ainsi de suite, peuvent être facilement configurés chez la drosophile système.

Bien que les modèles infectieuses virales plus bien établis chez la drosophile sont induites par les virus à ARN, infection par les invertébrés 6I irisé de Virus (IV-6) et virus de Kallithea ont montré le potentiel pour l’étude de virus à ADN le mouches25, 26. En outre, le virus peuvent également être modifié pour permettre l’infection de la drosophile, par exemple, le virus de la grippe9. Cela a considérablement élargi l’application de la plate-forme de criblage de drosophile . Dans cette procédure, nous utilisons DCV à titre d’exemple pour décrire comment développer un système infectieux viral chez la drosophile. DCV est un virus ARN monocaténaire seul polarité positive d’environ 9300 nucléotides, codage 9 protéines27. Comme un pathogène naturel de d. melanogaster, DCV est considéré comme un virus adapté pour étudier l’hôte physiologiques, comportementales et basale système immunitaire lors d’interaction et co-évolution hôte-virus28. En outre, son taux de mortalité rapide suite à une infection chez les mouches de type sauvage rend DCV utile pour dépister les gènes résistants ou sensibles dans l’ hôte29.

Cependant, il y a plusieurs aspects préoccupants lorsque l’on étudie des infections virales chez la drosophile. Par exemple, les bactéries symbiotiques Wolbachia ont une capacité d’inhiber un large spectre de la prolifération de virus à ARN dans la drosophile et moustique30,31,32. Données récentes montrent un mécanisme possible quel Wolbachia blocs Sindbis (SINV) d’infection virale par le biais de l’upregulation de methyltransferase Mt2 expression dans l’ hôte33. En outre, le bagage génétique des insectes est également critique pour une infection virale. Par exemple, le naturel polymorphisme du gène pastrel (pst), détermine la sensibilité aux infections DCV dans drosophile34,35, tandis que les locus de Ubc-E2H et CG8492 sont impliqués dans les virus de paralysie de Cricket (CrPV) et l’infection par les virus (FHV) maison de troupeau, respectivement36.

La manière d’établir l’interaction hôte-virus dans les mouches, doivent être choisies selon des fins de recherche tel qu’un écran de haut débit pour les composants cellulaires hôte Drosophila cellule lignes37,38, oral infection à étudier la réponse antivirale spécifique gut22,39,40, aiguille piquant41,42 ou nano-injection en passant les barrières épithéliales pour stimuler immunitaire systémique réponses. Nano-injection peut contrôler avec précision la dose virale pour induire une réaction antivirale contrôlée et une lésion physiologiques43, garantissant ainsi la grande reproductibilité expérimental44. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de nano-injection pour étudier les interactions virus-hôte chez la drosophile, en soulignant l’importance des effets de fond des mouches.

Protocol

Remarque : Avant de commencer l’expérience, les lignées cellulaires et les stocks de mouche utilisées ne doivent pas être contaminés par d’autres agents pathogènes, en particulier pour les virus tels que DCV, FHV, Drosophila X virus (DXV) et le virus aviaire néphrite (ANV). Idéalement, le séquençage de RNA ou une identification plus simple basées sur la PCR sont utilisés pour détecter la contamination10,45. En cas de contamination, les lignées …

Representative Results

Résultats de la présente section sont obtenus après l’infection DCV de d. melanogaster. La figure 1 montre l’organigramme de l’infection virale chez la drosophile. Les mouches sont injectées intra-thoracically, et ensuite les échantillons sont prélevés pour la mesure de la virale TCID50 et le niveau de RNA de génome (Figure 1). Infection par le virus peut provoquer la lyse cellulaire et ECP n’est observé à 3 jours après l’infection (<stro…

Discussion

Dans cet article, nous présentons une procédure détaillée sur la façon d’établir un système infectieux viral chez l’ adulte Drosophila melanogaster à l’aide de nano-injection. Les protocoles comprennent la préparation de lignes mouches appropriées et stock de virus, techniques d’infection, l’évaluation des indicateurs infectieux et la mesure de la réponse antivirale. Bien que DCV est utilisé comme un exemple d’un virus pathogène, des dizaines de différents types de virus ont été avec s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier le laboratoire Pan entier en IPS. CAS. Nous remercions m. Lanfeng Wang (IPS, CAS) pour assistance expérimentale et Dr Gonalo Cordova Steger (nature Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Paris) et m. Seng Zhu (IPS, Paris) pour commentaires. Ce travail a été soutenu par des subventions du programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des Sciences à L.P (XDA13010500) et Haddad (XDB29030300), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine L.P (31870887 et 31570897) et Jean-Yves (31670909). L.P est membre de l’Association de Promotion de l’Innovation des jeunes CAS (2012083).

Materials

0.22um filter Millipore SLGP033RS
1.5 ml Microcentrifuge tubes Brand 352070
1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C
10 cm cell culture dish Sigma CLS430167 Cell culture
100 Replacement tubes Drummond Scientific 3-000-203-G/X
15 ml tube Corning 352096
ABI 7500 qPCR system ABI 7500 qPCR
Cell Incubator Sanyo MIR-553
Centriguge Eppendof 5810R
Centriguge Eppendof 5424R
Chloroform Sigma 151858 RNA extraction
DEPC water Sigma 95284-100ML RNA extraction
Drosophila Incubator Percival I-41NL Rearing Drosophila
FBS Invitrogen 12657-029 Cell culture
flat bottom 96-well-plate Sigma CLS3922 Cell culture
Fluorescence microscope Olympus DP73
Isopropyl alcohol Sigma I9516 RNA extraction
Lysis buffer (RNA extraction) Thermo Fisher 15596026 TRIzol Reagent
Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) Thermo Fisher 10296028 TRIzol LS Reagent
Microscope Olympus CKX41
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204 Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)
Optical Adhesive Film ABI 4360954 qPCR
Penicillin-Streptomycin, Liquid Invitrogen 15140-122 Cell culture
qPCR plate ABI A32811 qPCR
Schneider’s Insect Medium Sigma S9895 Cell culture
statistical software GraphPad Prism 7
TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix TransScript AT301 RNA extraction
Vortex IKA VORTEX 3 RNA extraction

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Cite This Article
Yang, S., Zhao, Y., Yu, J., Fan, Z., Gong, S., Tang, H., Pan, L. Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (145), e58845, doi:10.3791/58845 (2019).

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