Immunology and Infection

אינדוקציה של מעיים שתל – מול – מארח מחלות והערכה מיני-אנדוסקופית שלה בעכברים בשידור חי

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/58871

Vera Buchele^1,3, Maike Büttner-Herold², Tina Vogler^1,3, Markus F. Neurath^1,3, Kai Hildner^1,3

¹Department of Internal Medicine 1, University Erlangen-Nürnberg, University Hospital Erlangen, ²Institute of Pathology, Department of Nephropathology, University Hospital Erlangen, ³Deutsches Zentrum Immuntherapie (DZI), University Hospital Erlangen

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מתאר השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic ומאפשרת חוזרות הערכות מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי באתרו נוכחות, מאפיינים של חומרת דלקת מעי בתוך בשידור חי עכברים הסובלים מעיים שתל – מול – מארח מחלות.

Abstract

חריפה שתל – מול – מארח מחלות (GvHD) מייצג סיבוך חמור ביותר כי חולים שעברו בעבר גזע allogeneic התא hematopoietic (מאפשר-של HCT) השתלת הפנים, קשורה לעיתים קרובות עם תוצאה קליניים עניים. למשל, GvHD ביטויים של העור הם בדרך כלל מגיבים טיפולים מדכאים חיסונית הוקמה ותוך, לפיכך, לא לוקח קורס קטלנית, הנוכחות, האינטנסיביות של GvHD מעיים, במיוחד חלקים באמצע להתחתון של הבטן, משפיעים מאוד על התוצאה, באופן כללי ההישרדות של חולים עם חריפה GvHD. טיפולית אפשרויות מוגבלות בעיקרו הסוכנים מדכאים חיסונית קלאסי מניבים רק מתון מקלים-מחלת אפקטים. לפיכך, ידע מפורט על המפל רקמות תושב המערכת החיסונית, שינויים microbiota מעיים, התגובה סטרומה לפני, בעת ואחרי תחילת GvHD מעיים נחוצים בדחיפות כדי להבין את האירועים ובמנגנונים שבבסיס שלה הפתוגנזה לפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות. מודלים מאתר של GvHD מועסקים לעיתים קרובות כדי לזהות ולהעריך באופן פונקציונלי מולקולות מסלולים putatively נהיגה GvHD מעיים. עם זאת, אומר במפורש לפקח ולהעריך דלקת מעיים לאורך זמן חסרים בעצם מאז הוקמה ציונים כדי להעריך כיתה GvHD אקוטי באופן שגרתי מורכבות של פרמטרים שונים המשקפים מעדיף GvHD מערכתית ביטויים. הערכה מפורטת של GvHD מעיים הוגבלה ללימודים שימוש בעכברים לאללה, ובכך למעשה למעט האורך (קרי, קינטי) ניתוחים של תא שטיפת המעי הגס תחת תנאי הניסוי (למשל, נוגדן בתיווך המצור ציטוקינים proinflammatory) בעכברים בשידור חי (קרי, in vivo). ההערכה באתרו מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי של מאפשר של HCT-מטופלים עכברים המתוארים כאן מאפשר a) הערכה מאקרוסקופית מפורט של היבטים שונים של דלקת מעיים ו- b) את האפשרות לאסוף דגימות רקמה עבור ניתוחים במורד הזרם- נקודות זמן שונות במהלך תקופת תצפית. באופן כללי, הגישה מיני-אנדוסקופית מספק התקדמות גדולה ב פרה לא פולשנית ניטור והערכה של GvHD מעיים.

Introduction

Hematopoietic ממאירות הנובעת ישירות מן התא בתאי גזע hematopoietic בלתי מבוקרת, מתקדם במהירות, הפרעות קשות בתיווך החיסונית לעתים קרובות אינדיקציות לביצוע מאפשר-של HCT¹^,². עם זאת, למרות החשבונאי המופע של התגובה שתל-נגד-גידול prognostic מועיל, התורם לימפוציטים הם לעתים קרובות גרימת וקידום התקפה בתיווך החיסון לא רצויים של רקמה בריאה רכיבים בתוך המטופל מאפשר-של HCT , תהליך זה נקרא שתל – מול – מארח מחלות³. ביטויים בבטן, GvHD מעיים, כביכול מייצגים הסיבוך המפחיד ביותר של GvHD אקוטי, צורות חמורות אשר קשורים באופן שגרתי עם תמותה גבוהה¹^,²^,⁴.

באופן כללי, מאתר דגמי מאפשר-של HCT הופיעו כלי יקר ערך לזהות וללמוד מנגנוני החיסון בתיווך שבבסיס בפתוגנזה של GvHD⁵. עם זאת, ההערכה קינטי, למשל, ההשפעות המיטיבות של התערבויות טיפוליות הרומן לאורך זמן בעכברים בשידור חי באופן שגרתי מבוסס על הקביעה של GvHD קליניים ציונים⁶. בעוד אלה ציונים מתאימים לשקף, למשל, המחלה הנטל הכולל (קרי, מערכתית GvHD), קליניים ציונים חוסר הרגישות באופן אמין לשקף ביטויים ייחודיים (למשל, בבטן). לפיכך, מסקנות, למשל בכל הנוגע תופעות בטן-מגן של התערבות טיפולית נתון, בהתבסס על אלה הבקיע מערכות בדרך כלל נופל קצר.

למרות התקדמות גדולה דרך ההמצאה של הרומן לכל הגוף הדמיה שיטות בשילוב עם השימוש של עכבר גנטי זוהרים או פלורסנט דגמי⁷^,⁸, מתודולוגיות ישירות, במיוחד להעריך את המעי ביטוי של GvHD בעכברים בשידור חי חסרים. ומכאן, הרציונל מאחורי הפרוטוקול של הערכת אנדוסקופי פנוטיפ GvHD מעיים המתוארים בסעיף הבא הוא כדי להתגבר על מכשול זה. יתר על כן, המוטיבציה היא גם לצמצם מספרים עכברים ניסיוני מאז, עד כה, הערכה מפורטת של המאפיינים הסלולר, מורפולוגיים מולקולרית (למשל, על ידי histopathology או ביולוגיה מולקולרית) של GvHD מעיים ביטוי דרש בסופו של דבר את ההקרבה של העכבר ניסיוני.

המוסד שלנו דיווח בעבר על המתודולוגיה של הערכה מיני-אנדוסקופית של המעי הגס הגילויים במהלך syngeneic קוליטיס מודלים⁹. בפרוטוקול המובאת כאן, יש מעודן ואנו הותאם colonoscopic את הניקוד מטריקס עבור מונחי-alloresponse קוליטיס בעכברים בשידור חי עם מעיים GvHD על השתלת של alloreactive של HCT ושל התורמים לימפוציטים מחלקה MHC מלא תואמים הגדרה . זיהינו ארבעה פרמטרים מתאימים לשקף נגעים חוקן הקשורות GvHD מעיים. יתר על כן, הקמנו מערכת המאפשרת מכויל לדירוג של כל דטרמיננטה יחידה, וכתוצאה מכך ניקוד חדש המודיעה בקלות לקורא חומרת מעיים GvHD נוכח עכבר נתון בנקודת זמן נתונה. ניתוחים histopathological אישר כי ניקוד אנדוסקופי מעל לסף מסוים הוא אמין חיזוי דלקת ברקמות כיתה בינונית-גבוהה. לפיכך, מיני-אנדוסקופית להערכה מופיעה כדי לייצג תחליף עובד histopathology תקן זהב הדורש באופן שגרתי את ההקרבה של העכברים ניסיוני. חשוב, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כמעט בכל נקודת זמן נתון, ניתן להשתמש שוב ושוב במהלך המחלה¹⁰^,¹¹. יתר על כן, בניגוד השימוש ביולומינסנציה תלוית גישות, אין אמצעי העבודה רגשניים ולגזול כמו intercrossing גנטית שונה עכברים נדרשים, לפיכך, המתודולוגיה יכול להיות מיושם על העכבר כמעט בכל תחום ריבית.

יחדיו, בהתחשב ההיבט הקליני מזיקה מחולי מאפשר-של HCT GvHD מעיים חמורה, התקדמות מדעית מהירה, תובנה רבה יותר המנגנונים המולקולריים שבבסיס בפתוגנזה המערכת החיסונית הם צורך דחוף. באופן דומה, שיקולים חשובים, אתי דורשים כי הרווח של הידע צריך להיות מושגת עם הקישורים של מספר מינימלי של עכברים ניסיוני. לפיכך, שניהם מזוהה טענות על קהילת המחקר חקר GvHD מעיים ניתן מתקדמים על-ידי יישום הערכות טורי מיני-אנדוסקופית של המעי הגס בשרשרת עבודה ניסויית כדי לפקח, כיתה GvHD מעיים עכבר ניסיוני בשידור חי מודלים, כמו שמתואר המאומת בפרוטוקול המוצג כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסיוני בשיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הממשלה של Mittelfranken, בוואריה, גרמניה.

1. GvHD אינדוקציה

יום 0: גופית של העכברים הנמען
1. השתמש הנשי CD45.2⁺ H2kd⁺BALB/c עכברים כי הם בן כ נמענים לפחות 10 שבועות.
2. שוקל ולהקליט את המשקל של העכברים הנמען לפני GvHD אינדוקציה.
  הערה: ודא כי הנמען יש משקל גוף מינימלית של 20 גרם. משקל הגוף מתחיל ישמש הערך הפניה כדי לחשב אובדן המשקל של העכבר בודדים במהלך הגיוס GvHD והתקדמות.
3. מקום עכברים עד חמישה המכולה של רנטגן בעוצמה.
4. להאיר את העכברים מאת גופית עם מנה אחת של 8 Gy של הרנטגן. להשתמש Cs¹³⁷ מקור קרינה.
יום 1: שיחזור של עכברים לקרינה עם T-תא-דלה מח עצם
הערה:השתלת תאי מח עצם allogeneic, וגם עם מיתאר מפורטת בסעיף 1.2, צריך לקחת את המקום בתוך 24 שעות לאחר הקרנה. ביצוע ההליכים המתוארים להלן בתרבות רקמות סטריליים הוד ולהשתמש ריאגנטים מסוננים. השתמש allogeneic CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ עכברים BoyCrl כמו תרומות מח עצם T תאים-מדולדל.
1. המתת חסד CD45.1/Ly5.1 B6. עכברים SJL תתרום תאים במח העצם allogeneic בהתאם להנחיות מוסדיים, 12-24 שעות לאחר ההקרנות של העכברים BALB/c הנמען. בשביל זה, עזים ומתנגד של B6 CD45.1/Ly5.1. עכברים SJL על ידי שאיפה של 5% איזופלוריין. להמשיך עם החשיפה איזופלוריין מעל 1 דקות לאחר נושם המעצר ואשר המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.
2. לחטא את הפרווה והעור של העכבר ביסודיות עם 70% אתנול.
3. מיקום העכבר על גבי נקי עובד נדן כך העכבר הוא במצב שכיבה, עם ישבנו הנפוח שלה מול הנסיין. הרם את הפרווה-האכילס עם קצה מלקחיים Semken באורך של 13 ס מ וטיפים מעוקל משונן. פצעים וחתכים בעור בין המלחציים העקב במספריים בסדר מוקשח 8.5 ס"מ, עם טיפים ישר.
4. להאריך את החתך cranially (כלומר, מתוך בעקב הרגל התחתונה, הירך באזור מפרק הירך). הסר את העור והפרווה הגפיים האחוריות בעזרת המלקחיים.
5. בצע את ההליך על האיבר הינד אחרים.
6. הסר את הגפיים האחוריות על ידי חיתוך באמצעות מפרקי הירך הסמוך.
7. לחתוך את הכפות האחורי. לחתוך דרך הברך. אחסן את הירך ואת shank של כל איבר. האחוריות יחד בצלוחית 92 מ מ מלא באגירה פוספט (PBS) תמיסת מלח על קרח.
8. לנקות את העצמות עצם הירך, שוקה בקפידה על-ידי הסרת רקמת שריר רב ככל האפשר בכל הירך ואת shank. להעביר את העצמות עצם הירך, שוקה שפופרת 50 מ ל מלא בינוני RPMI 1640 סטרילי, במקום זה על קרח רטוב עד שכל העצמות השוקה, עצם הירך שנאספו בשלב 1.2.7 מנוקים מכל רקמת השריר.
9. כדי לבודד את מח העצם, להעביר עצם הירך או טיביה אחת בכל פעם (אשר נוקה כשלב שמתואר 1.2.8) מהצינור 50 מ ל צלחת פטרי (בקוטר של 92 מ מ) מלא RPMI 1640 בינוני. לחתוך את הקצוות של עצם הירך או טיביה עם איזמל כדי לקבל גישה אל החלל של עצם המכיל את מח העצם.
10. הכן צינור אוסף 50 מ עם 5 מ של RPMI 1640 בינוני. הוספת מחט 26 גרם המצורפת מזרק 1 מ"ל מלא 1 מ"ל של מדיום RPMI 1640 לתוך חלל העצם, לשטוף את לשד העצם החלל לתוך הצינור אוסף על ידי דחיפת הבוכנה.
11. חזור על שלב 1.2.10 עד העצם מופיע בהיר ומבריק (קרי, חלל העצם נטול בעליל אדמדם מח העצם). למחוק את העצם ריק.
12. חזור על שלבים 1.2.9 - 1.2.11, באמצעות כל עצמות הירך, שוקה מהשלב 1.2.8, ולאסוף את כל החלקים מח עצם התאושש בצינור אוסף של 50 מ ל אותו מהשלב 1.2.10. שמור את הצינור אוסף על קרח רטוב עד שכל העצמות מהשלב 1.2.8 עובדו בהתאם.
13. ליצור השעיה תא בודד על ידי ברכות pipetting את החלקים מח עצם סמוק-פנים, ומתפורר למעלה ולמטה. לסנן התליה תא בודד מח עצם באמצעות מיקרומטר 40 מסך תא מסננת רשת מניחים על צינור אוסף 50 מ.
14. Centrifuge 50 מ ל אוסף הצינור המכיל התליה תא בודד מח העצם ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
15. Resuspend בגדר ב 5 מ ל ומונה lysing מאגר (1 מ מ נה₂EDTA; 10 מ מ KHCO₃; 144 מ"מ NH₄Cl pH 7.2) עבור פירוק תאי הדם האדומים. דגירה התליה תא למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מיד להוסיף 10 מ של PBS פתרון התליה תא.
16. Centrifuge את המתלים ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי 2 מ"ל של PBS פתרון.
17. לספור תאי מח העצם, שימוש של hemocytometer. לשמור על aliquot של תאים⁶ 6 x 10 לניתוח cytometry זרימה לבדוק את הטוהר של התאים לאחר תא טיהור (ראה שלב 1.2.20).
18. לשימוש דלדול של תאי T מ מח עצם התליה תא בודד, ערכת טיהור תא זמינים מסחרית. דיסקות לרוקן תאים CD90.2⁺ (קרי, לימפוציטים) של תאי מח עצם הכולל, לפי הפרוטוקול של היצרן.
19. לספור תאי T תאים-מדולדל מח עצם שהיו מבודדים כפי שמתואר בשלב 1.2.18, באמצעות hemocytometer. לשמור על aliquot של עונה 1 פרק 10 תאים⁶ לניתוח cytometry זרימה שיבוצעו בהמשך, כפי שמתואר בשלב 1.2.20.
  הערה: התשואה הממוצעת תא נגזר תורם אחד העכבר היא בדרך כלל 2 x 10⁷ 3.4 x 10⁷ תאים T תאים-מדולדל מח עצם.
20. לאשר דלדול T-cell מוצלחת על ידי cytometry זרימה. כתם עונה 1 פרק 10⁶ תאים, נשמר מן השלבים 1.2.17 (תאי מח עצם לפני ההפרדה תא מגנטי) ו- 1.2.19 (תאי T תאים-מדולדל מח עצם לאחר ההפרדה תא מגנטי), עם נוגדנים הבאים: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), (α-CD4 GK1.5), וα-CD8α (53-6.7). להשתמש את התאים הנותרים מהשלב 1.2.17 כפקד וללא רבב של ועבור מכתים יחיד פקדים, כדי להגדיר את זרימת cytometer.
  1. להעביר עונה 1 פרק 10⁶ תאים כל מדגם טוב של צלחת 96-ובכן עם V-תחתון כדי לבצע את cytometric זרימה מכתים בהליך.
  2. ספין למטה התאים בתוך הצלחת 96-ובכן (שלב 1.2.20.1) ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 100 FACS מאגר (PBS בתוספת 3% מסוננת סרום שור).
  3. Centrifuge התאים בתוך הצלחת 96-ובכן ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  4. להוסיף כמות מספקת של הנוגדן של בחירה (השוואה עם צעד 1.2.20) הדגימות עבור צביעת יחיד ב- 100 µL מאגר FACS.
  5. להכין תערובת של כל נוגדנים (בסיס mix) המכיל את כמויות מתאימות מספיק כדי בנפרד מכתים את מח העצם תא aliquots נשמר מן קודם (ראה שלב 1.2.17) ואחרי (ראה שלב 1.2.19) מגנטי דלדול T-cell. להוסיף 100 µL של המיקס בסיס שני aliquots.
  6. להוסיף רק 100 µL מאגר FACS המדגם וללא רבב.
  7. דגירה התאים בתוך הצלחת 96-ובכן כעשרים דקות ב 4 ° C בחושך.
  8. להוסיף 100 µL מאגר FACS, centrifuge את התאים בתוך הצלחת 96-ובכן ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 100 FACS המאגר.
  9. Centrifuge התאים ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 250 FACS המאגר.
  10. להעביר את הדגימות צינור עגול-התחתון מ ל פוליסטירן ולנתח אותם עם מכשיר cytometer זרימה הוא מסוגל לזהות מולקולות פלורסנט ששימשו לתייג את הנוגדנים מועסק כדי לאפיין את דגימות תאים (ראה שלב 1.2.20).
  11. להשוות את הרכב התא לפני ואחרי ההפרדה תא מגנטי.
    הערה: טוהר כ- 95% CD45.1⁺CD3^– (קרי, T-תא-דלה מח עצם) תאים בתוך השער חיים מושגת בדרך כלל.
21. לשטוף את המתלים תא T תאים-מדולדל מח עצם 2 x עם פתרון PBS (450 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C) ו, לבסוף, resuspend את התאים בפתרון PBS, התאמת את הריכוז תא 5 x 10⁷ תאים/מ ל.... לשמור את התאים על קרח רטוב עד הזריקה.
22. מזריקים תאים במח העצם T תאים-מדולדל לתוך העכברים הנמען, אשר היו מוקרן יום לפני (ראו סעיף 1.1).
  1. הנח את העכבר ניסיוני בתוך תא עמיד בפני נזילה, לגרום הרדמה על ידי שאיפה של עד 4% איזופלוריין, עד העכבר מחוסר הכרה. לאשר שיכוך כאבים ואובדן הכרה על-ידי בדיקת אובדן רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים ולסגת אובדן עוקבות של דוושת רפלקס.
  2. להזריק 5 x 10⁶ תאים T תאים-מדולדל במח העצם (קרי, 100 µL של 5 x 10⁷ תאים/מ ל...) המכיל PBS הפתרון באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד עם מחט 30 גרם דרך הווריד לחלל retrobulbar המכיל הסינוס ורידים.
יום 2: העברת תאי T
הערה: לבצע את ההליכים המתוארים להלן בשכונה תרביות רקמה סטרילי והשתמש ריאגנטים מסוננים. השתמש CD45.2 C57Bl/6 (פראי-סוג; עכברים WT) כמו לתורמים alloreactive T תאים. השימוש congenic מרקר מערכות מאפשרת את distinguishability בין המטופל (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c עכברים) וסוגי תא hematopoietic התורם (תאים במח העצם: CD45.1⁺ H2kb⁺B6. SJL עכברים; תאי T allogeneic: CD45.2⁺ H2kb⁺C57/Bl6 עכברים).
1. המתת חסד C57Bl/6 עכברים בהתאם החלת המוסדיים הנחיות ורשויות. לכן, עזים ומתנגד עכברים באמצעות אינהלציה עם ריכוז של 5% איזופלוריין. להמשיך את החשיפה איזופלוריין עד 1 דקות לאחר נושם המעצר ואשר המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם. לחטא את הפרווה והעור של העכבר ביסודיות עם 70% אתנול.
2. מניחים מסננת עם מסך 40 µm רשת על צינור אוסף 50 מ. להסיר את הטחול ומניחים אותו על גבי מסננת.
3. עם פומפה מזרק, comminute הטחול ב מסננת. לשטוף את מסננת ואת משאבת מזרק עם PBS כדי לאסוף את כל splenocytes.
4. Centrifuge התאים בתוך הצינור אוסף 50 מ ל- x 450 גרם עבור 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
5. Resuspend את splenocytes ב 3 מ"ל של מאגר lysing ACK כדי lyse כדוריות דם אדומות. דגירה התליה תא 3 דקות לאחר מכן, להוסיף 10 מ ל- PBS, centrifuge התאים ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את splenocytes ב- PBS.
6. לספור תאי הטחול, שימוש של hemocytometer. להסיט את aliquot של תאים⁶ 6 x 10 לניתוח cytometry זרימה, כדי להעריך את סדר הגודל של טיהור בשלב 1.3.9.
7. עבור CD3 סך⁺ T-cell הבידוד מאפליקציות הכולל splenocytes, להשתמש ערכת טיהור תא זמינים מסחרית. לבודד תאי T הטחול, ע פ הפרוטוקול של היצרן.
8. לספור את הטחול CD3⁺ T תאים מבודדים כפי שמתואר צעד 1.3.7, שימוש של hemocytometer. לשמר את aliquot של עונה 1 פרק 10 תאים⁶ T לניתוח cytometry זרימה.
  הערה: התשואה על הממוצע של הטחול T תאים לכל העכבר התורם מבודדת על ידי טווחי תאים מגנטי ההפרדה בין 1.3 x 10⁷ 2 x 10⁷ תאים.
9. לאשר את ההצלחה של הבידוד תא T על ידי cytometry זרימה. לקבלת תיאור מפורט של פרוטוקול מוכתמים, להתייעץ, בצע שלבים 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
  1. כתם splenocytes⁶ עונה 1 פרק 10 של שלבים 1.3.6 (לפני ההפרדה תא מגנטי) ו 1.3.8 (לאחר ההפרדה תא מגנטי) עם נוגדנים הבאים: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) וα-CD8α (53-6.7).
  2. להשתמש התאים הנותרים מהשלב 1.3.6 כפקד וללא רבב של ועבור מכתים יחיד עם נוגדנים המתאימים, להגדיר את cytometer זרימה.
  3. להשוות בין הרכב התא לפני ואחרי תא מגנטי ההפרדה.
    הערה: טוהר של % ≥95 CD45.2⁺CD3⁺ T תאים בתוך השער בשידור חי לימפוציט צריך להתבצע.
10. ווש ה-T תאים 2 x עם PBS (450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C) ו, לבסוף, resuspend את התאים בפתרון PBS, התאמת את הריכוז תא 7 x 10⁶ תאים/מ ל.... לשמור את התאים על הקרח עד הזריקה.
11. מזריקים alloreactive, הטחול בתאי T (ראה שלב 1.3.10) לתוך לקרינה BALB/c עכברים שקיבלו בעבר CD45.1⁺ תאי T תאים-מדולדל מח עצם (ראה שלב 1.2.22).
  1. לגרום הרדמה על ידי הצבת העכבר ניסיוני בתוך תא עמיד בפני נזילה שבו הוא נחשף עד 4% איזופלוריין עד שזה מאבד את ההכרה שלו. לאשר שיכוך כאבים ואובדן הכרה על-ידי בדיקת אובדן רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים ולסגת אובדן עוקבות של דוושת רפלקס.
  2. להזריק 0.7 x⁶ 10 alloreactive CD3⁺ T תאים באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד עם מחט 30 גרם (כלומר, 100 µL של 7 x 10⁶תאים/מ ל...) המכיל PBS פתרון (ראה שלב 1.3.10), דרך הווריד לתוך retrobulbar מרחב של העכברים, לזירוז GvHD. Denominate אלו עכברים כמו קבוצת הניסוי.
  3. להזריק לקבוצה אחרת של עכברים עם µL 100 ל- PBS לבד, דרך הווריד לחלל retrobulbar, ויש denominate קבוצה זו כחלק מקבוצת הביקורת, המכונה "לא-T-תא-מושתלים (לא) עכברים".

2. הערכה של GvHD מערכתית

הערה: ביצוע הליך זה סביבה סטרילית למחצה בחדר ניסיוני מורשה, מצוידים לטיפול עכברים חיים בתוך המתקן בעלי חיים.

בצע את המסלול הקליני של GvHD בעכברים בודדים; באופן ספציפי, להעריך, ציון העכברים ניסיוני 3 x שבוע לנוכחות של GvHD סימפטומים קליניים, בהתבסס על שיטת הניקוד המתוארים להלן, הותאם ממערכת הניקוד נוסדה קודם לכן על ידי קוק et al.⁶.
1. שוקל את העכבר כל אחד בנפרד, רושמות את המשקל, לחשב את אובדן משקל הגוף thespecific ביחס משקל הגוף זה נקבע לפני תחילת הניסוי (תואם ל- 100%) ביום 0 (שלב 1.1.2). ציון במשקל של פחות מ-10% מכלל המשקל ההתחלתי עם ציון 0, במשקל בין 10% ל- 25% עם כיתה 1 במשקל של יותר מ- 25% עם ציון 3.
2. ציון רמת הפעילות של כל עכבר, מפלה עכברים עם רמת פעילות רגילה (ציון = 0) של עכברים עם רמת פעילות מצומצמת למדי (ציון = 1) ועכברים עם התנהגות נייח אלא אם כן הם מגורה באופן חיצוני (ציון = 2).
3. ציון המרקם הפרווה, ובכך להפלות נורמלי, מבריק, האטרקציות, כגון פרווה (ציון = 0) מן פרווה בינוני הסתור (ציון = 1) ואת נוכחותם של קרחות (ציון = 2).
4. להבקיע את מרקם העור, להפלות לעור רגיל (ציון = 0) מאתרי סדיר של קנה מידה של העור (למשל, על הזנב ואת הכפות) (ציון = 1) ושינוי גודל ברור של אזורי עור כואבות (ציון = 2).
5. לנתח את מרקם של שברים מופרשים בצואה. ציון שרפרף רגיל (כלומר, עקביות קשה) בציון 0 שרפרף עם שרפרף deformable ורך עם כיתה 1, צואה ללא כל עקביות, ומכאן, עם שלשול עם ציון 2.
6. לסכם כל הפרמטרים בנפרד הצליחו ציון קליני מקסימלי של 12 לכל העכבר.
שקול, להעריך את הקריטריונים של הפסקת הניסוי בשל רמת חומרת המחלה הנוכחית של העכבר בודדים, בהתאם להנחיות המוסדית החלה ומורשים פרוטוקול בעלי חיים.

3. הערכה של GvHD מעיים

הניקוד של נגעים הקשורות GvHD באמצעות אנדוסקופיה המצומצמת של אזור המעי הדיסטלי
הערה:ביצוע זה סביבה semisterile בחדר ניסיוני מורשה, מצוידים לטיפול עכברים חיים בתוך המתקן בעלי חיים. השתמש תחנת עבודה מיני-אנדוסקופי כך אושרה לשימוש של חיות קטנות.
1. הכן את התקן אנדוסקופי בכך שכיסתה את הטלסקופ (קוטר של 1.9 מ מ), באורך של 10 ס מ עם נדן בדיקה אנדוסקופית. לנקות ולחטא אנדוסקופ עם מים ואתנול.
2. לעבור על המחשב, מקור האור מתכווננת קסנון במודול המצלמה, כוון את הפוקוס באופן כי אוביקטים בסביבות העדשה לתת תמונה ברורה.
3. להתחבר משאבת האוויר נדן אנדוסקופי. כדי להמחיש את זרם האוויר, לטבול את קצה אנדוסקופ לתוך כוס גביע מלא במים. לווסת את זרם אוויר על-ידי התאמת את השסתום בין משאבת האוויר ו נדן אנדוסקופי. להסתגל זה זרם אוויר איטית מתמדת, בא לידי ביטוי כמה עולה ללא הרף בועות.
4. המקום עכבר לתא עמיד בפני נזילה. לגרום הרדמה על ידי שאיפה של עד 4% איזופלוריין עד העכבר מחוסר הכרה. לאשר שיכוך כאבים, מצב הנעדר של הרפלקסים על-ידי בדיקת אובדן רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים ולסגת אובדן עוקבות של דוושת רפלקס.
5. השתמש מכונת הרדמה וטרינריים המתאימים על פי פרוטוקול בעלי חיים שמשמש. להעביר את העכבר מן החדר לסביבת העבודה של קולונוסקופיה. . כאן, מיקום העכבר anesthetized, עם האף שלה ב- nosecone (אשר מחובר המכשיר הרדמה), על גבי נקי עובד נדן כך העכבר הוא במצב שכיבה, מול הנסיין עם ישבנו הנפוח שלה.
6. כדי לשמור על הרדמה במהלך ההליך קולונוסקופיה, להפחית את ריכוז איזופלוריין כ- 2%. לפקח על הנשימה של העכבר, בתגובה לגירוי במהלך הקולונוסקופיה ולהתאים את הריכוז איזופלוריין-מאדה במידת הצורך. מכסים את העיניים של העכבר עם salve כדי למנוע מהם להגיע יבש.
7. לשלוט את היעילות של ההרדמה על ידי צובט בין האצבעות של העכבר. במקרה של נעדר תגובתיות, להמשיך לצעוד 3.1.8.
8. הרם את הזנב רק מעל לבסיס הזנב עם יד אחת ולהוסיף בזהירות אנדוסקופ, מוצבים ביד אחרים, דרך פי הטבעת לתוך פי הטבעת.
9. בעוד זרם האוויר מנפח לומן המעי הגס, לאט ובזהירות להעביר אנדוסקופ קדימה בכיוון aboral.
10. למקם אנדוסקופ באמצע שטיפת המעי הגס לומן, לשמור על עמדה זו על מנת לצמצם מגע עם הקיר שטיפת המעי הגס ועל מנת למנוע שריטות, פציעות הקשורות קיר עמוק יותר (למשל, וכתוצאה מכך הדימום), או אפילו קיר מחורר (ראה שלב 3.1.17) . לשלוט שלב זה על-ידי צפייה לצמיתות את זרם הווידאו (קרי, תחת חזותית מתמדת של תא שטיפת המעי הגס).
11. אם הצואה מתכווצים התצוגה, להסיר אנדוסקופ, לבצע חוקן על ידי שטיפה רקטאלית עם עד 2 מ"ל של תמיסת מלח, באמצעות פיפטה רך של פסטר. להשתמש נוזלי קטן ככל האפשר, כדי למנוע של דילול לא מכוונות של הצואה ואפקטים משניים אחרים באופן שלילי משפיע על המאפיינים של השטח הרירית, בסופו של דבר, התוצאות הבקיע.
12. נסו למקם באופן קבוע אנדוסקופ-כהגדרתו (קרי, נפרדות) אתר אנטומי בתוך המעי הגס דיסטלי לתקנן על מניה של דלקת מעי וכדי לייעל את comparability של הניקוד תוצאות בין עכברים לאורך ניסויים.
  הערה: בדרך כלל, עם אנדוסקופ נוקשה, ניתן להגיע לעומק מקסימלי של 4 ס מ באמצעות המסלול רקטלי. בין 2 ל 4 ס מ. aborally, המעי הגס באופן קבוע הופך flexure שאי אפשר לעבור עם הקולונוסקופ נוקשה. השתמש באזור המעי הגס הסמוך יש flexure בתור ברירת המחדל על מניה ספוט.
13. להתחיל להקליט את זרם הווידאו ותתחיל עם החריצים של דלקת.
14. להעריך את דלקת הקשורות GvHD של המעי הגס כשקלע את הפרמטרים הסביר, מתואר טבלה 1 , איור 3.
  1. להזיז אנדוסקופ הבקיע ספוט בעדינות, מעט מאחור - וקדימה כדי להעריך את הפרמטרים השונים.
  2. להעריך את הפרמטר "המוגבהת", וכן "צואה עקביות", על-ידי הצבת אנדוסקופ במרחק רחב יותר ביחס לקיר המעי הגס.
  3. להעריך את הפרמטרים "צפיפות" ואת "vascularity" על-ידי הצבת אנדוסקופ קרוב לדופן המעי הגס. עבור משימה זו, בזהירות להחיל את המתח היטב עצומות לדופן המעי הגס עם קצה אנדוסקופ.
15. עם סיומו של תהליך הניקוד, לעצור את ההקלטה.
  הערה: לאחר מכן, סרטון הווידאו המוקלט ניתן להשתמש סה כ או המשמש ליצירת להחליפן בתמונות (קרי, צילומי מסך) הקריטריונים מיני-endoscopically המוערך בסך הכל תורם לדלקת המעי הגס.
16. הסר בזהירות אנדוסקופ.
17. להפסיק איזופלוריין תערוכות על ידי העברת העכבר לכלוב נפרד שבו הוא נחשף הסביבתית. לחמם את העכבר עם מנורה האורות האדומים ולבחון את העכבר עד והשיחזור ההרדמה להכרה מלאה.
  הערה: בשל האינפלציה אוויר של המעי הגס במהלך סי. טי, אזור הבטן של העכבר עשוי להופיע פצפוצי למעלה ישירות לאחר מכן. אמנם זה נורמלי ולא של הארעיות, סימנים ממושך של אינפלציה מסיבית, אפילו המתקדמת של הבטן וכישלון של שחזור של העכבר עשוי להצביע על ניקוב לא מכוונות של המעי הגס (במקרה זה, הצרכים העכבר המתה מיד).
18. על התאוששות מלאה, מקם את העכבר בחזרה לכלוב שלו בהתאמה.
19. הגישה אופציונלי: זה גם אפשרי לקחת ביופסיות רקמות מודרך בתצוגה. לנקוט בצעדים הבאים.
  הערה: הקולונוסקופיה יבוצעו באותו אופן כפי שתואר בשלבים 3.1.1 - 3.1.18, עם השינויים הבאים.
  1. בשלב 3.1.1, להשתמש נדן בדיקה אנדוסקופית עם ערוץ עבודה מובנית, במקום נדן בדיקה פשוטה ללא ערוצי עבודה, מכסים את הטלסקופ. להציג מלקחיים ביופסיה לתוך הערוץ לעבוד עד את קצהו יהיה גלוי רק מול אנדוסקופ על מסך וידאו כי זה בעיקר מונע פגיעה לא מכוונת אל המעי.
  2. להמשיך עם שלבים 3.1.2 - 3.1.11. הכנס אנדוסקופ לתוך המעי הגס ופי לדחוף אותו בקפידה קדימה לנקודה של ריבית.
  3. מעסיקים את עזרתו של הנסיין השני של הפעילות של לקיחת ביופסיות רקמת מעי. שואל הנסיין השני כדי לנווט את קצה המלקחיים ביופסיה לאזור חוקן של בחירה על ידי דחיפת המלקחיים בתוך התעלה לעבוד לאט קדימה עד שניתן לפתוח מלתעותיו של המלקחיים. כל הזמן לצפות זרם הווידאו במהלך הליך זה כדי למזער את הסיכון ופצעו את הקיר חוקן.
  4. לשחזר דגימת רקמה קיר המעי הגס על ידי פתיחה וסגירה מלתעותיו של המלקחיים ביופסיה בקפידה.
    הערה: . תעשה את זה בזהירות כדי למנוע את הנקב. של הקיר חוקן במקרה נדיר של ניקוב המעי הגס, מיד להקריב את העכבר המושפעים על-ידי החלת מידות בהתאם להנחיות מוסדיים, תחת ממשל רציפה של חומרי הרדמה.
  5. משוך לאחור ולהסיר את המלקחיים סגור התעלה עבודה. הסר את הדגימה מתוך מלתעותיו של המלקחיים ביופסיה על ידי טבילה ורעדתי בקפידה המלקחיים נפתח ב- PBS פתרון סטרילי. לאחר מכן, בחר תנאי האחסון הנכון דגימת הרקמות, לפי הבדיקות במורד הזרם המתוכנן. לאחר חיטוי עם 70% אתנול, המלקחיים ניתן להשתמש כדי לקחת עוד יותר ביופסיות.
  6. לאחר נטילת ביופסיות, להסיר אנדוסקופ וסיום הקולונוסקופיה כמתואר בצעדים 3.1.16 - 3.1.18.
ניתוח histopathological
1. בין ימים 26 ו- 30 לאחר ההקרנות רנטגן, המתת חסד העכברים הנמען מאפשר-של HCT בהתאם החלת המוסדיים הנחיות ורשויות. בשביל זה, עזים ומתנגד העכברים על ידי שאיפה של 5% איזופלוריין. להמשיך עם החשיפה איזופלוריין עבור 1 דקות לאחר נושם המעצר ואשר המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם. ביסודיות לחטא את הפרווה והעור של העכבר עם 70% אתנול.
2. פתיחת חלל הבטן ולהסיר את המעי הגס. להעביר את זה צלחת פטרי (בקוטר של 92 מ"מ) עם PBS.
3. למלא טיפ מנפק מ עם PBS. בעזרת מלקחיים Semken באורך של 13 ס מ וטיפים מעוקל משונן, להחליק החלק הדיסטלי של המעי הגס (כ 5 מ מ) על פני קצהו של קצה מנפק. לתקן את המעי הגס עם המלקחיים בקצה מנפק ובזהירות ריקון המעי הגס עם PBS על-ידי לחיצה הבוכנה של קצה מנפק להסיר צואה מהמעי.
4. לגזור מקטע מעי ממוקם כ 5 מ מ פי הטבעת, בעזרת אזמל.
5. את הדגימה resected בטן ב- 4.5% פורמלדהיד בן לילה. לפני להטביעו פרפין, מקם את הרקמה בתנוחה זקופה.
6. לחתוך 3 מיקרומטר חצו מקטעי רקמת המעי הגס פרפין-מוטבע, תכתים אותם ועם hematoxylin אאוזין (HE), באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים מוכתמים.
7. להכין שהוכתמו הוא חתכי רוחב של דגימות רקמה המעי הגס.
8. הותאם מתוך מטריצת התוצאות שדווחו על-ידי et al. קפלן¹², histopathologically להבקיע את פעילות דלקתית semiquantitatively, עם ציונים מגיל 0-3: אין דלקת (ציון = 0), דלקת קלה (ציון = 1), בינוני דלקת (ציון = 2), דלקת חמורה (ציון = 3).
  הערה: באופן אידיאלי, מעסיקים עבור משימה זו המומחיות של פתולוג מנוסה בהערכה של GvHD מעיים מאתר, לראות את הטבע של ניסיוני והקבוצות בקרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בפרוטוקול הנוכחי, המתארת את ההערכה מיני-אנדוסקופית של המעי GvHD-הקשורים נגעים של המעי הדיסטלי, הוקמה ואומת בעכברים בעבר נתון של אינדוקציה מערכתית של מודל GvHD אקוטי חמורה. במחקר זה, היינו מחלקה MHC אני תואמים באופן מלא מערכת מודל אשר BALB/ג' עכברים היו אולם מוקרן, ולאחר מכן את השתלת של T-תא-דלה מח העצם allogeneic ועל ידי הממשל של alloreactive בתדר GvHD CD3 C57BL/6⁺לימפוציטים מסוג T. תאי T תאים-מדולדל מח העצם ותאי T הטחול עבור אינדוקציה GvHD היו מטוהרת על-ידי הפרדה מגנטית. הטוהר של אוכלוסיות תאים אלה נקבע על ידי cytometry זרימה, ואת התוצאות נציג של תהליך טיהור מוצגים באיור 1, מראה של דלדול מספקת של תאי T מתאי מח עצם הכולל והעשרה עקבית של טחול-derived CD3⁺ T תאים לפני העברתם בעבר עכברים לקרינה. הקורס הקליני המוצג באיור 2 מדגים את אינדוקציה reproducibly חזקה של פנוטיפ GvHD מערכתית קליני על מאפשר-של HCT בנוכחות (WT, בשחור) לעומת העדר alloreactive התורם T לימפוציטים (לא, גריי). מערכת התוצאות שדווחו בעבר על ידי קוק. et al. מייצג את ליבה של הסכום שבו שישה פרמטרים הם העריכו ואת ציון: גוף משקל, יציבה, פעילות, מרקם העור והפרווה, שרפרף עקביות⁶. בקרת עכברים מנוסה אחד בלבד, מוקדם המתרחשים הפסגה של התוצאה הקלינית, בין ימים 5 ו- 10, זה דומה נצפתה בעכברים T-תא-קבלה, ולכן, בעיקר בשל הקרנה-הקשורים מערכתית דלקתיות התגובה. ללא קשר, ציונים קליני של התורם T-תא-קבלת עכברים החלו לקום מוקדם יותר הראה הכולל לשיא גבוה יותר, רק transiently ירד לאחר בתחילה לשיא, לאחר מכן, בעיקרו של דבר עלה שוב, ללא הרף, על התקופה הנותרת של הניסוי. באופן כללי, תוצאות אלו הם מסכים עם פרשנות המציגים עכברים T-תא-קבלת חזקה וסימנים יותר מתקדם של GvHD מערכתית לעומת לא עכברים.

העכברים של HCT-מאפשר קבלה של לימפוציטים-T-תורם הראה סימנים שונים של חריפה הקשורות איברים ומערכתית GvHD הגילויים, בסך הכל וכתוצאה ציונים סכום גבוה, בעוד העכברים שליטה חסרה חיבתה בינוני עד חמור, בעיקר בנקודות זמן מאוחר יותר. עם זאת, סימנים של GvHD מעיים הם מיעוט ב- GvHD מערכתית הניקוד מערכת, איפה הפרמטר היחיד הקשורות בטן המוערך צואה עקביות. כפי שמוצג בטבלה 1, מיני-endoscopically למהירים הוגדרו הקריטריונים, המיועד במיוחד עבור תיאור מדויק, ניקוד, לדירוג של נגעים GvHD-הקשורים מעיים, באמצעות התאמת קריטריונים דיווח בעבר על הערכה של קוליטיס syngeneic להקשר של קוליטיס מונחה alloresponse⁹. איור 3 מציג דוגמאות טיפוסיות לכל קריטריון בודדים, הממחישות את הסוג וההיקף של נגעים GvHD-הקשורים מעיים, ובכך להמחיש המטריקס לדירוג מוחל בעת ההערכה מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי של עכברים GvHD מועדת על השתלת של מחלקה MHC מלא תואמים התורם לימפוציטים.

איור 4 א מראה כי המעי GvHD סכום הציון תוצאות בהתבסס על הקריטריונים שהוגדרו בטבלה 1, המוצג באיור 2 בקלות לאפשר הנסיין להפלות התורם לימפוציט קליטת עכברים עם סימנים חמורים של מעיים דלקת של עכברים שליטה הם למעשה חסרי GvHD. כדי לאמת את מערכת לדירוג מבוסס מיני-endoscopically, histopathological מחקרים בוצעו באמצעות שדווחה בעבר מיקרוסקופיים לדירוג המערכת¹². הנתונים איור 4B לאשר כי המעי הגס של עכברים למהדורת דלקת הקשורות GvHD, כפי שמעידים סכום colonoscopic גבוהה ציונים, התצוגה באופן דומה חזק histopathological סימני דלקת, בהתחשב histopathological סיכום ניקוד של ≥2 לאחר המוות. לעומת זאת, המעי הגס רקמות של בקרת עכברים להציג לא (ציון 0) או לכל מתון ביותר, (ציון 1) histopathological סימני דלקת, בקו אחד עם העדר סימנים לזיהוי מיני-endoscopically של קוליטיס וירטואלי. יתרה מזאת, כפי שמוצג באיור 4C, D, מחקרים קורלציה בין מיני-endoscopically ו- histopathologically העריכו קוליטיס ופעילות GvHD מערכתית ציונים בוצעו. חשוב, מחקרים אלה הראו כי עשרות רבות של מיני-endoscopically נקבע סכום של ≤3 לחזות בצורה אמינה העדר אמצע-כדי-כיתה גבוהה יותר (קרי, ≥2) מעיים GvHD-הקשורים דלקת מעי ציוניהם של ציון histopathological. בסופו של דבר, חומרת GvHD מעיים המוערך endoscopically מראה קשר עם הפעילות GvHD מערכתית.

איור 1 : זרימה cytometric הערכת איכות של תאים במח העצם T תאים-מדולדל דיסקות מטוהרים, CD3 הטחול allogeneic⁺ T תאים. דלדול (A) של תאים במח העצם CD90.2⁺ מושגת על ידי הפרדה מגנטית, באמצעות ערכת טיהור זמינים מסחרית. הטוהר של תאים במח העצם T תאים-מדולדל נקבע על ידי cytometry זרימה, על ידי צביעת תאים לפני ואחרי דלדול תא T עם אנטי-CD45.1, אנטי-CD3. תוצאות הניסוי נציג אחד מוצגים. (B) T הטחול התאים היו טהור דיסקות, העסקת ערכת טיהור זמינים מסחרית. הטוהר נקבע על ידי cytometry זרימה, השוואה בין התדרים של CD45.2, CD3 costaining של דגימות נגזר לפני ואחרי בידוד תא T. תוצאות הניסוי נציג אחד מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : הקורס הקליני של GvHD, העסקת מחלקה MHC אני תואמים באופן מלא דגם- לזירוז GvHD אקוטי, עכברים BALB/c היו מוקרן ביום 0 לכל הגוף. העכברים קיבלו תאים במח העצם T תאים-מדולדל 24 שעות מאוחר יותר (d1). יום 2, העכברים הוזרקו CD3 הטחול allogeneic⁺T תאים (פראי-סוג [WT]; n = 9). כפקד, עכברים התקבל T תאים-מדולדל מח עצם לבד (לא; n = 9). העכברים היו העריך במיוחד הנוכחות ואת חומרת התסמינים הקליניים של GvHD שלוש פעמים בשבוע. הנתונים המוצגים מייצגים ערכים רשע ± SEM של הציונים קליניים המתקבל עכברים בודדים בקבוצת הטיפול המוצע של שני ניסויים נציג. הנתונים נותחו על ידי ANOVA דו-כיווני, ואחריו posttest השוואות מרובות של Bonferroni. p < 0.0001 נחשב משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : נציג תמונות דוגמאות לדירוג ולהמחיש שבבסיס המטריקס הניקוד של השינויים המעי הגס הקשורות GvHD מוערך על ידי הערכה מיני-אנדוסקופית של נקודתיים של עכברים חיים, מאפשר של HCT-שטופלו. כדי להשלים להמחיש את תיאור מפורט של ציון הניקוד בשימוש ואת מערכת טבלה 1, להחליפן בתמונות מיני-אנדוסקופית של רמות הסיכון הערכה (ציון) עבור כל הפרמטרים בנפרד במעי הגס של מרדימים, עכברים חיים שעברו מאפשר-של HCT בין ימים 26 ו- 30 לפני כמתואר באיור 1 מוצגים כאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : מיני-אנדוסקופית הניקוד, לדירוג של דלקת מעיים הקשורות GvHD של המעי הגס, באופן אמין לניבוי הנוכחות של קוליטיס בדרגה גבוהה העריך כשקלע histopathological. (א) בין ימים 26 ו 29 לאחר אינדוקציה של GvHD כמתואר באיור1, הביטוי של GvHD מעיים הוערך על ידי אנדוסקופיה מיני בעכברים בשידור חי, מרדימים. שינויים חוקן הבקיע, מדורגים על פי שיטת הניקוד, לדירוג מתואר טבלה 1 ו- 2 איור. להחליפן בתמונות אנדוסקופי של שליטה (אין תא T; לא) ופראי-סוג (WT), T-תא-קבלת עכברים, את הציון המוערך מיני-endoscopically (למעלה) מוצגים. (B) העכברים הוקרבו 12 שעות אחרי האבחון מיני-אנדוסקופית, ואת החלק הדיסטלי של המעי הגס היה מעובד, העריך histopathologically. פעילות דלקתית hematoxylin ו eosin-מוכתם חתכי רוחב של המעי הגס דיסטלי היה מדורגות. נציג hematoxylin ו eosin-מוכתם לחצות קטעים של המעי הגס דיסטלי אין תא T ו- WT T-תא-קליטת מאפשר של HCT-מטופלים עכברים, היסטולוגיה המתאימים מוצגים ציונים. הנתונים לוחות A ו- B נותחו על ידי הסטודנט t-לבדוק, מוצגים זאת אומרת ± ב- SEM. * * *p < 0.0001 נחשב משמעותי. WT: n = 15; לא: n = 15. הנתונים מייצגים במאגר הנתונים של ארבעה ניסויים בודדים. תלות הדדית של קולונוסקופיה ניקוד, הניקוד היסטולוגית (C). הנתונים מוצגים כמו תיבת מגרשים. כל כתם מציג את החציון (קו שחור בתוך כל תיבה), טווח הנתונים (דקות כדי מקסימום) ו רביעונים (אזורים של כל תיבה). WT: n = 15; לא: n = 15. הנתונים מייצגים במאגר הנתונים של ארבעה ניסויים בודדים. (ד) מתאם בין קולונוסקופיה הבקיע וניקוד קליניים. שליטה והן פראי-סוג T-תא-קבלת עכברים כלולים בניתוח המתאם. הקו המלא מייצג קו הרגרסיה הליניארית. מקדם מתאם ספירמן (r-ערך) ו- p-ערך מוצגים. WT: n = 12; לא: n = 13. הנתונים לייצג נתונים במאגר בין 3 ניסויים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הציון	0	1	2	3
המוגבהת של הקיר חוקן	במיוחד מעיים, הפנימית איברים (למשל הטחול) גלוי ביסודיות	הפחתת דיסקרטית לציפיותיו של איברים מעיים במיוחד בשל אטימות מתון של הקיר חוקן	צמצום מתון לציפיותיו של איברים מעיים במיוחד בשל אטימות משמעותית של הקיר חוקן	חוסר בניראות של איברים במיוחד מעיים, כלומר שאינם שקופים קיר חוקן
צפיפות רשת	חלק, לא מושפע הרירית משטח המראה; קריפטה חוקן דפוס גלויות	המראה וחספוס, המרוצף דיסקרטית של השטח הרירית	המראה וחספוס, המרוצף מתונה של השטח הרירית	חספוס חמור והמראה המרוצף של השטח הרירית; מראה כמו כרית של רירית
Vascularity	דפוס וסקולרית שהודעה הצגת הרשת המקיימים תקשורת של כלי שיט גדולים וקטנים	שינויים דיסקרטית של התבנית כלי דם; נראה כלי דפוס פריי	כמה ספינות התשומת לב; רשת מקוטע	צור קשר עם דימום המושרה; דפוס כמו נקודה של כלי
צואה עקביות	נורמלי; צואה קשה; החוטים בסדר של ריר בין הקיר שטיפת המעי הגס צואה יכול להיות שנצפו	שרפרף מעוצב עדיין אבל עשויים להכיל התמוטטות קצוות; deformable עם קצה אנדוסקופ	צואה הוא רך, unshaped הצואה היא בעליל יותר נוצץ (תכולת המים גבוהה יותר)	צואה הוא רופף, נוזלי; שלשולים מימיים. שרפרף עשוי מפוזרים באקראי על פני השטח הרירית של המעי הגס

טבלה 1: מיני-אנדוסקופית הניקוד ואת דירוג מטריצה של מעיים הקשורות GvHD נגעים במעי הגס של חיים מאפשר של HCT-מטופלים עכברים. שינוי המבנה של endoluminal ו- transmural קולון בעכברים מאפשר-של HCT pretreated היו מוערך על ידי קולונוסקופיה של הרקטום, המעי הגס דיסטלי של עכברים מרדימים, בשידור חי, באמצעות מערכת מאתר אנדוסקופיה המצומצמת. נגעים חוקן סווגו בעזרת מערכת הניקוד אנדוסקופי (ששונה מאתר אנדוסקופי אינדקס של חומרת קוליטיס [MEICS]) זה הסיק מן MEICS המקורי שדווחו על-ידי בקר ואח⁹ ומותאמים בהקשר של שיטת הניקוד מאפשר-של HCT. המעי הגס דיסטלי חזותית שקובעת את הנוכחות ואת סדר הגודל של ארבעת הפרמטרים הבאים: 1. להדמיה של אור אנדוסקופי (המוגבהת) דרך דופן המעי הגס כמו עיבוי קיר; 2. השטח הרירית מציג מראה קאבלסטון (צפיפות) של מונחה endoluminal השטח הרירית; 3. דפוס שונה vascularization (vascularity); 4. endoscopically העריכו מראה צואה באתרו (צואה עקביות). לכל פרמטר הוא הבקיע מ- 0 (סימנים) 3 (פנוטיפ חמור ביותר), הוספת עד ציון סכום מרבי של 12 לכל העכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול מתאר את המתודולוגיה של אינדוקציה ובחינת מיני-אנדוסקופית פנוטיפ חוקן נצפתה במהלך GvHD מעיים. היא מגישה את מטרת הרחב מאפשר למדענים ללמוד GvHD מעיים longitudinally ו noninvasively במהלך המחלה כולו (כלומר, מתוך תחילתה של ביטוי חוקן והתקדמות עד פעילות המחלה מקסימלי).

עם זאת, ישנם כמה שלבים קריטיים והמגבלות חשוב הטמון למתודולוגיות הציג שהנסיין צריך להיות מודע לפני החלת הטכנולוגיות בהקשר המדעי בהתאמה. ראשית, למרות שהשתמשנו בהצלחה את ההערכה מיני-אנדוסקופית של נגעים חוקן הקשורות GvHD במעיים מערכת מודל תואמים histocompatibility קטין¹¹, פרוטוקול שמוצגת כאן חל כיום באופן בלעדי MHC בכיתה אני תואמים באופן מלא דגמים GvHD אקוטי. בעוד מחלקה MHC אני תואמים באופן מלא דגם GvHD נפוצות, שימוש תכוף⁵, היא מבוססת היטב כי המאפיינים של GvHD ביטוי הם תלויים במידה רבה substrains העכבר בשימוש מאז זה מאוד משפיע, למשל, רגישות הקרנה. יתר על כן, המקור העכבר ניסיוני עם מופע, קומפוזיציה בדרגות שונות של microbiota מעיים ומספרים בשימוש בתאי T allogeneic שהועברו עשוי אנושות להשפיע קינטיקה של הדינמיקה של ביטוי GvHD מעיים¹². לפיכך, הוא שלב קריטי בזהירות לבדוק ולאמת את האמצעים שצוין עבור היכולת שלהם בהצלחה זירוז GvHD מעיים כפי שמוצג.

לגבי יישום מוצלח של המבדק מיני-אנדוסקופית בשידור חי של GvHD מעיים חריפה, אנו רוצים להדגיש כי לטיפול אנדוסקופ היא פשוטה, שייתכן שיהיה צורך הכשרה כדי למזער את הסיכון של חווה הכי חששתי סיבוך (קרי, ניקבה את דופן המעי בעזרת המכשיר נוקשה בשילוב עם הצורך לנפח אוויר-המעי הגס). בשל פגיעות הנוצרות על-ידי דלקת מוגברת גמישות ירידה של רקמת מעי, שלמות קיר הבטן יכול להיות בסיכון גבוה יותר במהלך שלב ההתאוששות postradiation (i.e.,until יום 10) ועל ביטוי מלא של מעיים הקשורות GvHD קוליטיס (קרי, לאחר כ יום 25). חשוב, עם זאת, לא הבחנו סיבוך משמעותי מוגבר המחירים תלויים נקודת הזמן של אנדוסקופיה, ככל אנדוסקופ מתקדם בעדינות תחת ניראות מספיקות. לעומת זאת, זיהינו סמים שיוצרת מינון להיות גורם סיכון שכן לא מספיקות עומק ההרדמה עלולה לגרום להתרחשות של תנועות גוף בלתי רצויות של העכבר ניסיוני, ברצף, קיר מעי מחורר אירועים. שנית, השלב הקריטי ביותר במהלך תהליך הניקוד מייצג הגבלות בעניין זה בשל נוכחותם לא רצויים של מוצק או נוזלי (למשל, שלשול) צואה של לומן מעיים כפי הנסיין נע אנדוסקופ למצב הבקיע. במצב זה, הסמקה באזור המעי הגס עם תמיסת באמצעות פיפטה פלסטיק גמיש נדרש לעתים קרובות. עם זאת, מאז ההליך שיכול לסכן את הניקוד דיוק וספציפיות של מספר פרמטרים (למשל, צואה עקביות), זו אזהרה בקפידה צריך להילקח בחשבון על הניקוד.

קיימות מספר מגבלות הגבלת את הפרשנות והמסקנות להסיק בגישה אנדוסקופית זו. ראשית, מהותי מתודולוגיה באמצעות אנדוסקופ גמיש דרך המסלול רקטלי, הערכות מוגבלות ל- האחרונה 3-4 ס מ מערכת העיכול (קרי, פי הטבעת ואת המעי הגס הדיסטלי). לכן, הקשורים GvHD חיבתו של המעי הגס הפרוקסימלית ואת אפילו המעי הדק מופעלים כברירת מחדל נכללו ההערכה, המציין כי שאלות בנושאים מדעיים התמקדות פנוטיפ במעיים קטן של GvHD לא יהנה בגישה זו. שנית, למרות דלקת היא אחת התכונות מורפולוגיות סימן ההיכר של GvHD מעיים, מאפיינים נוספים, כמו שיעור אפופטוזיס מוגברת של תאי אפיתל המעי, לאובדן של הארכיטקטורה קריפטה מעיים, נמצאים לעתים קרובות, כלול זרימת העבודה histopathological שבבסיס GvHD מעיים הניקוד, ציון על ידי פתולוגים בחולים מאפשר-של HCT. כאן, אנחנו בקורלציה הציונים GvHD מעיים המוערך מיני-endoscopically restrictedly עם histopathologically המוערך סימני דלקת. נקיטת גישה זו, הגענו למסקנה כי דלקת מעי מעל לסף מסוים על מניה colonoscopic הוא אמין חיזוי לנוכחות דלקת בינונית-גבוהה כיתה, כפי מוערך על ידי ניתוח לאחר המוות histopathological. עם זאת, מחקרים עתידיים צריכים לחקור איך, למשל, אפופטוזיס המוערך histopathologically המחירים מתייחסים אנדוסקופי-מיני סה כ סכום הציונים או, למשל, אחד של ארבעת הפרמטרים בודדים מוטבעות בו הציון sum. שלישית, בעוד עכברים הסובלים histopathologically בינונית ל- high-כיתה GvHD ניתן לזהות בקלות באמצעות הגישה הבקיע אנדוסקופי, עכברים עם סימנים עדינים יותר של דלקת מעיים עשויים לפספס על ידי הגישה המתוארת, בהתחשב בעובדה הניקוד histopathological גילה הנוכחות של סימנים לדלקת בקבוצה של עכברים לא עוברת מאפשר-של HCT לבד, בלי השתלת של לימפוציטים התורם alloreactive מתון. ביולוגית, ממצא זה עשוי להיות ריאלי, שכן יש כבר allotransplanted לא עכברים, קוליטיס מינימלי, ואכן, ומשקפים את הנוכחות של רמות נמוכות של GvHD כתוצאה של הסרת לא שלם של תאי T מן השבר תאים במח העצם או את בנייתו מחדש של alloreactive T תאים ממח העצם לאורך זמן. מחקרים עתידיים צריך שאלות אלו בפירוט רב יותר. רביעית, באופן רשמי, פרוטוקול זה מתמקד קוליטיס GvHD-הקשורים מעיים הוקמה באופן מלא. עם זאת, כפי שמוצג ופורסמו בעבר, תחילתה של קוליטיס סביב יום 15 יכול להתגלות endoscopically, quantitated¹¹. כאן, עכברים נוטה GvHD יכולה להיות ההלניסטי עכברים לא שבה פנוטיפ חוקן עשוי לנבוע אך ורק שיורית סימנים של נזק לרקמות הקרנה-induced או, ליתר דיוק, ראי התגובה שחזור הרירית לאחר הקרנה¹¹. עם זאת, מחקרים עתידיים צריך לתאם הערכות אנדוסקופי לכוון histopathological ניתוח מפורט של GvHD נוטה עכברים לעומת בקרת עכברים בנקודות זמן מוקדם יותר.

לבסוף, יישום ההרחבות מעניין, שימושי של החריצים אנדוסקופית של המעי GvHD היא השימוש בערוץ אנדוסקופי עבודה ישירה של מלקחיים ביופסיה ממוזער למבנה אנטומי של הבחירה במעי הגס. תכונה זו מספקת, כמעין מובנית-in-אפשרות, את האפשרות לקחת ביופסיות רקמות מודרך תצוגה מסוגל לנתח עוד יותר על ידי סדרה של טכניקות במורד הזרם כמו histopathology, immunofluorescence מכתים ו ניתוחים בזמן אמת PCR של גנים של ריבית. עם זאת, מחקרים עתידיים צריכים להעריך באופן רשמי אם, למשל, histopathological מניה, לדירוג של ביופסיות שנלקחו endoscopically שוות לתוצאות histopathological, בהתבסס על דגימות שנלקחו כמקובל (דהיינומן מורדמים עכברים).

בסך הכל, עם פרוטוקול זה המתאר את תנאי הגיוס הערכתה מיני-אנדוסקופית של המעי GvHD, אנו מספקים מתודולוגיה כדי להעריך, לצבור, כיתה GvHD מעיים הרלוונטי מאתר GvHD מודל למערכת של HCT-מאפשר. ההערכה אנדוסקופי ניתן לחזור על העכבר באותו מספר נקודות זמן לאורך זמן, ומבטל את הצורך לבצע המתת חסד עכברים להעריך באופן רציף רקמת המעי GvHD-הקשורים פתולוגיה (למשל, בסביבה טיפולית). התוצאות הבקיע מיני-אנדוסקופית הוכיחו להיות להשוות תוצאות מתקבל על ידי ההערכה histopathological של דלקת המעי הגס ו בקורלציה עם פעילות GvHD מערכתית. בנוסף, הליך זה יכול להיות משולב עם ביופסיות מונחה תצוגה באמצעות ערוץ עבודה של אנדוסקופ. בסופו של דבר, עם זאת, מחקרים עתידיים יש להעריך עד כמה נחוש histopathologically תכונות מורפולוגיות מלבד דלקת, לעתים קרובות נמצאו בנגעים מושפעות GvHD מעיים, מתייחסים התוצאות המתקבלות עם זה גישת הערכת מיני-אנדוסקופית וניקוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי שיתופי מחקר מרכזי (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; פרוייקט B03) (כדי בעדותה) 1181 בדיקת יתירות מחזורית (CRC-DFG, פרוייקט B05) (כדי בעדותה), שניהם במימון פתוח (DFG, קרן מחקר גרמני).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH₄Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na₂EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO₃)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, Suppl 2 58-64 (2008).
Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).
Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).
Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).

Immunology and Infection

אינדוקציה של מעיים שתל – מול – מארח מחלות והערכה מיני-אנדוסקופית שלה בעכברים בשידור חי

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.