Induktion av Intestinal Graft - versus - host sjukdom och dess Mini-endoskopisk bedömning i levande möss

Summary

Här presenterar vi ett protokoll som beskriver allogen hematopoetisk stamcellstransplantation och tillåter repetitiva mini-endoskopisk utvärderingar av distala kolon på plats för närvaro, egenskaper och svårighetsgrad av kolon inflammation inom live möss som lider av intestinal graft - versus - host sjukdom.

Abstract

Akut graft - versus - host sjukdom (GvHD) representerar den allvarligaste komplikationen att patienter som tidigare genomgår allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (allo-HCT) transplantation ansikte och associeras ofta med en dålig kliniskt resultat. Tag, exempelvis GvHD manifestationer av huden är vanligtvis lyhörda för etablerade immun-undertryckande terapier och, därför, tar inte en dödlig kurs, förekomsten och intensiteten av intestinal GvHD, särskilt av mitten av-till-nedre delar av tarmen, påverka starkt utfallet och totala överlevnaden hos patienter med akut GvHD. terapeutiska alternativ är i huvudsak begränsade till klassiska immun-undertryckande agenter ger endast måttlig sjukdom-förmildrande effekter. Därför detaljerad kunskap om vävnad boförälder immun kaskad, förändringar i den intestinala bakterieflora, och stromal svaret före, vid och efter intestinal GvHD uppkomsten är mycket angeläget att förstå händelser och mekanismerna bakom dess patogenes och utveckla innovativa terapeutiska alternativ. Murina modeller av GvHD är ofta anställda att identifiera och bedöma funktionellt molekyler och vägar förment körning intestinal GvHD. Dock saknas innebär att särskilt övervaka och utvärdera tarminflammation med tiden i huvudsak eftersom etablerade poängen att bedöma och klassificera akut GvHD rutinmässigt består av olika parametrar som snarare speglar systemisk GvHD manifestationerna. Detaljutvärderingen av intestinal GvHD har varit begränsad till studier med euthanized möss, därmed i huvudsak exklusive längsgående (dvs rörelseenergi) analyser av kolon utrymmet under ett givet experimentella villkor (t.ex. antikroppsmedierad blockad av en proinflammatoriska cytokiner) i levande möss (dvs. in vivo). Mini-endoskopisk jordbaserad bedömningen av distala kolon av allo-HCT-behandlade möss beskrivs här tillåter en) en utförlig makroskopisk bedömning av olika aspekter av tarminflammation och b) möjlighet att samla vävnadsprover för nedströms analyser på olika tidpunkter under loppet av observationsperioden. Sammantaget ger den mini-endoskopisk metoden ett stort framsteg i prekliniska icke-invasiv övervakning och bedömning av intestinal GvHD.

Introduction

Hematopoetiska maligniteter som direkt följer av hematopoetiska stamceller facket och okontrollerad, finns snabbt framåt, och svåra immunmedierade sjukdomar ofta indikationer att utföra allo-HCT^1,2. Även om redovisning för förekomsten av prognostisk gynnsamma graft-versus-tumör svar, är givare lymfocyter dock ofta inducera och främja en oönskad immunmedierade attack av frisk vävnad komponenter inom allo-HCT mottagaren , en process som kallas graft - versus - host sjukdom³. Manifestationer i tarmen, den så kallade intestinal GvHD, representerar den mest fruktade komplikationen av akut GvHD, svåra former som är rutinmässigt associerade med en hög dödlighet^1,2,4.

Övergripande, murina modeller allo-HCT har dykt upp som ovärderligt verktyg för att identifiera och studera immunomedierade mekanismer bakom patogenesen av GvHD⁵. Kinetic bedömning av, exempelvis positiva effekterna av nya terapeutiska insatser över tid i levande möss rutinmässigt bygger dock på bestämning av kliniska GvHD noter⁶. Medan dessa noter är lämpliga att reflektera, exempelvis den totala sjukdomsbördan (dvs. den systemiska GvHD), kliniska noter brist på känslighet för att tillförlitligt spegel organ-specifika manifestationer (t.ex., i tarmen). Slutsatser, exempelvis med avseende på gut-skyddande effekter av en viss terapeutisk intervention, som baseras på dessa scoring system vanligtvis faller därför kort.

Trots stora framsteg genom uppfinningen av romanen hela kroppen imaging modaliteter i kombination med användning av antingen självlysande eller fluorescerande genetiska mus modeller^7,8, metoder att direkt och specifikt bedöma den intestinala manifestation av GvHD i levande möss saknas. Logiken bakom protokollet endoskopiska bedömningen av intestinal GvHD fenotypen beskrivs i nästa avsnitt är därför att övervinna detta hinder. Dessutom motivation är också att minska mängden experimentella möss eftersom hittills, en detaljerad bedömning av cellulära, morfologiska och molekylära egenskaper (t.ex., av histopatologi eller molekylärbiologi) av intestinal GvHD manifestationen har slutligen krävs offrandet av experimentella musen.

Vår institution har tidigare rapporterat om metodiken för en mini-endoskopisk bedömning av kolon manifestationer i samband med syngena kolit modeller⁹. I protokollet presenteras här, har vi förfinat och anpassat den colonoscopic scoring matris för alloresponse-driven kolit i levande möss med intestinal GvHD vid transplantation av alloreactive HCT och givare lymfocyter i en MHC klass jag helt felaktigt inställning . Vi har identifierat fyra parametrar lämplig att återspegla intestinal GvHD-relaterade kolon lesioner. Dessutom har vi etablerat ett system som tillåter en finjusterad gradering av någon enskild faktor, vilket resulterar i en ny Poäng som lätt informerar läsaren om svårighetsgraden av intestinal GvHD finns i en viss mus vid en given tidpunkt. Histopatologiska analyser bekräftade att en endoskopisk poäng över ett visst tröskelvärde tillförlitligt förutspår måttlig till hög grad vävnadsinflammation. Därav, mini-endoskopisk utvärdering tycks representera en fungerande ersättning för det guldmyntfot histopatologi som rutinmässigt kräver offrandet av de experimentella möss. Allt detta protokoll kan tillämpas praktiskt taget alla given tidpunkt och kan användas flera gånger under loppet av sjukdom^10,11. Dessutom i motsats till användningen av Mareld-beroende metoder, inga labor-intensiv och tidskrävande åtgärder som intercrossing genetiskt modified möss krävs och, därmed metoden kan tillämpas på valfri mus rad intresse.

Sammantaget ges skadlig klinisk synvinkel allo-HCT patienter med svår intestinal GvHD, är snabba vetenskapliga framsteg och mer insikt i de molekylära mekanismerna bakom immun patogenesen brådskande. Viktigt, etiska överväganden kräver likaså att förstärkningen av kunskap bör uppnås med användningen av det minimala antalet experimentella möss. Därför erkända både fordringar på forskarvärlden att utforska intestinal GvHD kan förskotteras av genomförandet seriella mini-endoskopisk utvärderingar av tjocktarmen i experimentellt arbete kedjan att övervaka och grad intestinal GvHD i levande experimentella mus modeller, som beskrivs och validerade i protokollet presenteras här.

Protocol

De experimentella metoder som beskrivs här har godkänts av regeringen i Mittelfranken, Bayern, Tyskland.

1. GvHD induktion

1. Dag 0: Helkropps bestrålning av mottagarens möss
   1. Använda kvinnliga CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c möss som är minst 10 veckor gammal som mottagare.
   2. Väga och registrera vikten av mottagarens mössen före GvHD induktion.
      Obs: Kontrollera att mottagaren har en minimal kroppsvikt på 20 g. Start kroppsvikt kommer att fungera som referensvärdet att beräkna vikt förlust av enskilda musen under loppet av GvHD induktion och progression.
   3. Placera upp till fem möss i behållaren på den röntgen irradiator.
   4. Bestråla mössens av kroppens totala bestrålning med en engångsdos på 8 Gy av röntgen. Använda Cs¹³⁷ som en strålkälla.
2. Dag 1: Beredning av bestrålade möss med T-cell-utarmat benmärg
   OBS:Transplantation av allogen benmärgsceller, som beskrivs närmare under avsnitt 1.2, bör äga rum inom 24 h efter bestrålning. Utföra de förfaranden som beskrivs nedan i en steril vävnadsodling huva och använda filtrerade reagenser. Använd allogen CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl möss som givare för T-cell-utarmat benmärg.
   1. Euthanize CD45.1/Ly5.1 B6. SJL möss som kommer att donera allogen benmärgsceller i enlighet med de institutionella riktlinjerna, 12-24 h efter bestrålning av de mottagande BALB/c-möss. För detta, söva den CD45.1/Ly5.1 B6. SJL möss vid inandning av 5% isofluran. Fortsätta med isofluran exponering under 1 min efter andning gripandet och bekräfta dödshjälp genom cervikal dislokation.
   2. Desinficera den päls och hud av musen grundligt med 70% etanol.
   3. Placera musen på en ren arbetar slida så att musen är i en utsatt position, med dess bakkvartsparter inför experimenter. Lyft pälsen på akilleshäl med spetsen på en Semken pincett med en längd på 13 cm och tandad böjda tips. Incisionsfilm huden mellan Tången och hälen med härdade 8,5 cm fin sax med raka tips.
   4. Förlänga snittet cranially (dvs från hälen över det nedre benet och låret till hip regionen). Ta bort hud och päls från bakbenen med hjälp av tången.
   5. Utför samma procedur på den andra bakbenen.
   6. Ta bort bakbenen genom att skära genom de intilliggande höftleder.
   7. Kapa bort bakre tassarna. Skär genom knäleden. Lagra låret och skaft av varje grupp i en 92 mm petriskål fylld med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning på is bakbenen.
   8. Ren noggrant lårben och skenben ben genom att ta bort så mycket muskelmassa som möjligt från varje lår och skaft. Överföra lårben och skenben ben till en 50 mL tub fylld med steril RPMI 1640 medium och placera det på blöt is tills alla skenbenet och lårbenet ben som samlats in i steg 1.2.7 städas från muskelvävnad.
   9. Att isolera benmärgen, överföra ett lårbenet eller skenbenet ben åt gången (som har rengjorts som beskrivs i steg 1.2.8) från 50 mL röret till en petriskål (med en diameter på 92 mm) fylld med RPMI 1640 medium. Skär av ändarna på lårbenet eller skenbenet med en skalpell för att komma åt hålighet i benet som innehåller benmärgen.
   10. Förbereda en 50 mL samling tub 5 ml RPMI 1640 medium. Infoga en 26 G nål bifogas en 1 mL spruta fylld med 1 mL RPMI 1640 medium i ben kaviteten och spola benmärgen ur hålrummet i samling röret genom att trycka på kolven.
   11. Upprepa steg 1.2.10 tills benet visas ljusa och glänsande (dvs ben hålrummet saknar synligt rödaktig benmärg). Kassera den tomma ben.
   12. Upprepa steg 1.2.9 - 1.2.11, använder alla lårben och skenben ben från steg 1.2.8, och samla alla återvunna benmärgen bitar i samma 50 mL samling röret från steg 1.2.10. Håll samling röret på våt is tills alla ben från steg 1.2.8 har bearbetats med detta.
   13. Skapa en enskild cell suspension av mjukt pipettering spolas, smulig benmärgen bitar upp och ner. Filtrera benmärgen encelliga suspensionen genom en 40 µm mesh skärmen cell SIL placeras på en ny tub 50 mL samling.
   14. Centrifugera 50 mL samling röret med benmärg encelliga suspension på 450 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
   15. Återsuspendera pelleten i 5 mL ACK lyseringslösning buffert (1 mM Na₂EDTA 10 mM KHCO₃144 mM NH₄Cl; pH 7,2) för röd blod cell Lys. Inkubera cellsuspensionen i 3 min i rumstemperatur. Efteråt, omedelbart lägga till 10 mL PBS lösning till cellsuspension.
   16. Centrifugera fjädringen på 450 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 2 mL PBS lösning.
   17. Räkna de benmärgsceller, använder en hemocytometer. Bevara en alikvot av 6 x 10⁶ celler för flödescytometri Flödesanalys att kontrollera renhet av cellerna efter cell rening (se steg 1.2.20).
   18. För utarmning av T-celler från benmärgen encelliga suspensionen, använda ett kommersiellt tillgängliga cell rening kit. Magnetiskt bryter CD90.2⁺ celler (dvs, lymfocyter) från de totala benmärgsceller, efter tillverkarens protokollet.
   19. Räkna de T-cell-utarmat benmärgsceller som isolerats enligt beskrivningen i steg 1.2.18, med hjälp av en hemocytometer. Bevara en alikvot av 1 x 10⁶ celler för flödescytometri Flödesanalys utföras senare som beskrivs i steg 1.2.20.
       Obs: På genomsnittet cellen avkastningen härrör från en givare mus är vanligtvis från 2 x 10⁷ till 3,4 x 10⁷ T-cell-utarmat benmärgsceller.
   20. Bekräfta en framgångsrik T-cells uttömning av flödescytometri. Fläcken 1 x 10⁶ celler, bevarade från steg 1.2.17 (benmärgsceller innan magnetiska cellseparation) och 1.2.19 (T-cell-utarmat benmärgsceller efter magnetiska cellseparation), med följande antikroppar: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), () α-CD4 GK1.5), och α-CD8α (53-6,7). Använd de återstående cellerna från steg 1.2.17 som ofärgade kontroll och för singel-färgning kontroller, för att ställa in flödescytometer.
       1. Överföra 1 x 10⁶ celler från varje prov till en brunn av en plattan med 96 brunnar med en V-botten för att utföra den flöde flödescytometrisk färgning förfarande.
       2. Snurra ner cellerna inom plattan med 96 brunnar (steg 1.2.20.1) på 450 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 µL av FACS buffert (PBS kompletteras med 3% filtrerat bovint serum).
       3. Centrifugera cellerna inom plattan med 96 brunnar på 450 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
       4. Lägga till en lämplig mängd antikroppen val (jämför med steg 1.2.20) i proverna för enda färgning i 100 µL av FACS buffert.
       5. Förbered en blandning av alla antikroppar (master mix) som innehåller lämpliga mängder tillräckligt att separat färga de benmärgen cell alikvoter bevarade från föregående (se steg 1.2.17) och efter (se steg 1.2.19) magnetiska T-cells uttömning. Tillsätt 100 µL av huvudmixen till båda alikvoter.
       6. Tillsätt endast 100 µL av FACS buffert ofärgade.
       7. Inkubera cellerna inom plattan med 96 brunnar i 20 min vid 4 ° C i mörker.
       8. Tillsätt 100 µL av FACS buffert och centrifugera cellerna inom plattan med 96 brunnar på 450 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 µL av FACS buffert.
       9. Centrifugera cellerna på 450 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 250 µL av FACS buffert.
       10. Överföra proverna till ett 5 mL polystyren runda-botten rör och analysera dem med ett flöde cytometer instrument som kan upptäcka de fluorescerande molekyler som användes för att märka de antikroppar som anställd att karakterisera cell proverna (se steg 1.2.20).
       11. Jämför cell sammansättning från före och efter den magnetiska cellseparation.
           Obs: En renhet på cirka 95% CD45.1⁺CD3^– (dvs. T-cell-utarmat benmärg) celler inom levande porten vanligtvis uppnås.
   21. Tvätta de T-cell-utarmat benmärgen cellsuspensioner 2 x med PBS lösning (450 x g under 5 minuter vid 4 ° C) och, slutligen, att resuspendera cellerna i PBS lösning, justering av cellkoncentrationen till 5 x 10⁷ celler/mL. Hålla cellerna på våt is tills injektionen.
   22. Injicera T-cell-utarmat benmärgsceller i mottagarens möss, som bestrålades dagen innan (se avsnitt 1.1).
       1. Placera den experimentella mus i en läckagesäker kammare och inducera anestesi vid inandning av upp till 4% isofluran, tills musen är medvetslös. Bekräfta analgesi och medvetslöshet genom provning av förlusten av den rätande reflexen och den påföljande förlusten av pedalen återkalla reflex.
       2. Injicera 5 x 10⁶ T-cell-utarmat benmärgsceller (dvs. 100 µL av 5 x 10⁷ celler/mL) som innehåller PBS-lösning med en 1 mL spruta försedd med en 30 G nål intravenöst i retrobulbär utrymme som innehåller den venösa sinus.
3. Dag 2: Överföring av T-celler
   Obs: Utföra beskrivs procedurerna nedan i en steril vävnadsodling huva och använda filtrerade reagenser. Använda CD45.2 C57Bl/6 (vildtyp; WT) möss som givare för alloreactive T celler. Användningen av congenic markör system tillåter distinguishability mellan mottagaren (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c möss) och givare hematopoetiska celltyper (benmärgsceller: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. SJL möss; allogena T-celler: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 möss).
   1. Euthanize C57Bl/6 möss i enlighet med tillämpliga riktlinjer för institutionella och myndigheter. Därför, söva möss genom inhalation med en koncentration av 5% isofluran. Fortsätt isofluran exponeringen till 1 min efter andning gripandet och bekräfta dödshjälp genom cervikal dislokation. Desinficera den päls och hud av musen grundligt med 70% etanol.
   2. Placera en sil med en 40 µm mesh skärm på en 50 mL samling tub. Ta bort mjälten och placera den på Silen.
   3. Med en sprutkolven, finfördela mjälte i Silen. Tvätta sil och sprutans kolv med PBS att samla alla splenocytes.
   4. Centrifugera cellerna inom 50 mL samling röret på 450 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
   5. Återsuspendera splenocytes i 3 mL ACK lyseringslösning buffert att lysera röda blodkroppar. Inkubera cellsuspensionen för 3 min. efteråt, tillsätt 10 mL PBS och centrifugera cellerna vid 450 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera splenocytes i PBS.
   6. Räkna mjälte cellerna, med hjälp av en hemocytometer. Avleda en alikvot av 6 x 10⁶ celler för flödescytometri Flödesanalys, att utvärdera omfattningen av rening i steg 1.3.9.
   7. För en total CD3⁺ T-cell isolering från totalt splenocytes, använda ett kommersiellt tillgängliga cell rening kit. Isolera de mjälten T-celler, efter tillverkarens protokollet.
   8. Räkna mjälten CD3⁺ T celler isolerade som beskrivs i steg 1.3.7, använder en hemocytometer. Bevara en alikvot av 1 x 10⁶ T celler för flödescytometri Flödesanalys.
      Obs: Den genomsnittliga avkastningen av mjälten T cells per givare mus isoleras genom magnetisk separation cellområden från 1,3 x 10⁷ 2 x 10⁷ celler.
   9. Bekräfta framgången för T-cell isolering av flödescytometri. För en detaljerad beskrivning av protokollet färgning, konferera och följ steg 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Fläcken 1 x 10⁶ splenocytes steg 1.3.6 (innan den magnetiska cellseparation) och 1.3.8 (efter magnetiska cellseparation) med följande antikroppar: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) och α-CD8α (53-6,7).
      2. Använd de resterande cellerna från steg 1.3.6 som ofärgade kontroll och för enstaka färgning med respektive antikropparna, för att ställa in flödescytometer.
      3. Jämför cell sammansättning före och efter magnetiska cellseparation.
         Obs: En renhet på ≥ 95% av CD45.2⁺CD3⁺ T celler inom lymfocyter levande grinden bör vara fulländad.
   10. Tvätta T cells 2 x med PBS (450 x g under 5 minuter vid 4 ° C) och, slutligen, att resuspendera cellerna i PBS lösning, justering av cellkoncentrationen till 7 x 10⁶ celler/mL. Hålla cellerna på is tills injektionen.
   11. Injicera alloreactive, mjälten T-celler (se steg 1.3.10) i bestrålade BALB/c-möss som tidigare fått CD45.1⁺ T-cell-utarmat benmärgsceller (se steg 1.2.22).
       1. Inducera anestesi genom att placera experimentella musen i en läckagesäker kammare där den utsätts för upp till 4% isofluran tills det förlorar sitt medvetande. Bekräfta analgesi och medvetslöshet genom provning av förlusten av den rätande reflexen och den påföljande förlusten av pedalen återkalla reflex.
       2. Injicera 0,7 x 10⁶ alloreactive CD3⁺ T celler med en 1 mL spruta försedd med en 30 G nål   (dvs., 100 µL av 7 x 10⁶ celler/mL) som innehåller PBS lösning (se steg 1.3.10), intravenöst i retrobulbär utrymme av möss, att framkalla GvHD. tätningstyp dessa möss som den experimentella gruppen.
       3. Injicera en annan grupp av möss med 100 µL av PBS ensam, intravenöst i retrobulbär utrymmet och tätningstyp denna grupp som kontrollgruppen, därefter kallas ”no-T-cell-transplanterade (inte) möss”.

2. bedömning av systemisk GvHD

Obs: Utföra den här proceduren i en semi sterila kring i en testrummet licensierade och utrustade för att hantera levande möss inom djuranläggningen.

1. Följa det kliniska förloppet vid GvHD i enskilda möss; specifikt, bedöma och poäng de experimentella möss 3 x per vecka för förekomst av kliniska GvHD symtom, baserat på ett poängsystem beskrivs nedan och anpassas från ett poängsystem som fastställts tidigare av Cook et al.⁶.
   1. Väga varje mus individuellt, vikten och beräkna särskilda viktminskning med hänvisning till den kroppsvikt som bestämdes före start av försöket (motsvarande 100%) på dag 0 (steg 1.1.2). Betyg en viktminskning på mindre än 10% av start vikt med grade 0, en viktminskning mellan 10% och 25% med grad 1 och en viktminskning på mer än 25% med grad 3.
   2. Poäng aktivitetsnivån i varje mus, diskriminerande möss med en normal aktivitetsnivå (Poäng = 0) från möss med en måttligt minskad aktivitetsnivå (poäng = 1) och möss med stationärt beteende om de inte är externt stimuleras (Poäng = 2).
   3. Poäng päls konsistens, därmed diskriminera en normal, glänsande och vill päls (Poäng = 0) från en måttligt ruggig päls (poäng = 1) och förekomsten av kala fläckar (Poäng = 2).
   4. Poäng hudens struktur, diskriminera normal hud (Poäng = 0) från sporadiska fläckar av skalning huden (t.ex. vid svans och tassar) (poäng = 1) och uppenbara skalning och öm hudområden (Poäng = 2).
   5. Analysera konsekvens av utsöndrade pall fraktioner. Poäng pall med en normal (dvs, hård konsistens) med grad 0, pall med deformerbar och mjuk avföring med grad 1 och pall utan någon konsekvens och därmed med svår diarré med årskurs 2.
   6. Summera alla separat skårade parametrar till en maximal klinisk score 12 per mus.
2. Överväga att utvärdera kriterierna om upphörande experimentet på grund av nuvarande sjukdom allvarlighetsgraden av enskilda musen, enligt tillämpa institutionella riktlinjer och auktoriserad djur protokoll.

3. bedömning av Intestinal GvHD

1. Poängsättning av GvHD-relaterade lesioner av mini endoskopi av regionen distala kolorektal
   OBS:Utföra detta i en semisterile omgivning i en experimentell rum licensierade och utrustade för att hantera levande möss inom djuranläggningen. Använd en mini-endoskopisk arbetsstation som är godkänd för användning av små djur.
   1. Förbereda endoskopisk enheten genom att täcka teleskopet med (1,9 mm i diameter) och en längd av 10 cm med endoskopisk undersökning slida. Rengör och sterilisera endoskop med vatten och etanol.
   2. Slå på datorn, justerbar xenon ljuskällan och kameramodulen, och ställa in fokus på ett sätt att objekt nära linsen ger en tydlig bild.
   3. Anslut luftpumpen till endoskopisk slida. Att visualisera luftströmmen, doppa spetsen av endoskopet i en bägare glass fylld med vatten. Reglera luftströmmen genom att justera ventilen mellan luftpumpen och endoskopisk slida. Justera den till en långsam, konstant luftström, reflekteras av några kontinuerligt stigande bubblor.
   4. Placera en mus i en läckagesäker kammare. Inducera anestesi vid inandning av upp till 4% isofluran tills musen är medvetslös. Bekräfta analgesi och en frånvarande stat av reflexer genom att testa förlusten av den rätande reflexen och den påföljande förlusten av pedalen återkalla reflex.
   5. Använd en lämplig veterinär anestesi maskin i enlighet med protokollet djur används. Flytta musen från kammaren till arbetsytan koloskopi. Här arbetar position sövda musen, med dess näsa i den noskon (som är ansluten till instrumentet anestesi), på en ren slida så att musen är i en utsatt position, inför experimenter med dess bakkvartsparter.
   6. För att bibehålla anestesi under förfarandet för koloskopi, minska isofluran koncentrationen till cirka 2%. Övervaka musens respiration och svar på stimulering under koloskopi och justera isofluran koncentration på spridare om det behövs. Täcka musens ögon med salva att hindra dem från att bli torr.
   7. Styra effekten av anestesi genom att nypa mellan tårna på musen. I fall av frånvarande reaktivitet, Fortsätt till steg 3.1.8.
   8. Lyft svansen precis ovanför svansen roten med ena handen och försiktigt in endoskopet, placerad i andra hand, via anus i ändtarmen.
   9. Medan luftströmmen blåses kolorektal lumen, långsamt och försiktigt flytta endoskopet framåt i aboral riktning.
   10. Placera endoskopet i mitten colonic lumen och behålla denna position för att minimera kontakt med kolon väggen och undvika att göra repor, djupare vägg-skador (t.ex. leder till blödning), eller ens vägg perforation (se steg 3.1.17) . Kontrollera detta steg genom att titta permanent på videoströmmen (d.v.s. under konstant visualisering av kolon facket).
   11. Om avföring tygla vyn, ta bort endoskopet och utföra ett lavemang rektalt spolning med upp till 2 mL koksaltlösning, med hjälp av en mjuk Pasteur-pipett. Använda som lite vätska som möjligt, för att förhindra en oavsiktlig utspädning av avföring och andra sekundära effekter som negativt påverkar egenskaperna hos slemhinneepitel och, slutligen, scoring resultaten.
   12. Försök att regelbundet ståndpunkt endoskopet vid en definierad (dvs., distinkta) anatomiska område inom distala tjocktarmen att standardisera poängsättning av kolon inflammation och för att optimera jämförbarheten av scoring resultat mellan möss och över experiment.
       Obs: Normalt, med det stela endoskopet, kan ett maximalt djup av 4 cm nås via rektal rutten. Mellan 2 och 4 cm aborally, förvandlas kolon regelbundet till en fotled som inte kan skickas med den styva colonoscope. Använda kolon regionen distalt intill fotled som standard scoring plats.
   13. Börja spela videoströmmen och börja med poängsättning av inflammation.
   14. Utvärdera GvHD-relaterade inflammation i tjocktarmen genom poängsättning parametrarna förklaras och skildras i tabell 1 och figur 3.
       1. Flytta endoskopet vid scoring plats försiktigt och lite rygg - och framåt för att bedöma de olika parametrarna.
       2. Bedöma parametern ”genomskinlighet”, samt ”pall konsekvens”, genom att placera endoskopet i ett bredare avstånd i förhållande till kolon väggen.
       3. Bedöma parametrar ”kornighet” och ”vaskularitet” genom att placera endoskopet i nära närhet till kolon väggen. För denna uppgift, noggrant tillämpa väl doserade spänning i kolon väggen med spetsen av endoskopet.
   15. Efter avslutad scoring processen, stoppa inspelningen.
       Obs: Efteråt, kan det inspelade videoklippet användas totalt eller används för att generera representativa bilder (dvs skärmdumpar) av mini-endoskopiskt bedömt kriterier totalt sett bidrar till colonic inflammation.
   16. Ta försiktigt bort endoskopet.
   17. Avbryta isofluran exposition genom att flytta musen till en separat bur där den utsätts för luft. Värma musen med ett rött ljus lampa och observera musen tills det återhämtar sig från bedövningsmedlet och återfår fullt medvetande.
       Obs: På grund av luft inflationen av tjocktarmen under endoskopi visas buken regionen av musen puffat upp direkt efteråt. Även detta är normalt och av övergående natur, kan långvarig tecken på massiv och även progressiv inflation av buken och bristande återhämtning av musen tyda på en oavsiktlig perforation av tjocktarmen (i detta fall, den mus behöver bli euthanized (omedelbart).
   18. Vid fullständig återhämtning, Placera musen tillbaka i sin respektive bur.
   19. Valfritt metod: det är också möjligt att ta Visa-guidad vävnadsbiopsier. Ta följande steg.
       Obs: Koloskopi utförs på samma sätt som beskrivs i steg 3.1.1 - 3.1.18, med följande ändringar.
       1. I steget 3.1.1 Använd en endoskopisk undersökning skidan med en inbyggd arbetskanal, istället för en enkel undersökning slida utan fungerande kanaler, för att täcka teleskopet. Införa en biopsi tången i kanalen arbeta tills dess spets syns bara framför endoskopet på videoskärmen eftersom detta i hög grad förhindrar oavsiktlig skada till tarmen.
       2. Fortsätt med steg 3.1.2 - 3.1.11. För in endoskopet tjocktarmen och tryck den försiktigt framåt till platsen av intresse.
       3. Anställa hjälp av en andra försöksledaren för uppgiften att colonic vävnadsbiopsier. Be den andra försöksledaren att navigera spetsen av biopsi tången till regionen colonic val genom att trycka tången inom kanalen arbeta långsamt fram tills käftarna på tången kan öppnas. Ständigt se videoströmmen under proceduren för att minimera risken för skadade kolon väggen.
       4. Återställa ett kolon väggen vävnadsprov genom att försiktigt öppna och stänga käftarna på biopsi tången.
          Obs: Gör detta med försiktighet för att förhindra perforeringen av kolon väggen. I sällsynta fall av en colonic perforation, omedelbart offra drabbade musen genom att tillämpa mätningar i enlighet med anvisningar och under kontinuerlig förvaltning av bedövningsmedel.
       5. Dra tillbaka och ta bort stängda tången ur arbetande kanal. Ta bort preparatet från käftar biopsi tången genom doppning och skaka försiktigt öppnade tången i steril PBS lösning. Efteråt, välja korrekt lagringsförhållanden för vävnadsprov, i enlighet med de planerade nedströms analyserna. Efter desinfektion med 70% etanol, kan tången återanvändas för att vidta ytterligare biopsier.
       6. Efter att ha tagit biopsier, ta bort endoskopet och avsluta koloskopi enligt beskrivningen i steg 3.1.16 - 3.1.18.
2. Histopatologisk analys
   1. Mellan dagarna 26 och 30 efter röntgen bestrålning, eutanasi allo-HCT mottagarens möss i enlighet med tillämpningen av institutionella riktlinjer och myndigheter. För detta, söva möss vid inandning av 5% isofluran. Fortsätta med isofluran exponeringen för 1 min efter andning gripandet och bekräfta dödshjälp genom cervikal dislokation. Grundligt desinficera päls och hud av musen med 70% etanol.
   2. Öppna bukhålan och tar bort tjocktarmen. Överföra den till en petriskål (med en diameter på 92 mm) med PBS.
   3. Fyll en 5 mL dispenser tips med PBS. Med hjälp av en Semken pincett med en längd på 13 cm och tandad böjda tips, slip den distala delen av kolon (ca 5 mm) över toppen av dispenser spetsen. Försiktigt fixa tjocktarmen med hjälp av tången på dispenser spetsen och spola tjocktarmen med PBS genom att trycka ner kolven av dispenser spetsen ta bort avföring från tarmen.
   4. Klipp ut ett kolon segment som ligger ca 5 mm från anus, med hjälp av en skalpell.
   5. Fixa opererande gut preparatet i 4,5% formaldehyd över natten. Innan bädda in det i paraffin, placera vävnaden i upprätt läge.
   6. Snitt 3 µm tvärsnitt av paraffin-inbäddat kolon vävnad och färga dem med hematoxylin och eosin (han), använder standard färgprotokollen.
   7. Förbereda han-färgat tvärsnitt av kolon vävnadsprover.
   8. Anpassad från matrisen scoring rapporteras av Kaplan et al.¹², histopatologiskt Poäng den inflammatoriska aktiviteten semiquantitatively, med Poäng från 0-3: ingen inflammation (Poäng = 0), mild inflammation (poäng = 1), måttlig inflammation (Poäng = 2), och svår inflammation (poäng = 3).
      Obs: Idealiskt, anställa för denna uppgift sakkunskapen hos en patolog som är upplevt i utvärderingen av murina intestinal GvHD och förblindade till arten av den experimentella och kontrollgrupper.

Representative Results

Det nuvarande protokollet, som beskriver den mini-endoskopisk utvärderingen av intestinal GvHD-associerade lesioner av distala tjocktarmen, har fastställts och godkänts i möss som tidigare utsatts för systemisk induktion av en svår akut GvHD modell. I denna studie använde vi en MHC klass jag helt felaktigt modellsystem som BALB/c möss var dödligt bestrålade, följt av transplantation av T-cell-utarmat allogen benmärg och^{av GvHD-inducerande alloreactive C57BL/6 CD3 administration +} T-lymfocyter. T-cell-utarmat benmärgen och mjälten T celler för GvHD induktion var renas genom magnetisk separering. Renhet av dessa cellpopulationer bestämdes av flödescytometri och representativa resultat av reningsprocessen visas i figur 1visar en tillräcklig uttömning av T-celler från totala benmärgsceller och en konsekvent anrikning av mjälte-derived CD3⁺ T-celler före överföringen till tidigare bestrålade möss. Det kliniska förloppet visas i figur 2 visar reproducibly robust induktionen av den kliniska systemiska GvHD fenotypen vid allo-HCT i närvaro (WT, i svart) vs. frånvaro (inte, grå) av alloreactive givare T-lymfocyter. Det poängsystem som tidigare rapporterats av Cooke et al. representerar en summa kärna där sex parametrar bedöms och graderade: body hållning, aktivitet, vikt, hud och päls konsistens och pall konsekvens⁶. Kontroll möss erfarna enda, tidigt förekommande toppen av kliniska poäng, mellan dag 5 och 10, som sågs på samma sätt hos T-cell-mottagande möss och är därför till stor del på grund av den bestrålning-associerad systemisk inflammatorisk reaktionen. Oavsett, kliniska värderingar för givare T-cell-mottagande möss började stiga tidigare, visade en högre totala topp, bara minska normalnivå tredjeplatsen initialt och sedan, i huvudsak ökade igen, kontinuerligt, under den återstående perioden av den experimentera. Sammantaget är dessa resultat i samförstånd med den tolkning som T-cell-mottagande möss visar starkare och mer progressiv tecken på systemisk GvHD jämfört inte möss.

Givare T-lymfocyter-mottagande allo-HCT möss visade olika tecken på akut orgel-relaterade och systemisk GvHD manifestationer, totalt sett leder till hög Summa betyg, medan kontroll möss saknade måttliga till svåra känslor, särskilt vid senare tidpunkter. Dock är tecken på intestinal GvHD underrepresenterade i den systemiska GvHD poängsystem, där endast bedömda gut-relaterade parametern är pall konsistens. Som visas i tabell 1, mini-endoskopiskt taxeringsbart kriterier definierades, avsedd speciellt för exakt beskrivning, scoring och gradering av intestinal GvHD-associerade lesioner, genom att anpassa kriterierna som tidigare rapporterats för utvärdering syngena kolit till ramen för alloresponse-driven kolit⁹. Figur 3 visar typiska exempel för varje enskilt kriterium, som illustrerar den typ och omfattning av intestinal GvHD-associerade lesioner, därmed visualisera matrisen gradering tillämpas under mini-endoskopisk utvärdering av distala tjocktarmen av GvHD-benägen möss vid transplantation av MHC klass jag helt felaktigt givare lymfocyter.

Figur 4 A visar att intestinal GvHD summan poäng resultat som baseras på kriterier som definieras i tabell 1 och visas i figur 2 enkelt aktivera försöksledaren att diskriminera donator lymfocyt-mottagande möss med svåra tecken av intestinala inflammation från kontroll möss som i huvudsak saknar GvHD. För att validera mini-endoskopiskt baserat betygsskalan, utfördes histopatologiska studier med hjälp av en tidigare rapporterade mikroskopiska sortering system¹². Data i figur 4B bekräfta att tjocktarmen av möss störs av GvHD-relaterade inflammation, vilket framgår av hög colonoscopic summan poäng, display på motsvarande sätt starkt histopatologiska tecken på inflammation, ges en histopatologisk Summa poäng av ≥2 efter döden. Däremot kolon vävnader av kontroll möss Visa nej (betyg 0) eller, på de flesta, mild (betyg 1) histopatologiska tecken på inflammation, i linje med den faktiska frånvaron av mini-endoskopiskt detekterbara tecken på kolit. Dessutom som visas i figur 4C, D, bedömdes korrelation studier mellan mini-endoskopiskt och histopatologiskt kolit aktivitet och systemisk GvHD noter utfördes. Ännu viktigare, visat dessa studier att mini-endoskopiskt fastställda summan noter av ≤ 3 tillförlitligt förutsäga avsaknad av mitten av-till-högre grad (dvs. ≥ 2) intestinal GvHD-associerade colonic inflammation scores erhållna från histopatologisk gradering. Slutligen, svårighetsgraden av endoskopiskt bedömda intestinal GvHD visar en korrelation med systemisk GvHD aktiviteten.

Figur 1 : Flow flödescytometrisk kvalitetsbedömning av magnetiskt renat T-cell-utarmat benmärgsceller och allogen mjälten CD3⁺ T celler. (A) utarmning av CD90.2⁺ benmärgsceller uppnås genom magnetisk separering, använda ett kommersiellt tillgängliga rening kit. Renhet av T-cell-utarmat benmärgsceller bestämdes av flödescytometri, genom färgning celler före och efter T cells uttömning med anti-CD45.1 och anti-CD3. Resultaten från en representativ experiment visas. (B), mjälten T celler var magnetiskt renat, anställa en kommersiellt tillgänglig rening kit. Renheten bestämdes av flödescytometri, jämföra frekvenserna av CD45.2 och CD3 costaining av prover som härrör från före och efter T cell isolering. Resultaten från en representativ experiment visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Kliniska förloppet vid GvHD, anställa en MHC klass jag helt felaktigt modell. För att inducera akut GvHD, var BALB/c-möss hela kroppen bestrålas på dag 0. Mössen fick T-cell-utarmat benmärgsceller 24 h senare (d1). Dag 2, möss injicerades med allogen mjälten CD3⁺ T cells (vildtyp [WT]; n = 9). Som en kontroll fick vissa möss T-cell-utarmat benmärgen ensam (inte; n = 9). Mössen utvärderades specifikt tre gånger i veckan för förekomsten och svårighetsgraden av kliniska symtom på GvHD. Data som visas representerar medelvärden ± SEM av de kliniska resultaten som erhållits från enskilda möss i den angivna gruppen från två representativa experiment. Data analyserades av tvåvägs ANOVA, följt av Bonferronis flera jämförelser posttest. p < 0,0001 ansågs betydande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Representativa bilder som illustrerar gradering exempel underliggande scoring matrisen intestinal GvHD-relaterade kolon förändringar bedöms av en mini-endoskopisk utvärdering av kolon av levande, allo-HCT-behandlade möss. För att komplettera och illustrera den detaljerade beskrivningen av systemet i tabell 1och används scoring gradering, representativa mini-endoskopisk bilder av de utvärderade allvarlighetsgrad nivåer (gradering) för alla parametrar individuellt i tjocktarmen av sövda, levande möss genomgå allo-HCT mellan dagar 26 och 30 före som beskrivs i figur 1 visas här. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : Mini-endoskopisk scoring och betygssättning av intestinal GvHD-relaterade inflammation i tjocktarmen, tillförlitligt förutsäga förekomsten av högre kvalitet kolit bedömas av histopatologiska scoring. (A) mellan dagar 26 och 29 efter induktion av GvHD som beskrivs i figur 1, en manifestation av intestinal GvHD utvärderades av mini endoskopi i levande, sövda möss. Colonic förändringar var gjorde och graderas enligt systemet för poängberäkning och gradering skildras i tabell 1 och figur 2. Representativa endoskopisk bilder av kontroll (ingen T-cell; inte) och vildtyp (WT), T-cell-mottagande möss och mini-endoskopiskt bedömda Poäng (överst) visas. (B) möss offrades 12 h efter mini-endoskopisk utvärdering, och den distala delen av kolon var bearbetas och histopatologiskt bedömas. Hematoxylin och eosin-blodiga tvärsnitt av distala tjocktarmen inflammatorisk aktivitet var graderade. Representant hematoxylin och eosin-blodiga tvärsnitt av distala tjocktarmen inga T-cell - och WT T-cell-mottagande allo-HCT-behandlade möss och den motsvarande histologi noter visas. Data i panelerna A och B analyserades av Students t-test och visas som medelvärde ± SEM. ***p < 0,0001 ansågs betydande. WT: n = 15; Inte: n = 15. Uppgifterna representerar poolade data från fyra individuella experiment. (C) ömsesidiga beroende koloskopi scoring och histologiska scoring. Data visas rutan tomter. Varje blot visar medianen (svart linje inom varje ruta), dataintervallet (min till max) och kvartiler (områden i varje ruta). WT: n = 15; Inte: n = 15. Uppgifterna representerar poolade data från fyra individuella experiment. (D) korrelation mellan koloskopi scoring och kliniska scoring. Både kontroll och vildtyps-T-cell-mottagande möss ingår i korrelationen analysen. Den heldragna linjen representerar den linjära regressionslinjen. Spearman korrelationskoefficienten (r-värdet) och p-värdet visas. WT: n = 12; Inte: n = 13. Uppgifterna representerar poolade data från tre individuella experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Poäng	0	1	2	3
Translucens av kolon väggen	Extra intestinal, inre organ (t.ex. mjälte) ordentligt synlig	Diskret minskning av synligheten för extra tarm organ på grund av mild opacitet av kolon väggen	Måttlig minskning av synligheten för extra tarm organ på grund av betydande opacitet av kolon väggen	Brist på synbarheten av extra tarm organ, dvs icke-transparenta kolon väggen
Granularitet	Slät, opåverkad slemhinnor yta utseende; colonic crypt mönster synliga	Diskreta uppruggning och kullersten utseende av slemhinneepitel	Måttlig uppruggning och kullersten utseende av slemhinneepitel	Svår uppruggning och kullersten utseende på slemhinneepitel; kudde-liknande utseende i slemhinnan
Vaskularitet	Oförändrat vaskulära mönster visar det kommunicerande nätverket av stora och små fartyg	Diskreta förändringar av vaskulära mönster; fartyg mönster verkar fray	Vissa fartyg är osynlig; diskontinuerliga fartyget nätverk	Kontakta inducerad blödning; dot-liknande mönster av fartyg
Pall konsekvens	Normala; avföringen är hård; fina trådar av slem mellan avföring och kolon väggen kan observeras	Avföringen är fortfarande formad men kan innehålla nötta kanter; deformerbara med spetsen av endoskop	Avföringen är mjuk och unshaped pallen är synbart mer lysande (högre vattenhalt)	Avföringen är lös, flytande; vattnig diarré. Avföringen kan fördelas slumpmässigt över slemhinneepitel av tjocktarmen

Tabell 1: Mini-endoskopisk scoring och betygssättning matris av intestinal GvHD-relaterade lesioner i tjocktarmen av levande allo-HCT-behandlade möss. Förändringar av endoluminal och transmural kolon morfologi i allo-HCT förbehandlats möss bedömdes av en koloskopi av rektum och distala kolon sövda, levande möss, med hjälp av en murin mini endoskopi system. Kolon lesioner klassificerades med hjälp av endoskopisk poängsystem (modifierad murina endoskopisk index kolit svårighetsgrad [MEICS]) som härleds från den ursprungliga MEICS poängsystem rapporteras av Becker et al.⁹ och anpassas till sammanhang allo-HCT. Distala kolon bedöms visuellt för förekomsten och omfattningen av följande fyra parametrar: 1. överföringen av endoskopisk ljus (genomskinlighet) genom kolon tarmväggen som förtjockning av väggen; 2. slemhinneepitel visar en kullersten utseende (granularitet) endoluminal-orienterade slemhinneepitel; 3. en förändrad vaskularisering mönster (vaskularitet); 4. endoskopiskt bedömas pall utseendet på plats (pall konsistens). Varje parameter poängsätts från 0 (inga tecken) till 3 (mest allvarlig fenotyp), lägga upp till en maximal Summa Poäng 12 per mus.

Discussion

Protokollet beskrivs metodiken för induktion och mini-endoskopisk bedömning av kolon fenotypen observerats i samband med intestinal GvHD. Det tjänar bredare syftet gör det möjligt för forskare att studera intestinal GvHD längdriktningen och noninvasivt över hela sjukdomsförloppet (dvs från uppkomsten av kolon manifestation och progression tills maximal sjukdomens aktivitet).

Det finns dock några kritiska steg och viktiga begränsningar inneboende presenteras metoder experimenter behöver vara medveten om innan du tillämpar tekniken i respektive vetenskapliga samband. Först, även om vi har framgångsrikt använt mini-endoskopiska bedömningen av intestinal GvHD-relaterade kolon lesioner i en mindre histocompatibility-felaktigt modell system¹¹, medföljande protokollet här är för närvarande endast tillämplig på MHC klass I helt inkompatibla akut GvHD modeller. Medan den MHC klass jag helt felaktigt GvHD modell är gemensamma och används ofta⁵, är det väl etablerat att egenskaper av GvHD manifestation är starkt beroende av de använda musen substrains eftersom detta påverkar starkt, till exempel den känslighet för bestrålning. Experimentella mus källan med, för instans, en varierande sammansättning av tarmens bakterieflora och används antalet överförda allogen T-celler kan dessutom kritiskt påverka den kinetik och dynamiken av intestinal GvHD manifestation¹². Ett avgörande steg är därför att noggrant testa och validera de indikerade åtgärderna för deras förmåga att framgångsrikt inducera intestinal GvHD som visas.

Angående ett framgångsrikt genomförande av levande mini-endoskopiska bedömningen av akut intestinal GvHD, vi vill betona att samtidigt hantera endoskopet är okomplicerad, kan det krävas lite träning, att minimera risken för att drabbas av de mest fruktade komplikation (dvs. att perforera tarmväggen med styv instrumentet i kombination med behovet av att air-inflate kolon). På grund av en ökad inflammation-inducerad sårbarhet och minskad flexibilitet av kolon vävnad, kan gut vägg integritet vara större risk under postradiation återhämtningsfasen (i.e.,until dag 10) och vid den fulla manifestationen av intestinala GvHD-relaterad kolit (dvs. efter cirka dag 25). Viktigt, dock har vi inte observerat signifikant ökande komplikation priser beroende på tidpunkt endoskopi, så länge endoskopet är försiktigt avancerade under tillräcklig synlighet. Däremot vi identifierat suboptimala drog dosering för att vara en riskfaktor eftersom en otillräckligt djup anestesi kan resultera i förekomsten av oönskade kroppsrörelser experimentella musen och, i följd, kolon väggen perforering händelser. Andra, den mest kritiska steget under scoring process representerar begränsningar i denna fråga på grund av oönskade närvaro av fast eller flytande (t.ex. diarré) avföring i tarmen lumen som experimenter flyttas endoskopet in scoring position. I det här fallet krävs spolning kolorektal regionen med saltlösning med flexibel plast pipett ofta. Eftersom detta förfarande skulle äventyra scoring noggrannhet och specificitet av flera parametrar (t.ex. avföring konsistens), måste denna varning noggrant dock beaktas vid poängsättningen.

Det finns flera begränsningar som begränsar tolkning och slutsatser från denna endoskopisk metod. Först inneboende till en metod som använder ett oflexibelt endoskop via rektal rutten, utvärderingar är begränsade till den sista 3-4 cm i mag-tarmkanalen (dvs, rektum och distala kolon). Som standard undantas från utvärderingen, som anger att vetenskapliga frågor med fokus på små intestinal fenotypen av GvHD inte gynnas av detta tillvägagångssätt är därför GvHD-associerade känslor av proximala kolon och även tunntarmen. För det andra, även inflammation är en av hallmark morphologic funktionerna i intestinal GvHD, ytterligare egenskaper, som en ökad apoptos andelen tarmens epitelceller och en förlust av intestinal crypt arkitektur, finns ofta och ingår i arbetsflödet histopatologiska underliggande intestinal GvHD scoring och betygssättning av patologer i allo-HCT patienter. Här, korrelerade vi begränsad mini-endoskopiskt bedömda intestinal GvHD poängen med histopatologiskt bedömda tecken på inflammation. Denna helhetssyn, kom vi till slutsatsen att colonic inflammation över ett visst tröskelvärde i colonoscopic scoring är tillförlitligt förutsäga förekomsten av måttlig till hög grad inflammation, enligt bedömning av histopatologiska efter döden analyser. Framtida studier behöver dock undersöka hur, exempelvis histopatologiskt bedömda apoptos priser avser den mini-endoskopisk totala summan noter eller till, exempelvis en av de fyra individuella parametrarna inbäddad i den summan poängen. För det tredje, medan möss lider histopatologiskt måttlig-till-hög-grade GvHD kan lätt identifieras av den endoskopiska poängsystem, möss med mer subtila tecken på tarminflammation kan missas av den beskrivna metoden, med tanke på faktumen att histopatologiska scoring visade förekomst av lindriga tecken på inflammation i gruppen inte möss genomgå allo-HCT ensam, utan transplantation av alloreactive givare lymfocyter. Biologiskt, kan detta konstaterande vara genomförbart, eftersom inte möss har varit allotransplanterad, och minimal kolit kan faktiskt återspeglar förekomsten av låga nivåer av GvHD på grund av en ofullständig avlägsnande av T-celler från benmärgen cell bråket eller rekonstitution av alloreactive T-celler från benmärgen över tid. Framtida studier måste ta itu med dessa frågor mer i detalj. Fjärde, formellt, detta protokoll fokuserar på fullt etablerade intestinal GvHD-associerad kolit. Dock som visas och tidigare publicerade, uppkomsten av kolit runt dag 15 kan upptäckas endoskopiskt och quantitated¹¹. Här, kunde GvHD-benägen möss särskiljas från inte möss där colonic fenotypen kan vara enbart på grund av kvarstående tecken på den bestrålning-inducerad vävnadsskada eller, snarare, spegel slemhinnor återhämtning svaret efter bestrålning¹¹. Framtida studier behöver dock korrelerar endoskopisk utvärderingar och sikta på detaljerade histopatologiska analyser av GvHD-benägen möss jämfört med kontroll möss vid tidigare tidpunkter.

Avslutningsvis är en intressant, bra tillägg tillämpning av endoskopisk poängsättning av intestinal GvHD användningen av endoskopisk arbetar kanalen direkt ett minimerat biopsi pincett anatomisk struktur av val i kolon. Den här funktionen ger, som ett slags inbyggd-i-alternativet, möjligheten att ta Visa-guidad vävnadsbiopsier som ytterligare kan analyseras genom en serie nedströms tekniker som histopatologi, immunofluorescens färgning och realtids PCR-analyser av gener av intresse. Framtida studier behöver dock formellt att bedöma, exempelvis histopatologiska scoring och gradering av endoskopiskt tagit biopsier är likvärdiga med histopatologiska resultat baserat på konventionellt tagna prover (dvs.från euthanized möss).

Sammantaget med detta protokoll som beskriver induktion och dess mini-endoskopisk utvärdering av intestinal GvHD, tillhandahåller vi en metodik för att utvärdera, poäng och klass intestinal GvHD i relevanta murina GvHD modellsystem allo-HCT. Endoskopiska bedömningen kan upprepas i samma mus vid flera tidpunkter över tid, eliminerande nöden till eutanasi möss för att sekventiellt bedöma GvHD-associerade Tarmvävnaden patologi (t.ex. i en terapeutisk miljö). Mini-endoskopisk scoring resultaten visat sig vara jämförbar med resultat som erhållits genom histopatologisk bedömning av intestinal inflammation i tjocktarmen och korrelerade väl med systemisk GvHD aktivitet. Detta förfarande kan dessutom kombineras med Visa-guidad biopsier via kanalen arbeta av endoskopet. I slutändan, men framtida studier har att bedöma hur långt histopatologiskt beslutsamma morfologiska egenskaper än inflammation, som ofta finns i intestinal GvHD-drabbade lesioner, avser de resultat som erhålls med denna Mini-endoskopisk bedömning och värdering strategi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456