Summary
여기, 선물이 수용자 조 혈 줄기 세포 이식에 설명 합니다 및 원심 콜론의 반복적인 미니 내 시경 평가 존재, 특성, 그리고 라이브 내 저 승 염증의 심각도 대 한 현장에서 프로토콜 쥐 장 이식-비교-호스트 질병에서 고통.
Abstract
급성 이식-비교-호스트 질병 (GvHD) 가장 심각한 합병증을 환자 이전 수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (여 보세요-HCT) 얼굴 나타내고 빈약한 임상 결과와 자주 연결 됩니다. 예를 들어, GvHD 발현 피부의 설립된 면역 진압 치료에 일반적으로 반응 및, 따라서, 복용 하지 치명적인 코스, 존재와 용기, 중간-낮은 부분 중 특히 장 GvHD의 강도 강하게 승부를 하 고 전반적으로 급성 GvHD. 치료 옵션을 가진 환자의 생존은 본질적으로 고전 면역 진압 요원 양보만 적당 한 질병 완화 효과. 따라서, 조직 상주 면역 폭포에 대 한 상세한 지식을 장 microbiota에 변화와 stromal 응답, 그리고 장 GvHD 발병 후 사전 이벤트 및 기본 메커니즘을 이해 필요가 긴급의 병 인 혁신적인 치료 옵션을 개발 하 고. GvHD의 murine 모델 식별 하 고 기능적으로 평가 하는 분자와 상 장 GvHD 운전 경로 자주 고용 된다. 그러나, 구체적으로 모니터링 하 고 시간이 지남에 장 염증 평가 수단 본질적으로 부족 때문에 평가 하 고 급성 GvHD 학년 설립된 점수는 정기적으로 오히려 조직의 GvHD를 반영 하는 다양 한 매개 변수 구성 발현입니다. 장 GvHD의 상세한 평가를 연구 함으로써 본질적으로 경도 제외 안락사 마우스를 사용 하 여 제한 되었습니다 (즉, 운동) 주어진된 실험 조건 하에서 저 승 구획의 분석 (예를 들어, 항 체 중재 proinflammatory cytokine의 봉쇄) (즉, vivo)에서 살아있는 쥐에서. 여기에 설명 된 여 보세요 HCT 취급 생쥐의 원심 결 장의 미니 내 시경 현장 평가 수 장의 염증과 b)에서 다운스트림 분석에 대 한 조직 샘플을 수집 하는 옵션의 다양 한 측면의 상세한 거시적인 평가 a)를 관측 기간 동안 다양 한 시간 포인트. 전반적으로, 미니 내 시경 접근 전 임상 비 침 투 적인 모니터링 및 평가 장 GvHD의 주요 사전 제공.
Introduction
조 혈 악성 직접 발생 하는 조 혈 줄기 세포 격실에서와 통제, 빠르게 진행, 그리고 심각한 면역 중재 장애는 종종 여 보세요-HCT1,2를 수행 하는 표시. 그러나, 전조 도움이 접목 대 종양 응답의 발생에 대 한 회계, 비록 기증자 세포는 자주 유도 및 홍보 여 보세요-HCT 받는 내 건강 한 조직 구성의 원치 않는 면역 중재 공격 이식-비교-호스트 질병3이라고 하는 프로세스. 발현 용기, 소위 장 GvHD는 심각한 형태의 정기적으로 높은 사망률1,2,4와 관련 된 급성 GvHD의 가장 무시 무시 한 합병증을 나타냅니다.
여 보세요-HCT의 전반적으로, murine 모델 식별 하 고 GvHD5병 기본 면역 중재 메커니즘 연구 귀중 한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, 운동 평가, 예를 들어, 라이브 마우스 오버시 소설 치료 개입의 유익한 효과 정기적으로에 따라 임상 GvHD의 결정 점수6. 이러한 점수 반영 하기 위해 적당 한 동안, 예를 들어, 전체 질병 부담 (즉, 조직의 GvHD), 임상 점수 부족 감도 안정적으로 거울 기관 특정 발현을 (예:, 에). 따라서, 예를 들어 이러한 시스템을 일반적으로 점수를 기반으로 하는 특정된 치료 개입의 창 자-보호 효과 대해 결론, 짧은을.
소설 전신의 발명을 통해 주요 발전에도 불구 하 고 이미징 형식 중 발광 또는 형광 유전자 마우스 모델7,8의 사용과 함께 직접 하 고 구체적으로 방법론 평가 장 라이브 쥐에서 GvHD의 형상 부족. 따라서, 다음 섹션에 설명 된 장 GvHD 표현 형의 내 시경 평가의 프로토콜 뒤에 근거는이 장애물을 극복 하는. 또한, 동기 부여는 또한 숫자를 줄이기 위해 실험 쥐 이후, 지금까지, 셀룰러, 형태학, 분자 특성의 상세한 평가 (예:, 분자 생물학 또는 histopathology) 장 GvHD의 징후는 궁극적으로 실험 마우스의 희생을 필요 했다.
우리의 기관 이전 syngeneic colitis 모델9동안 저 승 발현의 미니 내 시경 평가의 방법론에 보도 했다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 우리 세련 하 고는 colonoscopic 적응 점수 행렬 alloreactive의 이식 시 장 GvHD와 라이브 쥐에 alloresponse 기반 colitis HCT 및 기증자 세포는 MHC 클래스에서 나 완벽 하 게 일치 하지 않는 설정 . 우리는 장 GvHD 관련 저 승 병 변을 반영 하는 적당 한 4 개의 매개 변수를 확인. 또한, 우리는 쉽게 주어진된 시간에 주어진된 마우스에 장 GvHD의 심각도 대 한 독자에 게 알리는 새로운 점수 결과 어떤 단일 결정의 미세 조정 등급 수 있는 시스템을 설립. Histopathological 분석 특정 임계값 위 내 시경 점수 중간에 높은 급료 조직 염증 예측 안정적으로 확인 했다. 따라서, 미니 내 시경 평가를 일상적으로 실험 쥐의 희생을 요구 하는 표준 histopathology 작업 대신 나타내는 나타납니다. 중요 한 것은,이 프로토콜 거의 모든 주어진된 시간 지점에서 적용 될 수 있습니다 그리고 질병10,11의 과정에서 반복적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 생물 발광 종속 접근의 사용, 반면 유전자 intercrossing 수정 쥐 처럼 아무 노동 강렬 하 고 시간이 많이 소요 조치가 필요 하 고, 따라서, 방법론의 거의 모든 마우스 라인에 적용 될 수 있다 관심입니다.
여 보세요-HCT 환자 심한 장 GvHD의 해로운 임상 관점을 주어 함께 찍은 빠른 과학적 진보와 기본 면역 병 인 분자 메커니즘에 더 많은 통찰력은 절실히 필요 합니다. 마찬가지로 중요 한, 윤리적인 고려 사항 요구 지식의 이득 실험 쥐의 최소한의 사용으로 달성 되어야. 따라서, 모두 장 GvHD 탐험 연구 커뮤니티에 클레임 모니터링 하 고 라이브 실험 마우스에서 장 GvHD 학년 실험 작업 체인에 콜론의 직렬 미니 내 시경 평가 구현 하 여 고급 수 인정 모델, 설명 하 고 여기에 제시 된 프로토콜에서 검증.
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Protocol
여기 설명 하는 실험 방법 Mittelfranken, 바바리아, 독일의 정부에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. GvHD 유도
- 하루 0: 총 몸 방사선 조사 받는 사람 마우스의
- 여성 CD45.2+ H2kd 사용 하 여+ BALB/c 마우스 이상 10 주 받는 사람으로 오래 되는.
- 무게 하 고 GvHD 유도 전에 받는 사람 마우스의 무게를 기록 합니다.
참고: 받는 사람이 최소한의 몸 무게 20 g의 있는지 확인 하십시오. 시작 몸 무게는 GvHD 유도 및 진행의 과정을 통해 개별 마우스의 체중 감소를 계산 하는 참조 값으로 될 것입니다. - X 선 irradiator의 컨테이너에 최대 5 개의 마우스를 놓습니다.
- 총 몸 방사선 엑스레이의 8 Gy의 단일 투여 하 여 쥐를 비추는. 방사선 소스로 Cs137 을 사용 합니다.
- T-세포 고갈 골 수와 방사능된 쥐의 제 1 일: 재구성
참고:개요 및 섹션 1.2, 상세한 수용자 골 수 세포의 이식 방사선 조사 후 24 시간 이내 일어나 야 한다. 수행 무 균 조직 문화에 아래 설명 된 절차 후드를 필터링 된 시 약을 사용 하 여. 수용자 CD45.1/Ly5.1 b 6를 사용 합니다. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl T-세포 고갈 골에 대 한 기증자로 쥐.- CD45.1/Ly5.1 b 6 안락사 기관 지침, 받는 사람 BALB/c 마우스의 방사선 조사 후 12-24 h에 따라 수용자 골 수 세포를 기부 SJL 쥐 이 위해, CD45.1/Ly5.1 b 6 anesthetize. 5 %isoflurane 흡입에 의해 SJL 쥐입니다. 호흡 마비 후 isoflurane 노출을 1 분 이상 계속 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 안락사를 확인.
- 모피와 70% 에탄올으로 깨끗이 마우스의 피부를 소독.
- 위치에 깨끗 한 마우스는 마우스 경향이 위치에는 실험을 직면 하 고 그것의 엉덩이 쪽으로 칼 집 작업. 13cm의 길이 Semken 집게의 끝 및 톱니 모양의 곡선된 팁 킬 '에서 모피를 들어올립니다. 피부는 집게와 스트레이트 팁 좋은 위를 강화 된 8.5 c m 힐 incise
- Cranially (즉, 더 낮은 다리 및 허벅지 엉덩이 지역에 발뒤꿈치)에서 절 개를 연장. 겸의 도움으로 뒷 다리에서 피부와 모피를 제거 합니다.
- 다른 뒷 다리에 동일한 절차를 수행 합니다.
- 인접 한 엉덩이 관절을 통해 절단 하 여 뒷 다리 사지를 제거 합니다.
- 멀리 뒷 발 잘라. 무릎 관절을 통해 잘라. 허벅지와 인산 염 버퍼 (PBS) 염 얼음에 가득 92 mm 페 트리 접시에 함께 모든 뒷 다리의 정강이 저장 합니다.
- 모든 허벅지와 정강이에서 가능한 많은 근육 조직을 제거 하 여 대 퇴 골과 경골 뼈를 신중 하 게 청소. 대 퇴 골과 경골 뼈와 가득 메 마른 RPMI 1640 매체 장소 단계 1.2.7에서에서 모든 경골 및 대 퇴 골 뼈 수집 될 때까지 젖은 얼음에 그것 근육 조직에서 청소는 50 mL 튜브에 전송 합니다.
- 골을 분리, 50 mL 튜브에서 (에서 설명한 단계 1.2.8으로 청소)는 한 번에 한 대 퇴 골 또는 경골 뼈를 전송 (92 m m의 직경)와 페 트리 접시 RPMI 1640 매체 가득 합니다. 대 퇴 골 또는 경골 골 수를 포함 하는 뼈의 구멍에 접근할 메스와의 끝을 잘라.
- RPMI 1640 매체의 5 mL 50 mL 수집 튜브를 준비 합니다. 뼈 구멍으로 RPMI 1640 매체의 1 mL로 가득 1 mL 주사기에 부착 된 26 G 바늘을 삽입 하 고 플런저를 밀어 컬렉션 튜브에 구멍에서 골을 플러시.
- 1.2.10 빛과 반짝이 뼈가 나타날 때까지 단계를 반복 (즉, 뼈 구멍은 가시 붉은 골 수 없는). 빈 뼈를 삭제 합니다.
- 단계 1.2.9-1.2.11, 단계의 1.2.8, 모든 대 퇴 골과 경골 뼈를 사용 하 여 반복 하 고 단계 1.2.10에서에서 모든 복구 된 골 조각 같은 50 mL 수집 튜브에 수집. 1.2.8 단계에서 모든 뼈를 따라 처리 된 때까지 젖은 얼음에 컬렉션 튜브를 유지.
- 부드럽게 아래로 얼굴이 빨 개, 부서 지기 쉬운 골 조각 pipetting으로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. 새로운 50 mL 수집 튜브에 40 µ m 메쉬 화면 셀 여과기를 통해 골 수 단일 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
- 450 x g 4 ° c.에서 5 분에 골 단일 세포 현 탁 액을 포함 하는 50 mL 컬렉션 튜브 원심 폐기는 상쾌한.
- ACK lysing 버퍼 (1 m2나 m EDTA, 10 m m KHCO3, 144 m m NH4Cl, pH 7.2) 적혈구 세포의 5 mL에 펠 릿을 resuspend. 셀 서 스 펜 션 실내 온도에 3 분 동안 품 어. 그 후, 즉시 세포 현 탁 액을 PBS 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.
- 450 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 현 탁 액을 원심 삭제는 상쾌한 고 2 ml PBS 솔루션의 셀 resuspend.
- hemocytometer를 사용 하 여 골 수 세포를 계산 합니다. 6 x 106 셀 흐름 cytometry 분석 셀 정화 후 셀의 순도 확인을 위해의 약 수를 보존 (단계 1.2.20 참조).
- 골 수 단일 세포 현 탁 액에서 T 세포의 고갈에 대 한 상용 셀 정화 키트를 사용 합니다. 자석으로 제조 업체의 프로토콜에 따라 총 골 수 세포에서 CD90.2+ 셀 (즉, 림프 톨) 고갈 합니다.
- 단계 1.2.18는 hemocytometer를 사용 하 여에서 설명한 대로 고립 되어 있는 T-세포 고갈 골 셀을 계산 합니다. 1.2.20 단계에 설명 된 대로 나중에, 수행 흐름 cytometry 분석에 대 한 1 x 106 셀의 약 수를 유지 합니다.
참고: 한 기증자 마우스에서 파생 된 평균에 셀 비중은 3.4 x 107 T 세포 고갈 골 수 세포를 2 x 107 에서 보통입니다. - Cytometry 여 성공적인 T 세포 소모를 확인 합니다. 1 x 106 세포 단계 1.2.17 (자기 세포 분리 전에 골 수 세포)와 1.2.19 (자석 세포 별거 후 T 세포 고갈 골 수 세포), 다음 항 체와 함께 단계에서 보존 얼룩: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 ( GK1.5), 및 α-CD8α (53-6.7). 사용 하 여 단계 1.2.17에서에서 나머지 셀 흠 없는 컨트롤로 단일 얼룩 컨트롤 흐름 cytometer 설정.
- 각 샘플에서 V-바닥 얼룩 절차 흐름 cytometric를 수행 하기 위해 96 잘 접시의 1 x 106 셀을 전송.
- 4 ° c.에서 5 분에 대 한 g 450 x 96 잘 접시 (단계 1.2.20.1) 내의 셀 아래로 회전 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼 (PBS 3% 보충 필터링 소 혈 청)의 100 µ L에 셀.
- 4 ° c.에서 5 분에 대 한 g 450 x 96 잘 접시 내의 셀을 원심 폐기는 상쾌한.
- FACS 버퍼의 100 µ L에서 단일 얼룩에 대 한 샘플을 선택 (단계 1.2.20와 비교)의 항 체의 적절 한 금액을 추가 합니다.
- 적절 한 금액을 별도로 사전에서 보존 하는 골 수 세포 aliquots를 얼룩에 충분 한 모든 항 체 (마스터 믹스)의 혼합물을 준비 (단계 1.2.17 참조) 후 (단계 1.2.19 참조) 자기 T 세포 소모. 두 aliquots를 마스터 믹스 100 µ L를 추가 합니다.
- 흠 없는 샘플에 FACS 버퍼의만 100 µ L를 추가 합니다.
- 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 96 잘 접시 내의 셀을 품 어.
- FACS 버퍼의 100 µ L을 추가 하 고 4 ° c.에서 5 분에 대 한 g 450 x 96 잘 접시 내의 셀을 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼의 100 µ L에 셀.
- 450 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼의 250 µ L에 셀.
- 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브에 샘플을 전송 하 고 (단계 1.2.20 참조) 셀 샘플을 특성화 하기 위해 고용 하는 항 체를 분류 하는 데 사용 된 형광 성 분자를 감지할 수 있다 교류 cytometer 악기와 함께 그들을 분석.
- 셀 구성에서 전에 그리고 자석 세포 별거 후 비교 합니다.
참고: 약 95%의 순도 CD45.1+CD3- (즉, T-세포 고갈 골) 라이브 게이트 내의 셀 일반적으로 이루어집니다.
- T 세포 고갈 골 세포 현 탁 액 2 세척 x PBS 솔루션 (450 x g 4 ° C에서 5 분 동안) 및, 마지막으로, 5 x 107 셀/mL로 세포 농도 조정 하는 PBS 솔루션에서 셀 resuspend. 주사까지 젖은 얼음에 셀을 계속.
- 했다 (참조 섹션 1.1) 전날 조사 받는 쥐로 T-세포 고갈 골 수 세포를 주사.
- 누출 방지 챔버에 실험 마우스를 놓고 최대 4%의 흡입으로 마 취 유도 isoflurane, 마우스 의식 될 때까지. Righting 반사의 손실을 테스트 하 여 진통 및 의식의 상실을 확인 하 고 페달의 후속 손실 철수 반사.
- 5 x 106 T 세포 고갈 골 셀 (즉, 100 µ L의 5 x 107 셀/mL)을 주사 PBS 솔루션 30g 바늘을 갖춘 1 mL 주사기를 사용 하 여 포함 된 정 맥 정 맥 공동을 포함 retrobulbar 공간으로.
- T 세포의 제 2 일: 전송
참고: 메 마른 조직 문화 후드에서 아래 설명 된 절차를 수행 하 고 필터링 된 시 약을 사용 하 여. CD45.2 C57Bl/6 (야생-타입;를 사용 하 여 Alloreactive T 세포에 대 한 기증자로 WT) 마우스. Congenic 마커 시스템의 사용 허용 받는 사이 distinguishability (CD45.2+ H2kd+ Balb/c 마우스) 형식과 기증자 조 혈 모 세포 (골 수 세포: CD45.1+ H2kb+ B6. SJL 쥐; 수용자의 T 세포: CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6 마우스).- 적용에 따라 C57Bl/6 마우스를 안락사 기관 지침 및 기관. 따라서, 5 %isoflurane 농도와 흡입 하 여 쥐를 anesthetize. 호흡 마비 후 1 분까지 isoflurane 노출 계속 고 안락사 자 궁 경관 탈 구 합니다. 모피와 70% 에탄올으로 깨끗이 마우스의 피부를 소독.
- 50 mL 수집 튜브에 40 µ m 메쉬 스크린 여과기를 놓습니다. 비장을 제거 하 고 스 트 레에 넣습니다.
- 주사기 플런저와 comminute는 여과기에 비장. 여과기 및 모든 splenocytes를 수집 하는 PBS와 주사기 플런저를 씻어.
- 450 x g 4 ° c.에서 5 분에 50 mL 수집 관 내의 세포를 원심 폐기는 상쾌한.
- 붉은 혈액 세포를 lyse ACK lysing 버퍼의 3 mL에는 splenocytes를 resuspend. 3 분 후, PBS의 10 mL을 추가 하 고 450 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 세포 현 탁 액을 품 어 삭제는 상쾌한 고 PBS에는 splenocytes를 resuspend.
- hemocytometer를 사용 하 여 비장 세포를 계산 합니다. 6 x 106 셀 흐름 cytometry 분석 단계 1.3.9에서에서 정화의 크기를 평가 하는 약 수 전환
- 총 c d 3에 대 한+ T-셀 상용 셀 정화 키트를 사용 하는 총 splenocytes에서 격리. 제조 업체의 프로토콜에 따라 비장 T 세포를 분리.
- 비장 CD3 계산+ T 세포 분리에 설명 된 대로 단계를 hemocytometer를 사용 하 여 1.3.7. 교류 cytometry 분석에 대 한 1 x 106 T 세포의 약 수를 유지 합니다.
참고: 비장 T의에 평균 수익률 세포 기증자 마우스에 의해 자기 세포 분리 1.3 x 10에서 격리 당 2 × 107 셀에7 . - Cytometry 여 T-세포 격리의 성공을 확인 합니다. 얼룩 프로토콜에 대 한 자세한 설명, 부여 및 단계 1.2.20.1-1.2.20.10.
- 다음 항 체와 (자석 세포 별거) 후 1 x 106 splenocytes 단계 (자기 세포 분리) 전에 1.3.6 1.3.8의 얼룩: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5), 및 α-CD8α (53-6.7).
- 교류 cytometer 설정 단계 1.3.6에서에서 나머지 셀 흠 없는 컨트롤로 및 각각 항 체와 단일 얼룩 사용 합니다.
- 셀 구성 자석 세포 별거 전후를 비교 합니다.
참고: 한 순도 ≥95 %CD45.2+CD3의+ T 림프 구 라이브 게이트 내의 셀을 달성 한다.
- 워시는 T 세포를 PBS로 2 배 (450 x g 4 ° C에서 5 분 동안) 및, 마지막으로, 7 x 106 셀/mL로 세포 농도 조정 하는 PBS 솔루션에서 셀 resuspend. 주사까지 얼음에 셀을 계속.
- Alloreactive, 비장 T 세포 (단계 1.3.10 참조) CD45.1+ T-세포 고갈 골 수 세포 (단계 1.2.22 참조) 이전 받은 비친된 BALB/c 마우스에 주사.
- 최대 4 %isoflurane의 식을 잃는 때까지 노출 되는 누출 방지 챔버에 실험 마우스를 배치 하 여 마 취를 유도. Righting 반사의 손실을 테스트 하 여 진통 및 의식의 상실을 확인 하 고 페달의 후속 손실 철수 반사.
- 0.7 x 106 alloreactive CD3+ T 주사 30g 바늘을 갖춘 1 mL 주사기를 사용 하 여 셀 (즉, 7 x 106 셀/mL의 100 µ L) PBS 솔루션을 포함 하 (단계 1.3.10 참조)는 retrobulbar에 정 맥 유도 GvHD. 생쥐의 공간 실험 그룹으로이 마우스를 명명.
- 쥐의 다른 그룹, PBS의 100 µ L retrobulbar 공간으로 정 맥 주입 그리고 이후 라는 컨트롤 그룹으로이 그룹을 명명 "아니오-T-세포-이식 마우스 (안)".
2입니다. 조직의 GvHD의 평가
참고: 라이센스 및 동물 시설 내 라이브 마우스를 처리 하기 위한 장비는 실험 룸에 준 무 균 주변에서이 절차를 수행 합니다.
-
개별 쥐; GvHD의 임상 과정을 따라 특히, 평가 하 고 점수를 아래 설명과 쿡 외.6이전 설립 득점 시스템에서 적응 점수 시스템에 따라 임상 GvHD 증상의 존재에 대 한 주 x 실험 쥐 3.
- 개별적으로 각 마우스 무게, 무게를 기록 하 고 계산 하는 날 0 (1.1.2 단계) (100% 해당) 실험의 시작 이전에 결정 했다 몸 무게에 관하여 thespecific 몸 체중 감소. 점수 등급 0, 10%와 25%, 1 학년 사이 체중 감소와 3 학년 이상 25%의 체중 감소는 시작 체중의 10%의 체중 감소.
- 각 마우스, 정상적인 활동 수준으로 차별 쥐의 활동 수준을 점수 (점수 = 0) 쥐 활동을 알맞게 감소 수준에서 (점수 = 1) 및 마우스 고정 동작 하지 않는 한 그들은 외부 자극 (점수 = 2).
- 그로 인하여 차별 일반, 빛나는, 그리고 현대적인 모피 모피 텍스처 점수 (점수 = 0) 적당히 뻗 치고 모피에서 (점수 = 1)와 대머리 반점의 존재 (점수 = 2).
- 피부 질감, 정상적인 피부를 차별 점수 (점수 = 0) (예를 들어, 꼬리와 발)에서 피부 스케일링의 산발적 인 관광 명소에서 (점수 = 1) 분명 한 스케일링 고 아픈 피부 영역 (점수 = 2).
- 분 비의 자 분수의 일관성 분석. 학년 0와 일반 (즉, 하드 일관성)와 자, 1, 학년으로 변형 하 고 부드러운 대변으로의 자 및 어떤 일관성 없이 그리고, 따라서, 급료 2와 심한 설사와 대변 점수.
- 모든 별도로 득점된 매개 변수 마우스 당 12의 최대 임상 점수를 정리해.
- 고려 하 고는 현재 질병의 심각도 수준 적용 기관 지침에 따라 개별 마우스 때문에 실험을 중단의 기준을 평가 하 고 동물 프로토콜 승인.
3입니다. 장 GvHD의 평가
- 원심 장 지역의 미니 내 시경에 의해 GvHD 관련 장애의 점수
참고:라이센스 및 동물 시설 내 라이브 마우스를 처리 하기 위한 장비는 실험 룸에 semisterile 주변에 이것을 수행 합니다. 작은 동물의 사용을 위해 승인 되는 미니 내 시경 워크스테이션을 사용 합니다.- 내 시경 검사 칼 집과 (1.9 m m의 직경)와 10 cm의 길이 망원경을 취재 하 여 내 시경 장치를 준비 합니다. 깨끗 하 고 물과 에탄올으로 내 시경 소독.
- 컴퓨터, 조정 가능한 크 세 논 광원 및 카메라 모듈에 전환 하 고 렌즈에 가까이 있는 객체 깨끗 한 이미지를 주는 방식으로 포커스를 설정 합니다.
- 내 시경 칼 집에 공기 펌프를 연결 합니다. 공기 흐름을 시각화 하는 내 시경의 끝 물으로 채워진 비 커 유리에 찍어. 공기 펌프와 내 시경 칼 집 사이의 밸브를 조정 하 여 공기 흐름을 조절 합니다. 몇 가지 지속적으로 오름차순으로 반영, 지속적인 공기 흐름을 조정 거품.
- 누출 방지 챔버에 마우스를 놓습니다. 최대 4%의 흡입으로 마 취 유도 isoflurane 마우스 의식 될 때까지. Righting 반사의 손실을 테스트 하 여 진통 및 반사의 부재 상태를 확인 하 고 페달의 후속 손실 철수 반사.
- 사용 하는 동물 프로토콜에 따라 적절 한 수의학 마 취 기계를 사용 합니다. 상공에서 시경 작업 영역 마우스를 전송. 여기 위치는 nosecone (이 마 취 악기에 연결 되어), 깨끗 한에 있는 그것의 코를 가진 마 취 마우스는 마우스 경향이 위치에 그것의 엉덩이 쪽으로 실험을 직면 하 고 칼 집 작업.
- 시경 절차 동안 마 취를 유지 하려면 isoflurane 농도를 약 2%를 줄입니다. 마우스의 호흡과는 시경 중 자극에 응답을 모니터링 하 고 필요한 경우는 기화 기에서 isoflurane 농도 조정. 마우스의 건조에서 그들을 방지 하기 위해 연 고와 함께 눈을 커버.
- 마우스의 발가락 사이 곤란 하 게 하 여 마 취의 효능을 제어 합니다. 반응성에 결 석의 경우, 3.1.8 단계를 진행 합니다.
- 한 손으로 꼬리 루트 바로 위에 꼬리를 들어올리고 조심 스럽게 항문에는 항문을 통해, 다른 한편에서 내 시경을 삽입 합니다.
- 동안 공기 흐름 웃 대 장 루멘, 천천히 그리고 주의깊게 이동 앞으로 내 시경 aboral 방향에서.
- 저 승 루멘 가운데 내 시경을 배치 하 고 저 승 벽과의 접촉을 최소화 고 흠집, 깊은 벽 관련 부상 만드는 방지 하려면이 위치를 유지 (예를 들어, 결과 출혈), 또는 심지어 벽에 구멍 뚫 기 (단계 3.1.17 참조) . 영구적으로 비디오 스트림 (즉, 아래 저 승 구획의 지속적인 시각화)를 보고 하 여이 단계를 제어 합니다.
- 대변 보기 수축, 내 시경을 제거 하 고 rectally 부드러운 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 염 분의 최대 2 mL와 함께 홍 조 하 여 관장을 수행. 최대한 작은 액체도 배설물 및 기타 보조 효과 점 막 표면 및, 궁극적으로, 채 점 결과의 특성 저하의 의도 하지 않은 희석을 사용 합니다.
- 정기적으로 내 시경에는 정의 된 위치를 보십시오 (예:, 별개) 원심 결 장 염증의 점수를 표준화 하 고 쥐과 실험을 통해 결과 득점의 comparability를 최적화 하기 위해 내 해부학 사이트.
참고: 일반적으로, 경직 된 내 시경으로 4 cm의 최대 깊이 직장 경로 통해 도달할 수 있습니다. 2, 4 cm 사이 aborally, 콜론 정기적으로 버린다 엄밀한 colonoscope로 전달 될 수 없는 굴곡. 사용 하 여 콜론 지역 distally 자리 기본 득점으로 굴곡에 인접 한. - 비디오 스트림을 기록 하 고 염증의 점수와 함께 시작을 시작 합니다.
- 콜론의 GvHD 관련 염증 매개 변수 설명 및 표 1 및 그림 3에 표시 된 채 점 하 여 평가 합니다.
- 부드럽게 자리 점수 및 약간 다시-내 시경 이동 하 고 다른 매개 변수를 평가 하기 위해 앞으로.
- 저 승 벽에 관하여 더 넓은 거리에는 내 시경을 배치 하 여 "대변 일관성" 뿐 아니라 "반투명" 매개 변수를 평가 합니다.
- 매개 변수 "단위"와 "vascularity" 저 승 벽에 가까운 근접에서 내 시경을 배치 하 여 평가 합니다. 이 작업에 대 한 내 시경의 끝에와 함께 저 승 벽에 약을 잘 복용 긴장 신중 하 게 적용 됩니다.
- 완료 되 면 채 점 과정, 녹음을 중지 합니다.
참고: 그 후, 기록 된 비디오 클립 총에서 사용 수 또는 장 염증에 기여 하는 전반적인 미니 라고 평가 기준의 대표 이미지 (즉, 스크린샷)를 생성 하는 데 사용. - 조심 스럽게 내 시경 제거.
- 주변 공기에 노출 되는 별도 케이지를 마우스를 옮겨서 isoflurane 박람회를 중단 합니다. 레드-라이트 램프와 마우스를 따뜻하게 하 고 마 취에서 회복 하 고 완전 한 의식 회복 될 때까지 마우스를 관찰.
참고: 때문에 공기는 내 시경 중 콜론의 인플레이션, 마우스의 복 부 지역 직접 나중까지 부풀어 나타날 수 있습니다. 이 정상 및 과도 자연의, 복 부의 대규모 고도 진보적인 인플레이션 및 마우스의 복구의 실패의 장기간된 표시 (이 경우, 안락사 될 필요가 있는 마우스에에서 콜론의 의도 하지 않은 천공을 나타낼 수 있습니다. 즉시). - 완전 한 복구 시 각각의 케이지에 다시 마우스를 놓습니다.
- 선택적 접근: 그것은 또한 보기 기반 조직 생 검 가능. 다음 단계를 수행.
참고: 시경 단계 3.1.1-3.1.18 다음 수정에서 설명한 대로 동일한 방식으로 수행 됩니다.- 3.1.1 단계에서 작업 채널 없이 간단한 검사 칼 집 대신 내장 작업 채널 내 시경 검사 칼을 사용 하 여 망원경을 취재. 팁 비디오 화면에 내 시경에 앞에서 그냥 볼 수 때까지이 크게 소장에 의도 하지 않은 부상 방지 때문에 생 겸 작업 채널에 소개.
- 3.1.11 3.1.2-단계를 진행 합니다. 콜론과 밀어 신중 하 게 앞으로 관심의 자리에 내 시경을 삽입 합니다.
- 저 승 조직 biopsies의 작업에 대 한 두 번째 실험의 도움을 사용 합니다. 게 집게 작업 채널 내 밀어 천천히 앞으로 집게의 턱을 열 수 있습니다 때까지 선택의 저 승 지역에 생 겸의 팁을 탐색 하는 두 번째 실험. 끊임없이 저 승 벽을 상처의 위험을 최소화 하기 위해이 절차 동안 비디오 스트림 시계.
- 신중 하 게 열고 닫는 생 겸의 문 턱에서 저 승 벽 조직 샘플을 복구 합니다.
참고: 이렇게 저 승 벽의 구멍 뚫 기를 방지 하기 위해 주의. 저 승 구멍 뚫 기의 드문 경우에, 즉시 측정 기관 지침에 따라 마 취약의 지속적인 관리를 적용 하 여 영향을 받는 마우스를 희생. - 철수 하 고 작업 채널에서 닫힌된 집게를 제거 합니다. 찍기 신중 하 게 살 균 PBS 솔루션에서 열린된 집게를 흔들어 하 여 표본 생 겸의 문 턱에서 제거 합니다. 그 후, 계획 된 다운스트림 분석에 따라 조직 샘플에 대 한 적절 한 보관 조건을 선택 합니다. 70% 에탄올으로 소독, 후는 집게 추가 biopsies을 다시 사용할 수 있습니다.
- 생 검 후, 내 시경을 제거 하 고 시경 3.1.18 3.1.16-단계에서 설명한 대로 완료 합니다.
- Histopathological 분석
- 일 26 x 선 방사선 조사 후 30 일 사이 기관 지침 및 기관 적용에 따라 여 보세요-HCT 받는 사람 마우스를 안락사. 이 위해 5 %isoflurane 흡입에 의해 쥐를 anesthetize. 호흡 마비 후 1 분 동안 isoflurane 노출 계속 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 안락사를 확인. 모피와 70% 에탄올과 마우스의 피부 소독 철저 하 게.
- 복 부 구멍 열고 콜론을 제거 합니다. PBS 가진 (92 m m의 직경)와 페 트리 접시에 그것을 전송.
- 5 mL 디스펜서 팁을 PBS 채우십시오. 와 길이가 13 cm와 톱니 모양의 곡선된 팁, 슬립 디스펜서 팁의 끝에 콜론 (약 5 m m)의 원심 부분 Semken 집게의 도움. 조심 스럽게 디스펜서 끝에 집게와 콜론을 해결 하 고 소장에서 배설물을 제거 하는 디스펜서 팁의 플런저를 눌러 PBS와 콜론을 플러시.
- 메스의 도움으로 항문에서 약 5 m m 위치한 저 승 세그먼트를 잘라.
- 밤새 4.5% 포름알데히드에 절제 직감 견본 수정. 파라핀에 그것을 포함 하기 전에 조직 수직 위치에 놓습니다.
- 컷 3 µ m 콜론 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면도 교차 하 고 표준 얼룩 프로토콜을 사용 하 여 hematoxylin와 오신 (그는), 그들을 얼룩.
- 그 스테인드 콜론 조직 샘플의 크로스 섹션을 준비 합니다.
- 0-3에서 점수와 염증 활동을 semiquantitatively, 점수 histopathologically 점수 행렬 카 플 란 외.12에 의해 보고에서 적응: 없음 염증 (점수 = 0), 가벼운 염증 (점수 = 1), 중간 염증 (점수 = 2), 그리고 심한 염증 (점수 = 3).
참고: 이상적으로,이 작업에 대 한 누가 murine 장 GvHD의 평가 경험과 실험의 특성 및 제어 그룹에 눈 멀게 하는 병리학의 전문 지식을 사용 합니다.
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Representative Results
변의 장 GvHD 관련 원심 콜론의 미니 내 시경 평가 설명 하는 현재 프로토콜 설립 이었고 심한 급성 GvHD 모델의 조직 유도 이전 대상이 쥐에. 이 연구에서는 사용 하는 완전히 모델 시스템 어떤 BALB/c에서 마우스 했다 치명적 반구, T-세포 고갈 수용자 골 수 이식에 의해와GvHD 유도 alloreactive C57BL/6 c d 3의 행정에 의해 일치 하지 않는 MHC 클래스 + T 림프 톨. T-세포 고갈 골 수 세포와 비장 T 세포 GvHD 유도 자력 분리에 의해 순화 되었다. 이러한 세포 인구의 순도, cytometry에 의해 결정 되었다 및 정화 과정의 대표적인 결과 그림 1, 총 골 수 세포에서 T 세포의 충분 한 고갈 및의 일관 된 농축에에서 표시 됩니다. 비장-파생 CD3+ T 세포 이전에 그들의 전송 전에 방사능된 쥐. 그림 2 에 표시 된 임상 과정 alloreactive 기증자 T 림프 톨의 부재 (아니, 회색) 대 여 보세요-HCT 존재 (WT, 검은색에서)에 따라 임상 조직 GvHD 표현 형의 reproducibly 강력한 유도 보여 줍니다. 외 쿡 의해 이전에 보고 된 채 점 시스템 6 매개 변수 평가 및 등급 합계 코어를 나타냅니다: 몸 무게, 자세, 활동, 피부 및 모피 텍스처 및 일관성6대변. 컨트롤 마우스 경험된 단 하나, 초기 발생의 피크 일 5와 10 사이 임상 점수는 마찬가지로 T-셀-수신 쥐에서 관찰 되었다 이며, 따라서, 방사선 관련 조직의 염증 반응 때문에 크게. 관계 없이, 임상 점수 기증자 T-셀-수신 마우스의 이전 상승 하기 시작, 처음 정점, 후 감소 정도만 더 높은 총 피크를 보여 및 다음, 기본적으로 증가, 지속적으로, 다시의 나머지 기간 동안은 실험입니다. 전반적으로, 이러한 결과 T-세포-수신 마우스 보여 강한 해석 및 하지 쥐에 비해 조직 GvHD의 진보적인 표시 계약.
기증자 T 림프 톨 받기 여 보세요-HCT 마우스 급성 기관 및 조직의 GvHD 발현, 컨트롤 마우스 나중 시간 지점에서 특히 심각한 위해 적당 한 애정 부족 동안 전반적으로 높은 합계 점수 결과의 다양 한 표시를 보여주었다. 그러나, 장 GvHD의 흔적 어디 유일한 평가 창 자 관련 매개 변수는 대변 일관성 점수 시스템, 조직의 GvHD에서 제대로 이루어지지 못해. 1 에서 같이 표, 미니 라고 평가할 기준 정의 된, 정확한 설명, 점수, 및 이전 평가 대 한 보고 기준 적응 하 여 장 GvHD 관련 장애의 등급를 위한 구체적으로 alloresponse 기반 colitis9의 맥락에 대 하 장 syngeneic 염의 그림 3 설명 유형과 장 GvHD 관련 장애의 정도 등급 매트릭스의 원심 결 장의 미니 내 시경 평가 하는 동안 적용을 시각화 함으로써 각 개별 기준에 대 한 전형적인 예 표시 됩니다. GvHD가 발생 하기 쉬운 마우스 MHC 클래스의 이식 시 나 완벽 하 게 일치 하지 않는 기증자 세포.
그림 4 A 장 GvHD 합계 점수 결과 표 1 에 정의 된 하 고 쉽게 그림 2 에 표시 기준으로 장의 심각한 징후와 기증자 림프 구-수신 쥐 차별을 실험 사용 보여줍니다 GvHD 없는 본질적으로 통제 쥐에서 염증. 미니 라고 따라 등급 시스템의 유효성을 검사 하려면 histopathological 연구는 이전에 보고 된 미세한 그레이 딩 시스템12을 사용 하 여 수행 했다. 그림 4B 의 데이터 쥐의 콜론 GvHD 관련 염증, 심각 하 게 영향을 주어는 histopathological 높은 colonoscopic 합계 점수, 염증의 디스플레이 마찬가지로 강한 histopathological 표시에 의해 입증 확인 ≥2 사후의 점수 합계. 결 장 조직의 통제 쥐의 no를 표시 하는 반면, (점수 0) 하거나, 대부분, 가벼운 (점수 1) 염증, colitis의 미니 라고 감지 표시의 가상 부재 라인의 histopathological 표시. 또한, 그림 4C, D, 간의 상관 관계 연구 미니 라고 하 고 histopathologically colitis 활동 및 평가 체계 GvHD 점수 수행 했다. 중요 한 것은, 이러한 연구는 ≤3의 미니 라고 결정된 합계 점수 안정적으로 중반-에-높은 등급 (즉, ≥2) 장 GvHD 관련 저 승 염증 점수 histopathological 등급에서 얻은의 부재를 예측 하는 설명 했다. 마지막으로, 라고 평가 장 GvHD의 심각도 체계 GvHD 활동 상관 관계를 보여 줍니다.
그림 1 : Cytometric 품질 평가 자석으로 순화 된 T-세포 고갈 골 수 세포와 비장 CD3 수용자의 흐름+ T 셀. (A) 상업적으로 이용 가능한 정화 키트를 사용 하 여과 자력 분리에 의해 달성 CD90.2+ 골 수 세포의 고갈. T-세포 고갈 골 수 세포의 순도 이전 및 안티-CD45.1 및 안티-CD3 T 세포 소모 후 세포를 얼룩이 지기에 의해 cytometry에 의해 결정 되었다. 한 대표적인 실험에서 결과 표시 됩니다. (B) 비장 T 세포 자석으로 상용 정화 키트를 채용, 순화 했다. 순도 cytometry, 비교 하는 CD45.2의 주파수에 의해 결정 되었다와 T 세포 격리 전후에서 파생 된 CD3 샘플의 costaining. 한 대표적인 실험에서 결과 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : GvHD, 완전히 모델을 일치 하지 않는 MHC 클래스 사용의 임상 과정. 급성 GvHD를 유발, BALB/c 마우스 전신 일 0에 반구 했다. 쥐 T 세포 고갈 골 셀 24 시간 후 (d1)를 받았다. 하루에 2, 쥐 수용자 비장 CD3 주사 했다+ T 세포 (야생-타입 [WT]; n = 9). 컨트롤을 받은 T-세포 고갈 골 혼자 일부 마우스 (하지; n = 9). 쥐 특별히 GvHD의 임상 증상의 심각도와 일주일에 세 번을 평가 됐다. 표시 되는 데이터의 두 대표 실험에서 나타난된 치료 그룹의 개별 생쥐에서 얻은 임상 점수 평균값 ± SEM을 나타냅니다. 데이터는 Bonferroni의 여러 비교 posttest 다음 양방향 ANOVA로 분석 되었다. p < 0.0001 중요 한으로 간주 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 대표 이미지 보여주는 등급 예 장 GvHD 관련 콜론 변경 라이브, 여 보세요 HCT 취급 생쥐의 콜론의 미니 내 시경 평가 의해 평가의 점수 행렬 기본. 보완 하 고 사용 점수 등급 표 1에 시스템의 자세한 설명, (등급)의 콜론에 개별적으로 모든 매개 변수에 대 한 계산 된 심각도의 대표적인 미니 내 시경 이미지 취, 여 보세요-HCT 26 및 그림 1 에 설명 된 대로 전에 30 일 사이 진행 하는 라이브 마우스는 여기에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 미니-내 시경 득점 하 고, 결 장 GvHD 관련 염증의 등급 안정적으로 투입할 colitis histopathological 점수에 의해 평가의 존재를 예측. (A) 일 26 및 그림 1에 설명 된 대로 GvHD의 유도 후 29, 장 GvHD의 라이브, 마 취 마우스 미니 내 시경에 의해 평가 되었다. 저 승 변경 득점 하 고 표 1 과 그림 2에 표시 된 점수 및 등급 시스템에 따라 등급이 매겨 했다. 컨트롤의 대표적인 내 시경 이미지 (없음 T 세포; 하지)와 야생-타입 (WT), T-세포-수신 마우스 및 미니 라고 평가 점수 (맨 위) 표시 됩니다. (B) 쥐 미니 내 시경 평가 후 12 h를 희생 했다 그리고 콜론의 원심 부분 처리 하 고 histopathologically 평가 했다. 원심 콜론의 크로스 섹션 hematoxylin 및 오신 스테인드의 선 동적인 활동 등급 이었다. 대표 되며 고 오신-묻은 아무 T-세포 및 WT T-셀-받는 여 보세요 HCT 취급 생쥐와 점수 표시 됩니다 해당 조직학의 원심 결 장의 교차. 학생의 t A 와 B 패널에서 데이터 분석 했다-테스트 및 평균 ± SEM.로 표시 됩니다 * * *p < 0.0001 중요 하 게 고려 되었다. WT: n = 15; 하지: n = 15. 데이터를 4 개의 개별 실험에서 풀링된 데이터를 나타냅니다. 시경 점수 및 조직학 득점의 상호 의존 (C). 데이터 상자 플롯으로 표시 됩니다. 각 오 중간값 (각 상자 내의 검은 선), (분 최대), 데이터의 범위 및 quartiles (각 상자 영역)를 표시합니다. WT: n = 15; 하지: n = 15. 데이터를 4 개의 개별 실험에서 풀링된 데이터를 나타냅니다. (D) 시경 점수와 임상 점수 간의 상관 관계. 제어 및 야생-타입 T-셀-수신 쥐 상관 관계 분석에 포함 됩니다. 실선을 선형 회귀선을 나타냅니다. Spearman 상관 계수 (r-값)과 p-값이 표시 됩니다. WT: n = 12; 하지: n = 13. 데이터를 세 개의 개별 실험에서 풀링된 데이터를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 점수 | 0 | 1 | 2 | 3 |
| 저 승 벽의 반투명 | 여분 장, 내부 장기 (예: 비장) 철저 하 게 볼 수 | 저 승 벽의 가벼운 불투명도 때문 여분 장 장기의 가시성의 개별 감소 | 저 승 벽의 상당한 불투명도 때문 여분 장 장기의 가시성의 적당 한 감소 | 여분 장 기관, 즉 비 투명 저 승 벽의 가시성의 부족 |
| 세분성 | 부드러운, 영향을 받지 않는 점 막 표면 외관; 저 승 크립 트 패턴 표시 | 점 막 표면의 개별 거칠게 하 고 조약돌 모양 | 점 막 표면의 적당 한 거칠게 하 고 조약돌 모양 | 심각한 거칠게 모양과 조약돌 점 막 표면; 점 막의 쿠션 같은 모습 |
| Vascularity | 변경 되지 않은 혈관 패턴의 크고 작은 선박 통신 네트워크를 표시 | 개별 변경의 혈관 패턴; 선박 패턴 것 프레이 | 몇몇 배는 보이지; 불연속 선박 네트워크 | 유도 출혈; 문의 혈관의 점 모양의 패턴 |
| 대변 일관성 | 일반; 대변은 하드; 점액의 벌금 스레드 배설물과 저 승 벽 사이 관찰 될 수 있다 |
대변은 아직도 형성 하지만 정렬을 가장자리; 포함 될 수 있습니다. 내 시경의 팁과 변형 | 대변은 부드럽고 형태가 이루어지지 않은 자는 눈에 띄게 더 빛나는 (더 높은 함량) |
자는 느슨한, 액체; 물 설사입니다. 자 임의로 결 장의 점 막 표면에 확산 될 수 있습니다. |
표 1: 점수 및 등급 변의 장 GvHD 관련 라이브 여 보세요 HCT 취급 생쥐의 콜론에 매트릭스 미니 시경. 여 보세요-HCT 청소용된 쥐 endoluminal 및 과거 콜론 형태학의 변경 직장의 시경 그리고 마 취, 라이브 murine 미니 내 시경 시스템을 사용 하 여 마우스의 원심 결에 의해 평가 됐다. 저 승 병 변은 원래 MEICS 베 커 외.9 에서 보고 되며이의 맥락에 맞게 시스템 점수에서 추론 하는 내 시경 채 점 시스템 (수정된 murine 내 시경의 인덱스 colitis 심각도 [MEICS])의 도움으로 분류 되었다 여 보세요-HCT입니다. 원심 결 시각적으로 존재 하 고 다음 네 개의 매개 변수의 크기에 대 한 평가: 1. 내 시경 빛 (반투명); 벽의 두껍게로 저 승 창 자 벽을 통해의 투과율 2. 점 막 표면 endoluminal 지향 점 막 표면;의 조약돌 모양 (단위)를 표시 3. 변경 된 vascularization 패턴 (vascularity); 4. 라고 평가 자 모양 제자리 (대변 일관성). 각 매개 변수는 3 (가장 심각한 표현 형), 0 (흔적)에서 득점 마우스 당 12의 최대 합계 점수까지 추가.
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Discussion
프로토콜 유도의 방법론과 장 GvHD 동안 관찰 장 형의 미니 내 시경 평가 설명 합니다. 그것은 전체 질병 과정 (즉, 저 승 표현과 최대한 질병 활동까지 진행의 발병)에서 경도 noninvasively 장 GvHD을 공부 하는 과학자의 광범위 한 용도로 사용 됩니다.
그러나, 있다 몇 가지 중요 한 단계와 중요 한 한계는 실험 각각 과학적인 문맥에 기술을 적용 하기 전에 알고 있어야 필요가 제시 방법론에 내재. 첫째, 비록 우리가 성공적으로 작은 조직 적합성 일치 하지 않는 모델 시스템11장 GvHD 관련 저 승 변의 미니 내 시경 평가 사용, 여기에 제공 된 프로토콜은 현재 MHC에 독점적으로 적용 난 완벽 하 게 일치 하지 않는 급성 GvHD 모델 클래스. 완전히 GvHD 모델을 일치 하지 않는 MHC 클래스는 일반적이 고 자주 사용5, 그것을 잘 설립이 강하게 영향, 예를 들어, 이후 GvHD 형상의 특성 사용된 마우스 substrains에 매우 의존 하는 방사선 조사에 감도입니다. 또한, 인스턴스, 전송된 수용자 T 세포의 장 microbiota 및 사용의 다양 한 구성에 대 한, 실험 마우스 소스는 속도 론 및 장 GvHD 형상12의 역학에 비판적으로 떨어질 수 있습니다. 따라서 중요 한 단계는 신중 하 게 테스트 하 고 성공적으로 같이 장 GvHD를 유발 하는 능력에 대 한 지정 된 조치를 확인.
급성 장 GvHD의 라이브 미니 내 시경 평가의 성공적인 구현에 대하여 우리는, 내 시경을 처리 하는 동안은 간단, 그것은 몇 가지 훈련, 가장 발생의 위험을 최소화 하기 위해 필요할 수 있습니다 두려워 강조 하 고 싶다 합병증 (즉, 콜론 공기 팽창 하는 필요와 함께에서 경직 된 악기와 창 자 벽을 꿰뚫기 위하여). 증가 염증 유발 취약점 및 저 승 조직의 유연성을 감소, 창 자 벽 무결성 있을 위험이 더 postradiation 복구 단계 (i.e.,until 하루 10) 장의 전체 형상에 따라 GvHD 관련 대 장 염 (즉, 후 약 25 일). 그러나 중요 한 것은,, 우리는 하지 관찰 합병증이 크게 증가 속도, 내 시경의 시간 포인트에 따라 내 시경은 부드럽게 충분 한 가시성에서 고급으로. 반면, 우리 차선 약물 주입 마 취의 부족 한 깊이 실험 마우스의 원치 않는 몸 움직임의 발생에서 발생할 수 있습니다 때문에 위험 요인이 될 확인 하 고, 연속적으로, 저 승 벽 구멍 뚫 기 이벤트. 둘째,는 실험 득점 위치에 있는 내 시경 이동 고체의 원치 않는 존재로 인해이 문제에 제한 또는 창 자 루멘에 액체 (예를 들어, 설사) 대변 채 점 과정에서 가장 중요 한 단계가 나타냅니다. 이 상황에서 유연한 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 식 염과 대 장 지역 홍 조는 종종 필요 합니다. 그러나, 때문에이 절차는 득점 정확도 및 여러 매개 변수 (예를 들어, 대변 일관성)의 특이성 타협할 수,이 경고 신중 하 게 필요 점수에 고려 되어야 합니다.
해석 및 내 시경이 접근에서 도출 하는 결론을 제한 하는 몇 가지 제한이 있다. 첫째, 고정적인 직장 경로 통해 내 시경을 사용 하는 방법론을 내장, 평가 위장 (곧은 창 자 및 원심 결 장)의 마지막 3-4 cm에 제한. 따라서, 근 위 결 장 및 작은 창도의 애정 GvHD 관련 GvHD의 작은 창 자 형에 집중 하는 과학적인 질문이이 접근에서 유익할 하지 나타내는 평가에서 제외 하는 기본적으로 있습니다. 둘째, 염증 장 GvHD의 전형적인 형태 론 적 기능 중 하나 이지만, 장 토 굴 아키텍처의 손실과 장 상피 세포의 증가 apoptosis 비율 같은 추가 특성은 종종 발견 하 고 histopathological 워크플로 기본 장 GvHD 득점 하 고 여 보세요-HCT 환자에 병리학 자에 의해 등급에 포함. 여기, 우리는 restrictedly 염증의 histopathologically 평가 표시 미니 라고 평가 장 GvHD 점수 상관. 우리 histopathological 사후 분석 하 여 평가 colonoscopic 점수에 특정 임계값 이상 저 승 염증 보통 높은 학년 염증의 존재를 예측 안정적으로 결론에 왔다이 방법을 사용. 그러나 미래 연구 방법, 예를 들어, histopathologically 평가 apoptosis 요금 관련 미니 내 시경 총 합계 점수 또는, 예를 들어, 4 개의 개별 매개 변수 중 하나에 포함 된 조사를 해야 하는, 합계 점수. 셋째, 마우스 histopathologically 보통-에-높은-학년 GvHD에서 고통을 내 시경 득점 접근 방식에 의해 쉽게 확인 될 수 있다, 하는 동안 창 자 염증의 더 미묘한 징후와 쥐 놓칠 수 있습니다 설명한 접근 방식에 의해 주어진 사실 histopathological 점수 받고 여 보세요-HCT alloreactive 기증자 세포의 이식 없이 혼자 하지 쥐의 그룹에서 염증의 가벼운 징후의 존재를 공개 했다. 생물학,이 찾는 수 있습니다 실현, 하지 마우스 allotransplanted 되었습니다, 이후 최소 colitis 실제로, T 세포는 골 수 세포 분수에서의 불완전 한 제거 또는 재구성 GvHD의 낮은 레벨의 존재를 반영 수 있습니다, 시간이 지남에 따라 골 수에서 alloreactive T 세포. 미래 연구는 좀 더 자세하게에서이 질문을 해결 하기 위해 필요 합니다. 넷째, 공식적으로,이 프로토콜 완전히 설립된 장 GvHD 관련 대 장 염에 집중 한다. 그러나, 하루 15 대 장 염의 발병 라고 검색 하11quantitated 표시 하 고 이전에 출판. 여기, GvHD가 발생 하기 쉬운 마우스 없는 마우스는 저 승 표현 형 조사11후 방사선-유도 조직 손상 또는, 오히려, 미러 점 막 복구 응답의 잔여 흔적 때문에 전적으로 수 있습니다 명확 하 게 구별 될 수 있습니다. 그러나, 미래 연구 내 시경 평가 연결 하 고 이전 시간 지점에서 제어 마우스에 비해 GvHD가 발생 하기 쉬운 마우스의 자세한 histopathological 분석을 목표로 해야 합니다.
마지막으로, 재미 있는, 유용한 추가 기능 응용 프로그램 장 GvHD의 내 시경 득점의 콜론에 선택의 해부학 구조를 최소화 생 겸 직접 내 시경 작업 채널의 사용 이다. 이 기능은, 일종의 내장에서 옵션, histopathology, 면역 형광 염색 법, 및 유전자의 실시간 PCR 분석 같은 다운스트림 기법에 의해 더 분석 될 수 있다 보기 기반 조직 생 검 걸릴 가능성 관심입니다. 그러나 미래 연구 공식적으로 예를 들어, histopathological 점수 및 라고 찍은 biopsies의 등급은 전통적으로 찍은 샘플에 따라 histopathological 결과에 해당 하는 여부를 평가 해야 하는, (즉에서 안락사 마우스)입니다.
전반적으로,이 프로토콜을 설명 하는 유도 장 GvHD의 미니 내 시경의 평가, 우리 방법론 평가, 점수, 학년 장 GvHD 여 보세요-HCT의 관련 murine GvHD 모델 시스템에서을 제공 합니다. 내 시경 평가 반복할 수 있습니다 여러 개의 시간 지점에서 동일한 마우스에서 시간이 지남에, 순차적으로 (예를 들어, 치료 설정)에서 장 GvHD 관련 조직 병리학을 평가 하기 위해 마우스를 안락사 필요가 없습니다. 미니 내 시경 채 점 결과 입증 결과 결 장의 염증의 histopathological 평가 의해 얻은 조직 GvHD 활동 잘 연관 비교 했다. 또한,이 절차 보기 유도 생 검 내 시경의 작업 채널을 통해 결합 될 수 있다. 그러나 궁극적으로,, 미래 연구 평가 해야 얼마나 장 GvHD의 영향을 받는 병 변에서 자주 발견 되는 염증, 다른 histopathologically 결정된 형태학 기능이 얻은 결과 관련 미니 내 시경 평가 그리고 접근을 점수.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 공동 연구 센터 (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; 프로젝트 B03) (정) 하 고 (정)을 CRC 1181 (CRC-DFG, 프로젝트 B05)에 의해 지원 되었다, 모두 도이치 가운데 (DFG, 독일 연구 재단)에 의해 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26 G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30 G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5.0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
References
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E.
- Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
- Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, Suppl 2 58-64 (2008).
- Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
- Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).
- Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).
- Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
- Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).
