Summary

장 이식-비교-호스트 질병 및 라이브 쥐에서 미니 내 시경 평가의 유도

Published: February 11, 2019
doi:

Summary

여기, 선물이 수용자 조 혈 줄기 세포 이식에 설명 합니다 및 원심 콜론의 반복적인 미니 내 시경 평가 존재, 특성, 그리고 라이브 내 저 승 염증의 심각도 대 한 현장에서 프로토콜 쥐 장 이식-비교-호스트 질병에서 고통.

Abstract

급성 이식-비교-호스트 질병 (GvHD) 가장 심각한 합병증을 환자 이전 수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (여 보세요-HCT) 얼굴 나타내고 빈약한 임상 결과와 자주 연결 됩니다. 예를 들어, GvHD 발현 피부의 설립된 면역 진압 치료에 일반적으로 반응 및, 따라서, 복용 하지 치명적인 코스, 존재와 용기, 중간-낮은 부분 중 특히 장 GvHD의 강도 강하게 승부를 하 고 전반적으로 급성 GvHD. 치료 옵션을 가진 환자의 생존은 본질적으로 고전 면역 진압 요원 양보만 적당 한 질병 완화 효과. 따라서, 조직 상주 면역 폭포에 대 한 상세한 지식을 장 microbiota에 변화와 stromal 응답, 그리고 장 GvHD 발병 후 사전 이벤트 및 기본 메커니즘을 이해 필요가 긴급의 병 인 혁신적인 치료 옵션을 개발 하 고. GvHD의 murine 모델 식별 하 고 기능적으로 평가 하는 분자와 상 장 GvHD 운전 경로 자주 고용 된다. 그러나, 구체적으로 모니터링 하 고 시간이 지남에 장 염증 평가 수단 본질적으로 부족 때문에 평가 하 고 급성 GvHD 학년 설립된 점수는 정기적으로 오히려 조직의 GvHD를 반영 하는 다양 한 매개 변수 구성 발현입니다. 장 GvHD의 상세한 평가를 연구 함으로써 본질적으로 경도 제외 안락사 마우스를 사용 하 여 제한 되었습니다 (즉, 운동) 주어진된 실험 조건 하에서 저 승 구획의 분석 (예를 들어, 항 체 중재 proinflammatory cytokine의 봉쇄) (즉, vivo)에서 살아있는 쥐에서. 여기에 설명 된 여 보세요 HCT 취급 생쥐의 원심 결 장의 미니 내 시경 현장 평가 수 장의 염증과 b)에서 다운스트림 분석에 대 한 조직 샘플을 수집 하는 옵션의 다양 한 측면의 상세한 거시적인 평가 a)를 관측 기간 동안 다양 한 시간 포인트. 전반적으로, 미니 내 시경 접근 전 임상 비 침 투 적인 모니터링 및 평가 장 GvHD의 주요 사전 제공.

Introduction

조 혈 악성 직접 발생 하는 조 혈 줄기 세포 격실에서와 통제, 빠르게 진행, 그리고 심각한 면역 중재 장애는 종종 여 보세요-HCT1,2를 수행 하는 표시. 그러나, 전조 도움이 접목 대 종양 응답의 발생에 대 한 회계, 비록 기증자 세포는 자주 유도 및 홍보 여 보세요-HCT 받는 내 건강 한 조직 구성의 원치 않는 면역 중재 공격 이식-비교-호스트 질병3이라고 하는 프로세스. 발현 용기, 소위 장 GvHD는 심각한 형태의 정기적으로 높은 사망률1,2,4와 관련 된 급성 GvHD의 가장 무시 무시 한 합병증을 나타냅니다.

여 보세요-HCT의 전반적으로, murine 모델 식별 하 고 GvHD5병 기본 면역 중재 메커니즘 연구 귀중 한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, 운동 평가, 예를 들어, 라이브 마우스 오버시 소설 치료 개입의 유익한 효과 정기적으로에 따라 임상 GvHD의 결정 점수6. 이러한 점수 반영 하기 위해 적당 한 동안, 예를 들어, 전체 질병 부담 (즉, 조직의 GvHD), 임상 점수 부족 감도 안정적으로 거울 기관 특정 발현을 (예:, 에). 따라서, 예를 들어 이러한 시스템을 일반적으로 점수를 기반으로 하는 특정된 치료 개입의 창 자-보호 효과 대해 결론, 짧은을.

소설 전신의 발명을 통해 주요 발전에도 불구 하 고 이미징 형식 중 발광 또는 형광 유전자 마우스 모델7,8의 사용과 함께 직접 하 고 구체적으로 방법론 평가 장 라이브 쥐에서 GvHD의 형상 부족. 따라서, 다음 섹션에 설명 된 장 GvHD 표현 형의 내 시경 평가의 프로토콜 뒤에 근거는이 장애물을 극복 하는. 또한, 동기 부여는 또한 숫자를 줄이기 위해 실험 쥐 이후, 지금까지, 셀룰러, 형태학, 분자 특성의 상세한 평가 (예:, 분자 생물학 또는 histopathology) 장 GvHD의 징후는 궁극적으로 실험 마우스의 희생을 필요 했다.

우리의 기관 이전 syngeneic colitis 모델9동안 저 승 발현의 미니 내 시경 평가의 방법론에 보도 했다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 우리 세련 하 고는 colonoscopic 적응 점수 행렬 alloreactive의 이식 시 장 GvHD와 라이브 쥐에 alloresponse 기반 colitis HCT 및 기증자 세포는 MHC 클래스에서 나 완벽 하 게 일치 하지 않는 설정 . 우리는 장 GvHD 관련 저 승 병 변을 반영 하는 적당 한 4 개의 매개 변수를 확인. 또한, 우리는 쉽게 주어진된 시간에 주어진된 마우스에 장 GvHD의 심각도 대 한 독자에 게 알리는 새로운 점수 결과 어떤 단일 결정의 미세 조정 등급 수 있는 시스템을 설립. Histopathological 분석 특정 임계값 위 내 시경 점수 중간에 높은 급료 조직 염증 예측 안정적으로 확인 했다. 따라서, 미니 내 시경 평가를 일상적으로 실험 쥐의 희생을 요구 하는 표준 histopathology 작업 대신 나타내는 나타납니다. 중요 한 것은,이 프로토콜 거의 모든 주어진된 시간 지점에서 적용 될 수 있습니다 그리고 질병10,11의 과정에서 반복적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 생물 발광 종속 접근의 사용, 반면 유전자 intercrossing 수정 쥐 처럼 아무 노동 강렬 하 고 시간이 많이 소요 조치가 필요 하 고, 따라서, 방법론의 거의 모든 마우스 라인에 적용 될 수 있다 관심입니다.

여 보세요-HCT 환자 심한 장 GvHD의 해로운 임상 관점을 주어 함께 찍은 빠른 과학적 진보와 기본 면역 병 인 분자 메커니즘에 더 많은 통찰력은 절실히 필요 합니다. 마찬가지로 중요 한, 윤리적인 고려 사항 요구 지식의 이득 실험 쥐의 최소한의 사용으로 달성 되어야. 따라서, 모두 장 GvHD 탐험 연구 커뮤니티에 클레임 모니터링 하 고 라이브 실험 마우스에서 장 GvHD 학년 실험 작업 체인에 콜론의 직렬 미니 내 시경 평가 구현 하 여 고급 수 인정 모델, 설명 하 고 여기에 제시 된 프로토콜에서 검증.

Protocol

여기 설명 하는 실험 방법 Mittelfranken, 바바리아, 독일의 정부에 의해 승인 되었습니다가지고. 1. GvHD 유도 하루 0: 총 몸 방사선 조사 받는 사람 마우스의 여성 CD45.2+ H2kd 사용 하 여+ BALB/c 마우스 이상 10 주 받는 사람으로 오래 되는. 무게 하 고 GvHD 유도 전에 받는 사람 마우스의 무게를 기록 합니다.참고: 받는 ?…

Representative Results

변의 장 GvHD 관련 원심 콜론의 미니 내 시경 평가 설명 하는 현재 프로토콜 설립 이었고 심한 급성 GvHD 모델의 조직 유도 이전 대상이 쥐에. 이 연구에서는 사용 하는 완전히 모델 시스템 어떤 BALB/c에서 마우스 했다 치명적 반구, T-세포 고갈 수용자 골 수 이식에 의해와GvHD 유도 alloreactive C57BL/6 c d 3의 행정에 의해 일치 하지 않는 MHC 클래스 + T 림프 톨. T-세포 고갈 골…

Discussion

프로토콜 유도의 방법론과 장 GvHD 동안 관찰 장 형의 미니 내 시경 평가 설명 합니다. 그것은 전체 질병 과정 (즉, 저 승 표현과 최대한 질병 활동까지 진행의 발병)에서 경도 noninvasively 장 GvHD을 공부 하는 과학자의 광범위 한 용도로 사용 됩니다.

그러나, 있다 몇 가지 중요 한 단계와 중요 한 한계는 실험 각각 과학적인 문맥에 기술을 적용 하기 전에 알고 있어야 필요가 제시 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 공동 연구 센터 (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; 프로젝트 B03) (정) 하 고 (정)을 CRC 1181 (CRC-DFG, 프로젝트 B05)에 의해 지원 되었다, 모두 도이치 가운데 (DFG, 독일 연구 재단)에 의해 자금.

Materials

BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS ) Sigma-Aldrich Co. LLC. D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) Fine Science Tools 11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) Fine Science Tools 14090-09
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich Co. LLC. R8758-500ML 
Hypodermic needle (26G) B. Braun Melsungen AG 4657683
1 mL syring B. Braun Melsungen AG 9166017V
50 mL tube Sarstedt Ag & Co.KG 62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen BD Falcon 352340
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma-Aldrich Co. LLC. 11209 ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) Carl Roth GmbH & Co.KG 8043.2 ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3) Merck KGaA 1,048,540,500 ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-049-101 magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-095-130 magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) Biolegend 109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) Biolegend 100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) Biolegend 100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) Biolegend 110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) Biolegend 100714
Filtrated bovine serum  Pan Biotec P40-47500 ingredient of FACS buffer 
96-well polystyrene V-bottom plates Greiner Bio-One 651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) Falcon 352052
BD LSRFortessa II flow cytometer BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30G) BD 324826
Oxy Vet Oxymat 3 Eickemeyer oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet  Eickemeyer 213062
Plexiglass chamber  Eickemeyer 214620
Straight Forward Telescope KARL STORZ SE &Co KG 64301 AA part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath KARL STORZ SE &Co KG 61029 C part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel KARL STORZ SE &Co KG 61029 D part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps KARL STORZ SE &Co KG 61071 ZJ  part of the experimental setup for colonoscopy
 175 Watt SCB XenonLight Source KARL STORZ SE &Co KG 20132120 part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable KARL STORZ SE &Co KG 495 NL part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head KARL STORZ SE &Co KG 22220030 part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit KARL STORZ SE &Co KG 22200020 part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor Olympus OEV181H part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran AbbVie Inc.  B506
Formaldehyde solution 37 % Carl Roth GmbH & Co.KG 7398.1
5,0 mL Dispenser tip  Eppendorf AG 30089456

References

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Buchele, V., Büttner-Herold, M., Vogler, T., Neurath, M. F., Hildner, K. Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice. J. Vis. Exp. (144), e58871, doi:10.3791/58871 (2019).

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