Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

आंतों भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग और अपने लाइव चूहों में मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन की प्रेरण

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/58871
Automatic Translation
1,3, 2, 1,3, 1,3, 1,3
1Department of Internal Medicine 1, University Erlangen-Nürnberg, University Hospital Erlangen, 2Institute of Pathology, Department of Nephropathology, University Hospital Erlangen, 3Deutsches Zentrum Immuntherapie (DZI), University Hospital Erlangen

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि allogeneic टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण का वर्णन करता है और उपस्थिति, विशेषताओं, और जीने के भीतर बृहदांत्र सूजन की गंभीरता के लिए बाहर बृहदांत्र के दोहराव मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन की अनुमति देता है वर्तमान चूहों आंत्र भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग से पीड़ित ।

Abstract

तीव्र भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग (GvHD) सबसे गंभीर जटिलता का प्रतिनिधित्व करता है कि रोगियों को पहले allogeneic टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (एलो-HCT) चेहरे के दौर से गुजर रहा है और अक्सर एक गरीब नैदानिक परिणाम के साथ जुड़ा हुआ है । जबकि, उदाहरण के लिए, त्वचा की GvHD अभिव्यक्तियां आमतौर पर स्थापित प्रतिरक्षा-शमन चिकित्सा के लिए उत्तरदाई है और कर रहे हैं, इसलिए, एक घातक पाठ्यक्रम नहीं ले, उपस्थिति और आंतों GvHD की तीव्रता, विशेष रूप से मध्य के लिए पेट के निचले भागों, दृढ़ता से परिणाम और तीव्र GvHD के साथ रोगियों के समग्र अस्तित्व को प्रभावित । चिकित्सकीय विकल्प अनिवार्य रूप से केवल मध्यम रोग-प्रभाव को कम उपज क्लासिक प्रतिरक्षा शमन एजेंटों के लिए सीमित कर रहे हैं । इसलिए, ऊतक के बारे में विस्तृत ज्ञान निवासी प्रतिरक्षा झरना, आंतों microbiota में परिवर्तन, और stromal प्रतिक्रिया से पहले, पर, और आंतों GvHD शुरुआत के बाद तत्काल घटनाओं और अपने अंतर्निहित तंत्र को समझने की जरूरत है रोगजनन और अभिनव चिकित्सीय विकल्प विकसित करने के लिए । GvHD के Murine मॉडल अक्सर की पहचान करने और कार्यात्मक अणुओं और रास्ते आंत्र GvHD ड्राइविंग putatively का आकलन करने के लिए कार्यरत हैं । हालांकि, विशेष रूप से निगरानी और समय के साथ आंतों की सूजन का मूल्यांकन करने का मतलब है अनिवार्य रूप से कमी के बाद से स्थापित स्कोर का आकलन करने के लिए और तीव्र GvHD ग्रेड नियमित रूप से विभिंन मापदंडों जो बल्कि प्रणालीगत GvHD प्रतिबिंबित के शामिल है अभिव्यक्तियों. आंत्र GvHD के विस्तृत मूल्यांकन euthanized चूहों का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए प्रतिबंधित किया गया है, जिससे अनिवार्य रूप से अनुदैर्ध्य को छोड़कर (यानी, काइनेटिक) एक दी प्रयोगात्मक स्थिति के तहत कालोनी डिब्बे का विश्लेषण (जैसे, एंटीबॉडी-मध्यस्थता लाइव चूहों में एक भड़काऊ cytokine की नाकाबंदी) (यानी, vivo में). HCT-इलाज चूहों के बाहर बृहदांत्र के सीटू आकलन में मिनी-इंडोस्कोपिक यहां वर्णित एक) आंतों की सूजन और ख के विभिन्न पहलुओं का एक विस्तृत macroscopic मूल्यांकन) के लिए बहाव के विश्लेषण के लिए ऊतक के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए विकल्प की अनुमति देता है अवलोकन अवधि के दौरान विभिन्न समय अंक । कुल मिलाकर, मिनी इंडोस्कोपिक दृष्टिकोण नैदानिक इनवेसिव निगरानी और आंत्र GvHD के आकलन में एक प्रमुख अग्रिम प्रदान करता है ।

Introduction

टेम द्रोह सीधे टेम स्टेम सेल कम्पार्टमेंट और अनियंत्रित, तेजी से प्रगति, और गंभीर प्रतिरक्षा मध्यस्थता विकारों से उत्पन्न होने वाले अक्सर एलो-HCT1,2प्रदर्शन करने के लिए संकेत कर रहे हैं. हालांकि, हालांकि शकुन लाभकारी भ्रष्टाचार की घटना बनाम ट्यूमर प्रतिक्रिया के लिए लेखांकन, दाता लिम्फोसाइटों अक्सर उत्प्रेरण और एलो-HCT प्राप्तकर्ता के भीतर स्वस्थ ऊतक घटकों के एक अवांछित प्रतिरक्षा मध्यस्थता हमले को बढ़ावा देने रहे हैं , एक प्रक्रिया है कि भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग3कहा जाता है । पेट में अभिव्यक्ति, तथाकथित आंत्र GvHD, तीव्र GvHD की सबसे खतरनाक जटिलता का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिनमें से गंभीर रूपों नियमित रूप से एक उच्च मृत्यु दर1,2,4के साथ जुड़े रहे हैं ।

कुल मिलाकर, एलो-HCT के murine मॉडल5GvHD की रोगजनन अंतर्निहित प्रतिरक्षा-मध्यस्थता तंत्र की पहचान और अध्ययन करने के लिए अमूल्य औजार के रूप में उभरे हैं. हालांकि, के काइनेटिक मूल्यांकन, उदाहरण के लिए, जीवित चूहों में समय पर उपंयास चिकित्सीय हस्तक्षेप के लाभकारी प्रभाव नियमित रूप से नैदानिक GvHD स्कोर6के निर्धारण पर आधारित है । हालांकि इन स्कोरों को प्रतिबिंबित करने के लिए उपयुक्त हैं, उदाहरण के लिए, समग्र रोग बोझ (यानी, प्रणालीगत GvHD), नैदानिक स्कोर मज़बूती से शरीर के अंग-विशिष्ट अभिव्यक्तियों (जैसे, पेट में) के लिए संवेदनशीलता की कमी है । इसलिए, निष्कर्ष, उदाहरण के लिए आंत के संबंध में एक चिकित्सीय हस्तक्षेप के सुरक्षात्मक प्रभाव के साथ, कि इन स्कोरिंग सिस्टम पर आधारित है आमतौर पर कम गिर जाते हैं ।

उपंयास पूरे शरीर इमेजिंग के आविष्कार के माध्यम से प्रमुख अग्रिम के बावजूद या तो bioluminescent या फ्लोरोसेंट आनुवंशिक माउस मॉडल7,8, के उपयोग के साथ संयोजन में तरीकों को सीधे और विशेष रूप से जीना चूहों में GvHD की आंतों की अभिव्यक्ति का आकलन कमी कर रहे हैं. इसलिए, अगले खंड में वर्णित आंतों GvHD phenotype के इंडोस्कोपिक आकलन के प्रोटोकॉल के पीछे तर्क इस बाधा को दूर करने के लिए है । इसके अलावा, प्रेरणा भी प्रयोगात्मक चूहों संख्या को कम करने के बाद से है, अब तक, सेलुलर, रूपात्मक, और आणविक विशेषताओं का एक विस्तृत आकलन (जैसे, histopathology या आणविक जीवविज्ञान) आंतों GvHD के द्वारा अभिव्यक्ति अंततः प्रयोगात्मक माउस के बलिदान की आवश्यकता है ।

हमारे संस्थान पहले syngeneic कोलाइटिस मॉडल9के पाठ्यक्रम में बृहदांत्र अभिव्यक्तियों के एक मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन की कार्यप्रणाली पर सूचित किया है । प्रोटोकॉल में यहां प्रस्तुत है, हम और परिष्कृत है colonoscopic स्कोरिंग मैट्रिक्स alloresponse के लिए प्रेरित-alloreactive HCT और दाता लिम्फोसाइटों के एक MHC वर्ग में प्रत्यारोपण पर आंतों GvHD के साथ जीना चूहों में कोलाइटिस चालित मैं पूरी तरह से बेमेल सेटिंग . हम आंतों GvHD-संबंधित बृहदांत्र घावों को प्रतिबिंबित करने के लिए उपयुक्त चार मापदंडों की पहचान की । इसके अलावा, हम एक प्रणाली है कि किसी भी एक निर्धारक के ग्रेडिंग एक ठीक देखते की अनुमति देता है की स्थापना की, एक नया स्कोर है कि आसानी से आंतों GvHD की गंभीरता के बारे में एक निश्चित समय बिंदु पर दिए गए माउस में मौजूद पाठक बताते में जिसके परिणामस्वरूप । Histopathological विश्लेषण की पुष्टि की है कि एक निश्चित सीमा के ऊपर एक इंडोस्कोपिक स्कोर मज़बूती से मध्यम से उच्च ग्रेड ऊतक सूजन की भविष्यवाणी है । इसलिए, मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन सोने के मानक histopathology कि नियमित रूप से प्रयोगात्मक चूहों के बलिदान की आवश्यकता के लिए एक काम के विकल्प का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रकट होता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल वस्तुतः किसी भी समय बिंदु पर लागू किया जा सकता है और बार में रोग के दौरान किया जा सकता है10,11। इसके अलावा, bioluminescence के उपयोग पर निर्भर दृष्टिकोण के विपरीत, कोई श्रम-तीव्र और समय लेने आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों परस्पर की तरह उपाय और आवश्यक हैं, इसलिए, पद्धति वस्तुतः किसी भी माउस लाइन पर लागू किया जा सकता है ब्याज.

एक साथ लिया, HCT के हानिकारक नैदानिक परिप्रेक्ष्य गंभीर आंत्र GvHD, तेजी से वैज्ञानिक प्रगति और आणविक प्रतिरक्षा रोगजनन अंतर्निहित तंत्र में अधिक जानकारी के साथ रोगियों की तत्काल जरूरत है दिया । इसी तरह, महत्वपूर्ण, नैतिक विचारों की मांग है कि ज्ञान का लाभ प्रयोगात्मक चूहों की न्यूनतम संख्या के उपयोग के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए । इसलिए, दोनों को मांयता प्राप्त अनुसंधान आंत्र GvHD खोज समुदाय पर दावा धारावाहिक मिनी प्रयोगात्मक कार्य श्रृंखला में बृहदांत्र के इंडोस्कोपिक मूल्यांकन को लागू करने के द्वारा उंनत किया जा सकता है और निगरानी के लिए जी प्रयोगात्मक माउस में आंत्र GvHD ग्रेड मॉडल, के रूप में वर्णित है और यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में मांय ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां बताए गए प्रायोगिक तरीकों को Mittelfranken, बावरिया, जर्मनी की सरकार ने मंजूरी दे दी है ।

1. GvHD प्रेरण

  1. 0 दिन: प्राप्तकर्ता चूहों के कुल शरीर विकिरण
    1. का प्रयोग करें महिला सीडी 45.2+ H2kd+ बालब/सी चूहों कि प्राप्तकर्ताओं के रूप में कम से कम 10 सप्ताह पुराना है ।
    2. वजन और प्राप्तकर्ता चूहों के वजन GvHD प्रेरण से पहले रिकॉर्ड ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्राप्तकर्ता 20 ग्राम के एक ंयूनतम शरीर का वजन है । प्रारंभिक शरीर वजन GvHD प्रेरण और प्रगति के पाठ्यक्रम पर व्यक्तिगत माउस के वजन घटाने की गणना करने के लिए संदर्भ मूल्य के रूप में सेवा करेंगे ।
    3. एक्स-रे irradiator के कंटेनर में पाँच चूहों को रखें.
    4. विकीर्ण कुल शरीर विकिरण के द्वारा चूहों को एक्स-रे के 8 Gy की एक खुराक के साथ । एक विकिरण स्रोत के रूप में सीएस१३७ का प्रयोग करें ।
  2. 1 दिन: टी सेल के साथ विकिरणित चूहों का पुनर्गठन-अस्थि मज्जा घट
    नोट:allogeneic अस्थि मज्जा कोशिकाओं के प्रत्यारोपण, के रूप में उल्लिखित और धारा १.२ के तहत विस्तृत, विकिरण के बाद 24 घंटे के भीतर जगह ले जाना चाहिए । एक बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में नीचे वर्णित प्रक्रियाओं प्रदर्शन और फ़िल्टर किए गए एजेंट का उपयोग करें. उपयोग allogeneic सीडी 45.1/ SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl टी के लिए दाताओं के रूप में चूहों-कोशिका घट अस्थि मज्जा ।
    1. Euthanize सीडी 45.1/ SJL चूहों कि संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार allogeneic अस्थि मज्जा कोशिकाओं को दान करेंगे, प्राप्तकर्ता बालब के विकिरण के बाद 12-24 ज/ इसके लिए, cd 45.1/anesthetize 5.1 B6 । 5% isoflurane की साँस लेना द्वारा चूहों SJL. सांस लेने की गिरफ्तारी के बाद 1 मिनट से अधिक isoflurane जोखिम के साथ जारी रखें और गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।
    2. फर और ७०% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से माउस की त्वचा को संक्रमित ।
    3. माउस को एक साफ काम करने वाले म्यान पर स्थित करें ताकि माउस की प्रवण स्थिति में, उसके hindquarters का सामना करने वाले प्रयोगकर्ता के साथ हो । 13 सेमी की लंबाई और दांतेदार घुमावदार युक्तियों के साथ एक Semken संदंश की नोक के साथ दुखती ' एड़ी में फर उठाएं । Incise के बीच त्वचा को संदंश और एड़ी के साथ कठोर ८.५ सेमी ठीक कैंची के साथ सीधे सुझावों के साथ ।
    4. बढ़ाव चीरा कपाल (यानी, एड़ी से निचले पैर और जांघ पर कूल्हे क्षेत्र के लिए) । संदंश की सहायता से हिंद अंग से त्वचा और फर निकालें ।
    5. दूसरे हिंद अंग पर एक ही प्रक्रिया करते हैं ।
    6. हिंद अंगों को अगल-बगल कूल्हे के जोड़ों के माध्यम से काट कर निकालें ।
    7. दूर पीछे के पंजे काट । घुटने के जोड़ के माध्यम से कट । जांघ और हर हिंद अंग की टांग एक साथ एक ९२ mm पेट्री फॉस्फेट के साथ भरा पकवान में स्टोर-बफर खारा (पंजाब) बर्फ पर समाधान ।
    8. हर जांघ और टांग से यथासंभव अधिक मांसपेशियों के ऊतकों को निकाल कर फीमर और टिबिया हड्डियों को सावधानीपूर्वक साफ करें । एक ५० मिलीलीटर बाँझ RPMI १६४० माध्यम से भरा ट्यूब के लिए फीमर और टिबिया हड्डियों हस्तांतरण और यह गीला बर्फ पर जगह जब तक सभी टिबिया और फीमर कदम 1.2.7 में एकत्र हड्डियों मांसपेशियों के ऊतकों से साफ कर रहे हैं ।
    9. अस्थि मज्जा को अलग करने के लिए, एक समय में एक फीमर या टिबिया हड्डी हस्तांतरण (जो चरण 1.2.8 में वर्णित के रूप में साफ किया गया है) ५० मिलीलीटर ट्यूब से एक पेट्री डिश के लिए (९२ मिमी के व्यास के साथ) RPMI १६४० माध्यम से भरा । अस्थि मज्जा युक्त हड्डी की गुहा के लिए पहुँच पाने के लिए एक स्केलपेल के साथ फीमर या टिबिया के सिरों को काट.
    10. RPMI १६४० मीडियम के 5 एमएल के साथ ५० एमएल कलेक्शन ट्यूब तैयार करें । एक 26 जी सुई एक 1 मिलीलीटर RPMI १६४० मध्यम की हड्डी गुहा में एमएल के साथ भरा सिरिंज और गोताख़ोर धक्का द्वारा संग्रह ट्यूब में गुहा के बाहर अस्थि मज्जा फ्लश से जुड़ी डालें ।
    11. दोहराएँ चरण 1.2.10 जब तक हड्डी प्रकाश और चमकदार प्रकट होता है (यानी, हड्डी गुहा लाल अस्थि मज्जा से रहित दिख रहा है). खाली हड्डी को त्यागें ।
    12. दोहराएँ कदम 1.2.9-1.2.11, कदम 1.2.8 से सभी फीमर और टिबिया हड्डियों का उपयोग, और कदम 1.2.10 से ही ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में सभी बरामद अस्थि मज्जा टुकड़े इकट्ठा. गीला बर्फ पर संग्रह ट्यूब रखें जब तक कदम 1.2.8 से सभी हड्डियों तदनुसार संसाधित किया गया है ।
    13. धीरे से फ्लश, टुकड़ों में अस्थि मज्जा टुकड़े ऊपर और नीचे pipetting द्वारा एक एकल सेल निलंबन बनाएं । एक नया ५० एमएल संग्रह ट्यूब पर रखा एक ४० µm मेष स्क्रीन सेल छलनी के माध्यम से अस्थि मज्जा एकल सेल निलंबन फिल्टर ।
    14. ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० x g पर अस्थि मज्जा एकल सेल निलंबन से युक्त । supernatant को त्यागें ।
    15. ले lysing बफर के 5 मिलीलीटर में गोली resuspend (1 मिमी न2EDTA; 10 मिमी KHCO3; १४४ मिमी NH4सीएल; पीएच ७.२) लाल रक्त कोशिका lysis के लिए । कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए सेल निलंबन की मशीन । इसके बाद, तुरंत सेल सस्पेंशन के लिए पंजाब के 10 मिलीलीटर समाधान जोड़ें ।
    16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० x g पर निलंबन केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और पंजाबियों के समाधान के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड ।
    17. अस्थि मज्जा कोशिकाओं गिनती, एक hemocytometer का उपयोग कर । सेल शुद्धि के बाद कोशिकाओं की शुद्धता की जांच करने के लिए प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए 6 x 106 कोशिकाओं के एक aliquot को संरक्षित (चरण 1.2.20 देखें) ।
    18. अस्थि मज्जा एकल सेल निलंबन से टी कोशिकाओं की कमी के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल शोधन किट का उपयोग करें । चुंबकीय के कुल अस्थि मज्जा कोशिकाओं से सीडी 90.2+ कोशिकाओं (यानी, लिम्फोसाइटों) गिरेगा, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन ।
    19. टी सेल समाप्त अस्थि मज्जा कोशिकाओं है कि कदम 1.2.18 में वर्णित के रूप में अलग किया गया है गिनती, एक hemocytometer का उपयोग कर । चरण 1.2.20 में वर्णित के रूप में, बाद में किया जा करने के लिए प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए 1 x 106 कक्षों की एक aliquot रक्षित करें ।
      नोट: पर औसत सेल एक दाता माउस से व्युत्पंन उपज आमतौर पर 2 x 107 से ३.४ x 10 7 टी सेल -अस्थि मज्जा कोशिकाओं समाप्त हो गया है ।
    20. प्रवाह cytometry द्वारा एक सफल टी-सेल घट की पुष्टि करें । दाग 1 x 106 कोशिकाओं, कदम से संरक्षित 1.2.17 (चुंबकीय कोशिका जुदाई से पहले अस्थि मज्जा कोशिकाओं) और 1.2.19 (टी कोशिका घट चुंबकीय कोशिका जुदाई के बाद अस्थि मज्जा कोशिकाओं), निम्नलिखित एंटीबॉडी के साथ: α-सीडी 45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 ( gk 1.5), and α-CD8α (53-6.7). एक दाग नियंत्रण के रूप में कदम 1.2.17 से शेष कोशिकाओं का उपयोग करें और एक धुंधला नियंत्रण के लिए, प्रवाह cytometer सेट करने के लिए ।
      1. स्थानांतरण 1 एक्स 106 कोशिकाओं प्रत्येक नमूने से एक अच्छी तरह से एक वी नीचे के साथ एक ९६-अच्छी थाली के प्रवाह cytometric धुंधला प्रक्रिया प्रदर्शन करने के लिए ।
      2. ९६ के भीतर कोशिकाओं के नीचे स्पिन-अच्छी तरह से प्लेट (चरण 1.2.20.1) में ४५० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 4 ° c. supernatant त्यागें और FACS बफर के १०० µ l में कोशिकाओं resuspend (पंजाब 3% फ़िल्टर गोजातीय सीरम के साथ पूरक).
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० x g पर ९६-well थाली के भीतर कोशिकाओं केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
      4. पसंद की एंटीबॉडी की एक उपयुक्त राशि जोड़ें (1.2.20 चरण के साथ तुलना) FACS बफर के १०० µ एल में एकल धुंधला के लिए नमूने के लिए ।
      5. सभी एंटीबॉडी का एक मिश्रण तैयार (मास्टर मिक्स) अलग से अस्थि मज्जा सेल पहले से संरक्षित aliquots दाग करने के लिए पर्याप्त मात्रा युक्त (चरण 1.2.17 देखें) और उसके बाद (चरण 1.2.19 देखें) चुंबकीय टी सेल कमी. दोनों aliquots को मास् क मिश्रण के १०० µ l को जोड़ें ।
      6. FACS बफ़र के केवल १०० µ l को दाग वाले नमूने में जोड़ें ।
      7. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ९६-अच्छी तरह से थाली के भीतर कोशिकाओं को गर्मी ।
      8. FACS बफर के १०० µ एल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० x जी में ९६ अच्छी तरह से प्लेट के भीतर कोशिकाओं केंद्रापसारक । supernatant छोड़ें और FACS बफ़र के १०० µ l में कक्षों को पुनर्स्थगित करें ।
      9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । supernatant छोड़ें और FACS बफ़र के २५० µ l में कक्षों को पुनर्स्थगित करें ।
      10. एक 5 मिलीलीटर polystyrene गोल नीचे ट्यूब करने के लिए नमूनों स्थानांतरण और एक प्रवाह cytometer साधन है कि फ्लोरोसेंट अणुओं है कि सेल नमूनों की विशेषता के लिए कार्यरत एंटीबॉडी लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था का पता लगाने में सक्षम है के साथ विश्लेषण (कदम 1.2.20 देखें) ।
      11. से पहले और चुंबकीय कोशिका जुदाई के बाद से सेल संरचना की तुलना करें ।
        नोट: लगभग ९५% सीडी 45.1 की एक शुद्धता+CD3- (यानी, टी सेल घट अस्थि मज्जा) लाइव गेट के भीतर कोशिकाओं आमतौर पर प्राप्त की है ।
    21. टी-सेल-समाप्त अस्थि मज्जा सेल सस्पेंशन (4 ° c पर 5 मिनट के लिए ४५० x g ) और, अंत में, पंजाब के समाधान में कोशिकाओं resuspend, 5 x 107 कोशिकाओं के लिए सेल एकाग्रता समायोजन/ इंजेक्शन तक गीली बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।
    22. टी सेल समाप्त प्राप्तकर्ता चूहों, जो पहले दिन विकिरणित थे में अस्थि मज्जा कोशिकाओं को सुई (१.१ अनुभाग देखें) ।
      1. एक रिसाव प्रूफ चैंबर में प्रयोगात्मक माउस प्लेस और 4% isoflurane तक की साँस लेना द्वारा संज्ञाहरण प्रेरित, जब तक माउस बेहोश है । analgesia की पुष्टि करें और चेतना की हानि लेकन पलटा और पेडल वापस पलटा के बाद हानि के नुकसान का परीक्षण करके ।
      2. सुई 5 x 106 T-सेल समाप्त अस्थि मज्जा कोशिकाओं (यानी, 5x107 कोशिकाओं के १०० µ एल/एक 1mL सिरिंज नसों के साथ retrobulbar अंतरिक्ष में एक 30 जी सुई के साथ सुसज्जित का उपयोग करते हुए पंजाब के समाधान युक्त) शिरापरक साइनस.
  3. 2 दिन: टी कोशिकाओं का स्थानांतरण
    नोट: एक बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में नीचे वर्णित प्रक्रियाओं प्रदर्शन और फ़िल्टर किए गए एजेंट का उपयोग करें. उपयोग cd 45.2 C57Bl/6 (वंय-प्रकार; WT) alloreactive टी कोशिकाओं के लिए दाताओं के रूप में चूहों । congenic मार्कर सिस्टम का उपयोग प्राप्तकर्ता (सीडी 45.2+ H2kd+ बालब/सी चूहों) और दाता टेम सेल प्रकार (अस्थि मज्जा कोशिकाओं: सीडी 45.1+ H2kb+ बी-6 के बीच भेद की अनुमति देता है । SJL चूहों; allogeneic टी कोशिकाओं: सीडी 45.2+ H2kb+ C57/Bl6 चूहों) ।
    1. Euthanize C57Bl/6 चूहों के अनुसार आवेदन संस्थागत दिशा निर्देशों और अधिकारियों में । इसलिए, 5% isoflurane की एकाग्रता के साथ साँस लेना द्वारा चूहों anesthetize. सांस लेने की गिरफ्तारी के बाद 1 मिनट तक isoflurane एक्सपोजर जारी रखें और गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा इच्छामृत्यु की पुष्टि करें । फर और ७०% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से माउस की त्वचा को संक्रमित ।
    2. एक ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब पर एक ४० µm मेष स्क्रीन के साथ एक छलनी प्लेस । तिल्ली निकालें और यह छलनी पर जगह है ।
    3. एक सिरिंज गोताख़ोर के साथ, comminute में तिल्ली का छलनी । सभी splenocytes इकट्ठा करने के लिए पंजाबियों के साथ छलनी और सिरिंज गोताख़ोर धो लें ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० x g पर ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब के भीतर कोशिकाओं केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    5. लाइसे लाल रक्त कोशिकाओं को ले lysing बफर के 3 मिलीलीटर में splenocytes resuspend । 3 min. after के लिए सेल निलंबन की मशीन, पंजाब के 10 मिलीलीटर जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें और splenocytes को फिर से सस्पेंड करें ।
    6. तिल्ली कोशिकाओं गिनती, एक hemocytometer का उपयोग कर. एक aliquot को डायवर्ट करें 6 x 106 कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए, चरण 1.3.9 में शुद्धिकरण की भयावहता का मूल्यांकन करने के लिए.
    7. कुल splenocytes से कुल CD3+ T-सेल अलगाव के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल शोधन किट का उपयोग करें । प्लीहा टी कोशिकाओं को अलग, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन ।
    8. एक hemocytometer का उपयोग करते हुए चरण 1.3.7 में वर्णित के रूप में पृथक प्लीहा CD3+ T कक्षों की गणना करें । 1 x 106 टी कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए एक aliquot की रक्षा ।
      नोट: दाता माउस प्रति प्लीहा टी कोशिकाओं के पर औसत उपज १.३ x 10 7 से 2 x 107 कोशिकाओं से चुंबकीय कोशिका जुदाई पर्वतमाला से पृथक ।
    9. प्रवाह cytometry द्वारा टी सेल अलगाव की सफलता की पुष्टि करें । धुंधला प्रोटोकॉल का एक विस्तृत वर्णन के लिए, प्रदान और चरणों का पालन करें 1.2.20.1-1.2.20.10 ।
      1. दाग 1 x 106 कदम 1.3.6 के splenocytes (चुंबकीय कोशिका जुदाई से पहले) और 1.3.8 (चुंबकीय कोशिका जुदाई के बाद) निंनलिखित एंटीबॉडी के साथ: α-cd 45.2 (१०४), α-CD3 (17A2), α-CD4 (gk 1.5), and α-CD8α (53-6.7).
      2. एक दाग नियंत्रण के रूप में कदम 1.3.6 से शेष कोशिकाओं का प्रयोग करें और संबंधित एंटीबॉडी के साथ एक धुंधला के लिए, प्रवाह cytometer स्थापित करने के लिए ।
      3. सेल संरचना से पहले और चुंबकीय कोशिका जुदाई के बाद की तुलना करें ।
        नोट: लिम्फोसाइट लाइव गेट के भीतर सीडी 45.2+CD3+ टी कोशिकाओं के ≥ ९५% की एक पवित्रता पूरा किया जाना चाहिए ।
    10. टी (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० x g ) और, अंत में, पंजाब के समाधान में कोशिकाओं resuspend, सेल एकाग्रता 7 x 106 कोशिकाओं को समायोजित/ इंजेक्शन तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।
    11. इंजेक्षन alloreactive, प्लीहा टी कोशिकाओं (चरण 1.3.10 देखें) विकिरणित बालब में/सी चूहे जो पहले सीडी 45.1 प्राप्त किया है+ टी सेल घट अस्थि मज्जा कोशिकाओं (देखें कदम 1.2.22).
      1. एक लीक प्रूफ कक्ष जिसमें यह अप करने के लिए उजागर है में प्रयोगात्मक माउस रखकर संज्ञाहरण प्रेरित 4% isoflurane जब तक यह अपनी चेतना खो देता है । analgesia की पुष्टि करें और चेतना की हानि लेकन पलटा और पेडल वापस पलटा के बाद हानि के नुकसान का परीक्षण करके ।
      2. ०.७ x 106 alloreactive CD3+ टी कोशिकाओं एक 1 मिलीलीटर एक 30 जी सुई   के साथ सुसज्जित सिरिंज का उपयोग कर (यानी, 7 x 106 कोशिकाओं के १०० µ एल) पंजाबियों समाधान युक्त (कदम 1.3.10 देखें), नसों में retrobulbar चूहों के अंतरिक्ष, GvHD प्रेरित करने के लिए. इन चूहों को प्रयोगात्मक समूह के रूप में नामांकित करें ।
      3. अकेले पंजाब के १०० µ एल के साथ चूहों के एक अलग समूह सुई, नसों में retrobulbar अंतरिक्ष में, और नियंत्रण समूह के रूप में इस समूह को नामित, बाद में "नहीं टी-सेल-प्रत्यारोपित (नहीं) चूहों" कहा जाता है ।

2. प्रणालीगत GvHD का मूल्यांकन

नोट: एक अर्द्ध में एक प्रयोगात्मक कमरे में आसपास बाँझ में इस प्रक्रिया को निष्पादित लाइसेंस और पशु सुविधा के भीतर रहते चूहों से निपटने के लिए सुसज्जित.

  1. व्यक्तिगत चूहों में GvHD के नैदानिक पाठ्यक्रम का पालन करें; विशेष रूप से, आकलन और प्रयोगात्मक नैदानिक GvHD लक्षणों की उपस्थिति के लिए एक सप्ताह 3x स्कोर, एक स्कोरिंग प्रणाली के आधार पर नीचे वर्णित है और एक स्कोरिंग प्रणाली से अनुकूलित कुक एट अल.6द्वारा पहले स्थापित ।
    1. व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक माउस तौलना, वजन रिकॉर्ड है, और शरीर के वजन के संदर्भ में thespecific शरीर के वजन घटाने की गणना है कि प्रयोग के शुरू करने से पहले निर्धारित किया गया था (इसी १००%) 0 दिन पर (1.1.2 कदम) । ग्रेड 0, 10% के बीच एक वजन घटाने और ग्रेड 1 के साथ 25%, और ग्रेड 3 के साथ अधिक से अधिक 25% की एक वजन घटाने के साथ शुरू वजन के कम से 10% की एक वजन घटाने स्कोर ।
    2. प्रत्येक माउस के गतिविधि स्तर स्कोर, एक सामान्य गतिविधि के स्तर के साथ चूहों भेदभाव (स्कोर = 0) एक मामूली कम गतिविधि स्तर के साथ चूहों से (स्कोर = 1) और जब तक वे बाह्य उत्तेजित कर रहे हैं स्थिर व्यवहार के साथ चूहों (स्कोर = 2).
    3. फर बनावट स्कोर, जिससे एक सामान्य, चमकदार, और kempt फर भेदभाव (स्कोर = 0) एक मामूली से व्याकुल फर से (स्कोर = 1) और गंजा धब्बे की उपस्थिति (स्कोर = 2).
    4. त्वचा की बनावट स्कोर, सामान्य त्वचा भेदभाव (स्कोर = 0) स्केलिंग त्वचा के छिटपुट स्थानों से (जैसे, पूंछ और पंजे पर) (स्कोर = 1) और स्पष्ट स्केलिंग और गले में त्वचा क्षेत्रों (स्कोर = 2) ।
    5. गुप्त स्टूल भागों की निरंतरता का विश्लेषण । ग्रेड के साथ एक सामान्य (यानी, हार्ड संगति) के साथ मल स्कोर 0, मल के साथ विकृत और नरम मल 1 ग्रेड के साथ, और मल किसी भी निरंतरता के बिना और, इसलिए, 2 ग्रेड के साथ गंभीर दस्त के साथ.
    6. राशि सभी अलग से माउस के प्रति 12 के एक अधिक से अधिक नैदानिक स्कोर करने के लिए मापदंडों रन बनाए ।
  2. विचार और व्यक्तिगत माउस के वर्तमान रोग गंभीरता स्तर के कारण प्रयोग, संस्थागत दिशा निर्देशों और अधिकृत पशु प्रोटोकॉल के अनुसार बंद के मानदंडों का मूल्यांकन ।

3. आंत्र GvHD का आकलन

  1. बाहर कोलोरेक्टल क्षेत्र के मिनी एंडोस्कोपी द्वारा GvHD-संबंधित घावों के स्कोरिंग
    नोट:एक प्रयोगात्मक कक्ष में आसपास के एक semisterile में यह प्रदर्शन लाइसेंस और पशु सुविधा के भीतर रहते चूहों से निपटने के लिए सुसज्जित. छोटे जानवरों के उपयोग के लिए अनुमोदित है एक मिनी इंडोस्कोपिक कार्य केंद्र का उपयोग करें ।
    1. इंडोस्कोपिक परीक्षा म्यान के साथ (१.९ मिमी के व्यास और 10 सेमी की लंबाई के साथ) दूरबीन को कवर करके इंडोस्कोपिक डिवाइस तैयार करें । स्वच्छ और पानी और इथेनॉल के साथ एंडोस्कोप को निष्फल ।
    2. कंप्यूटर पर स्विच, समायोज्य क्सीनन प्रकाश स्रोत है, और कैमरा मॉड्यूल, और एक तरीका है कि वस्तुओं के लेंस के करीब एक स्पष्ट छवि देने में ध्यान केंद्रित सेट ।
    3. एयर पम्प को एंडोस्कोपी म्यान से कनेक्ट करें । हवा की धारा कल्पना करने के लिए, पानी से भरा एक चोंच गिलास में एंडोस्कोपी की नोक डुबकी । हवा पंप और इंडोस्कोपिक म्यान के बीच वाल्व का समायोजन करके हवा की धारा को विनियमित । यह एक धीमी गति से, लगातार हवा धारा को समायोजित, कुछ लगातार आरोही बुलबुले के द्वारा परिलक्षित ।
    4. एक रिसाव प्रूफ चैंबर में एक माउस प्लेस । जब तक माउस बेहोश है 4% isoflurane तक की साँस लेना संज्ञाहरण के लिए प्रेरित । analgesia और सजगता के एक अनुपस्थित राज्य की पुष्टि करें लेकन पलटा और पेडल के बाद नुकसान पलटा वापस लेने के नुकसान का परीक्षण करके ।
    5. प्रयोग किया जाता पशु प्रोटोकॉल के साथ अनुसार एक उचित पशु चिकित्सा संज्ञाहरण मशीन का प्रयोग करें । colonoscopy कार्यस्थान के लिए कक्ष से माउस स्थानांतरित करें । यहाँ, anesthetized माउस की स्थिति, nosecone में अपनी नाक के साथ (जो संज्ञाहरण साधन से जुड़ा हुआ है), एक साफ काम कर म्यान पर ताकि माउस एक प्रवण स्थिति में है, इसके hindquarters के साथ प्रयोगकर्ता का सामना करना पड़.
    6. colonoscopy प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए, लगभग 2% करने के लिए isoflurane एकाग्रता को कम । colonoscopy के दौरान उत्तेजना के लिए माउस की श्वसन और प्रतिक्रिया की निगरानी और अगर जरूरत vaporizer पर isoflurane एकाग्रता समायोजित करें । मरहम के साथ माउस की आंखों को कवर करने के लिए उंहें सूखी हो रही से रोकने के ।
    7. माउस की उंगलियों के बीच चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की प्रभावकारिता को नियंत्रित. अनुपस्थित जेट के मामले में कदम 3.1.8 के लिए आगे बढ़ना ।
    8. एक हाथ से पूंछ रूट के ऊपर सिर्फ पूंछ लिफ्ट और ध्यान से एंडोस्कोप डालने, दूसरे हाथ में तैनात, मलाशय में गुदा के माध्यम से ।
    9. जबकि हवा धारा कोलोरेक्टल लुमेन फुलाते, धीरे और ध्यान से aboral दिशा में आगे एंडोस्कोप कदम ।
    10. इंडोस्कोपिक कालोनी लुमेन के बीच में रखें और इस स्थिति को बनाए रखने के लिए बृहदांत्र दीवार के साथ संपर्क को कम करने और खरोंच बनाने से बचने के लिए, गहरी दीवार से संबंधित चोटों (उदाहरण के लिए, रक्तस्राव में जिसके परिणामस्वरूप), या यहां तक कि दीवार वेध (चरण 3.1.17 देखें) . स्थाई रूप से वीडियो स्ट्रीम देख (यानी, कालोनी डिब्बे के निरंतर दृश्य के तहत) द्वारा इस कदम पर नियंत्रण ।
    11. अगर मल को देखने के लिए कसना, एंडोस्कोप निकालें और एक एनीमा के साथ एक नरम पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, खारा के 2 मिलीलीटर के साथ फ्लश द्वारा प्रदर्शन । संभव के रूप में कम तरल के रूप में उपयोग करें, मल और अन्य माध्यमिक प्रभाव के एक अनपेक्षित कमजोर पड़ने को रोकने के लिए नकारात्मक श्लैष्मिक सतह की विशेषताओं को प्रभावित करने और, अंत में, स्कोरिंग परिणाम.
    12. नियमित रूप से एक परिभाषित (यानी, अलग) शारीरिक साइट बाहर बृहदांत्र के भीतर के लिए बृहदांत्र सूजन के स्कोरिंग मानकीकरण और चूहों के बीच और प्रयोगों के बीच स्कोरिंग परिणामों की तुलना का अनुकूलन पर एंडोस्कोप की स्थिति की कोशिश करो ।
      नोट: आम तौर पर, कठोर एंडोस्कोप के साथ, 4 सेमी की एक अधिकतम गहराई गुदा मार्ग के माध्यम से पहुंचा जा सकता है । 2 और 4 सेमी aborally के बीच, बृहदांत्र नियमित रूप से एक flexure है कि कठोर colonoscope के साथ पारित नहीं किया जा सकता है में बदल जाता है । डिफ़ॉल्ट स्कोरिंग स्थान के रूप में flexure के निकटवर्ती कोलन क्षेत्र का उपयोग करें.
    13. वीडियो स्ट्रीम रिकॉर्ड और सूजन के स्कोरिंग के साथ शुरू करने के लिए शुरू करते हैं ।
    14. पैरामीटर समझाया और तालिका 1 और चित्रा 3में दर्शाई स्कोरिंग द्वारा बृहदांत्र के GvHD से संबंधित सूजन का मूल्यांकन करें ।
      1. धीरे और थोड़ा पीछे स्कोरिंग स्थान पर एंडोस्कोप ले जाएँ-और आगे विभिन्न मापदंडों का आकलन करने के लिए.
      2. पैरामीटर का आकलन "translucency", साथ ही साथ "स्टूल निरंतरता", स्थिति के अनुसार एंडोस्कोपी एक व्यापक दूरी में कालोनी दीवार के संबंध में.
      3. मानकों का आकलन "दानेदार" और "संवहनी" स्थिति में एंडोस्कोपी द्वारा निकट निकटता में बृहदांत्र दीवार । इस कार्य के लिए, ध्यान से इंडोस्कोपिक की नोक के साथ बृहदांत्र दीवार के लिए अच्छी तरह से खुराक तनाव लागू होते हैं ।
    15. स्कोरिंग प्रक्रिया के पूरा होने पर, रिकॉर्डिंग बंद करो ।
      नोट: इसके बाद, दर्ज की गई वीडियो क्लिप कुल में इस्तेमाल किया जा सकता है या प्रतिनिधि छवियों (यानी, स्क्रीनशॉट) मिनी के उत्पंन करने के लिए प्रयोग किया जाता endoscopically मूल्यांकन मानदंड समग्र बृहदांत्र सूजन के लिए योगदान ।
    16. ध्यान से एंडोस्कोप निकालें ।
    17. एक अलग पिंजरे में यह परिवेशी हवा के संपर्क में है करने के लिए माउस स्थानांतरित द्वारा isoflurane प्रदर्शनी बंद करो । एक लाल बत्ती दीपक के साथ माउस गर्म और माउस का निरीक्षण जब तक यह संवेदनाहारी से ठीक हो और पूरी चेतना प्राप्त करता है ।
      नोट: एंडोस्कोपी के दौरान बृहदांत्र की हवा मुद्रास्फीति के कारण, माउस के उदर क्षेत्र को सीधे बाद में फूला हुआ दिखाई दे सकता है । हालांकि यह सामांय और क्षणिक प्रकृति का है, और पेट की वसूली की विफलता के बड़े पैमाने पर और यहां तक कि प्रगतिशील मुद्रास्फीति के लंबे समय तक माउस बृहदांत्र के एक अवांछित वेध का संकेत हो सकता है (इस मामले में, माउस की जरूरत है euthanized तुरंत) ।
    18. पूर्ण वसूली पर, माउस अपने संबंधित पिंजरे में वापस जगह है ।
    19. वैकल्पिक दृष्टिकोण: यह भी देखना-निर्देशित ऊतक बायोप्सी लेने के लिए संभव है । निंनलिखित कदम उठाएं ।
      नोट: colonoscopy चरणों में वर्णित के रूप में उसी तरह किया जाएगा 3.1.1-3.1.18, निंनलिखित संशोधनों के साथ ।
      1. स्टेप 3.1.1 में, दूरबीन को कवर करने के लिए, काम कर रहे चैनलों के बिना एक सरल परीक्षा म्यान के बजाय एक अंतर्निहित कार्यशील चैनल के साथ इंडोस्कोपिक परीक्षा म्यान का उपयोग करें । एक बायोप्सी संदंश कार्य चैनल में परिचय जब तक अपनी टिप सिर्फ वीडियो स्क्रीन पर एंडोस्कोप के सामने दिखाई है क्योंकि यह काफी हद तक आंत को अवांछित चोट रोकता है ।
      2. 3.1.2 कदम-3.1.11 के साथ आगे बढ़ें । पेट में एंडोस्कोप डालें और यह ध्यान से आगे ब्याज की हाजिर करने के लिए धक्का ।
      3. बृहदांत्र ऊतक बायोप्सी लेने के कार्य के लिए एक दूसरे प्रयोगकर्ता की मदद को रोजगार । दूसरा प्रयोगकर्ता से पूछो करने के लिए काम कर रहे चैनल के भीतर संदंश धक्का धीरे आगे जब तक संदंश के जबड़े खोला जा सकता है द्वारा चुनाव के बृहदांत्र क्षेत्र के लिए संदंश बायोप्सी की नोक नेविगेट । लगातार इस प्रक्रिया के दौरान वीडियो स्ट्रीम देखने के लिए बृहदांत्र दीवार घायल होने के जोखिम को कम ।
      4. ध्यान से खोलने और बायोप्सी संदंश के जबड़े बंद करके एक बृहदांत्र दीवार ऊतक नमूना पुनर्प्राप्त करें ।
        नोट: कालोनी की दीवार के छिद्र को रोकने के लिए सावधानी के साथ ऐसा करें । एक बृहदांत्र वेध के दुर्लभ मामले में, तुरंत संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार माप लागू करने और निश्चेतक के सतत प्रशासन के तहत प्रभावित माउस की बलि ।
      5. वापस खींचो और बंद संदंश काम कर रहे चैनल से बाहर निकालें । सूई और ध्यान से बाँझ पंजाब समाधान में खोला संदंश मिलाते द्वारा बायोप्सी संदंश के जबड़े से नमूना निकालें । इसके बाद, ऊतक नमूने के लिए उचित भंडारण की स्थिति का चयन, योजनाबद्ध बहाव विश्लेषण के अनुसार । ७०% इथेनॉल के साथ संक्रमण के बाद, संदंश आगे बायोप्सी लेने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      6. बायोप्सी लेने के बाद, एंडोस्कोप निकालें और colonoscopy चरणों 3.1.16-3.1.18 में वर्णित के रूप में समाप्त करें ।
  2. Histopathological विश्लेषण
    1. दिन के बीच 26 और 30 एक्स-रे विकिरण के बाद, euthanize के अनुसार एलो-HCT प्राप्तकर्ता चूहों संस्थागत दिशा निर्देशों और अधिकारियों को लागू करने के लिए. इस के लिए, 5% isoflurane की साँस लेना द्वारा चूहों anesthetize । सांस लेने की गिरफ्तारी के बाद 1 मिनट के लिए isoflurane जोखिम के साथ जारी रखें और गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा इच्छामृत्यु की पुष्टि । अच्छी तरह से फर और ७०% इथेनॉल के साथ माउस की त्वचा को संक्रमित ।
    2. उदर गुहा खोलें और बृहदांत्र निकालें । यह एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण (९२ मिमी के व्यास के साथ) पंजाबियों के साथ ।
    3. पंजाब के साथ एक 5 मिलीलीटर मशीन टिप भरें । 13 सेमी की लंबाई और दांतेदार घुमावदार सुझावों के साथ एक Semken संदंश की मदद से, मशीन टिप की नोक पर बृहदांत्र के बाहर का हिस्सा (लगभग 5 मिमी) पर्ची । ध्यान से मशीन टिप पर संदंश के साथ बृहदांत्र ठीक है और नीचे मशीन टिप के गोताख़ोर दबाकर आंत से मल हटाने के द्वारा पंजाबियों के साथ बृहदांत्र फ्लश ।
    4. एक स्केलपेल की मदद से गुदा से 5 मिमी के बारे में स्थित एक बृहदांत्र क्षेत्र में कटौती ।
    5. फिक्स ४.५% formaldehyde रातोंरात में संप्रदाय आंत नमूना । यह तेल में embedding से पहले, एक ईमानदार स्थिति में ऊतक जगह है ।
    6. तेल के 3 µm पार वर्गों-एंबेडेड बृहदांत्र ऊतक कट और hematoxylin और eosin (वह) के साथ दाग, मानक धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग कर ।
    7. पेट के ऊतकों के नमूनों की वह दाग पार वर्गों को तैयार.
    8. स्कोरिंग मैट्रिक्स से अनुकूलित कापलान एट अल.12द्वारा रिपोर्ट, histopathologically 0-3 से स्कोर के साथ भड़काऊ गतिविधि semiquantitatively, स्कोर: कोई सूजन (स्कोर = 0), हल्के सूजन (स्कोर = 1), उदारवादी सूजन (स्कोर = 2), और गंभीर सूजन (स्कोर = 3) ।
      नोट: आदर्श रूप में, इस कार्य के लिए रोजगार एक पैथोलॉजिस्ट जो murine आंत्र GvHD के मूल्यांकन में अनुभवी और प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों की प्रकृति के लिए अंधा कर रही है की विशेषज्ञता ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल, मिनी आंत्र GvHD के इंडोस्कोपिक मूल्यांकन का वर्णन बाहर पेट के घावों से जुड़े, स्थापित किया गया है और पहले एक गंभीर तीव्र GvHD मॉडल की प्रणालीगत प्रेरण के अधीन चूहों में मांय है । इस अध्ययन में, हम एक MHC वर्ग मैं पूरी तरह से बेमेल मॉडल प्रणाली है जिसमें बालब/सी चूहों थे घातक विकिरणित, टी सेल के प्रत्यारोपण के बाद-घट allogeneic अस्थि मज्जा और GvHD के प्रशासन द्वारा-उत्प्रेरण alloreactive C57BL/6 CD3+ T लिम्फोसाइटों. टी सेल समाप्त अस्थि मज्जा कोशिकाओं और GvHD प्रेरण के लिए प्लीहा टी कोशिकाओं चुंबकीय जुदाई से शुद्ध थे । इन कोशिकाओं की आबादी की पवित्रता प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था, और शुद्धि प्रक्रिया के प्रतिनिधि परिणाम 1 चित्रामें प्रदर्शित कर रहे हैं, कुल अस्थि मज्जा कोशिकाओं से टी कोशिकाओं की एक पर्याप्त कमी और एक सुसंगत संवर्धन दिखा तिल्ली-व्युत्पंन CD3+ टी कोशिकाओं पहले विकिरणित चूहों को उनके स्थानांतरण से पहले । नैदानिक पाठ्यक्रम में प्रदर्शित चित्र 2 नैदानिक प्रणालीगत GvHD phenotype की उपस्थिति में एलो-HCT (WT, काले में) बनाम अनुपस्थिति (नहीं, ग्रे) alloreactive दाता टी लिम्फोसाइटों के reproducibly मजबूत प्रेरण प्रदर्शित करता है । स्कोरिंग प्रणाली पहले Cooke एट अल द्वारा की सूचना दी । जिसमें छह मापदंडों मूल्यांकन और वर्गीकृत: शरीर के वजन, आसन, गतिविधि, त्वचा और फर बनावट, और मल संगति6एक राशि कोर का प्रतिनिधित्व करता है । नियंत्रण चूहों केवल एक अनुभवी, नैदानिक स्कोर के जल्दी होने वाली चोटी, 5 और 10 दिनों के बीच, कि इसी तरह टी सेल-प्राप्त चूहों में मनाया गया था और है, इसलिए, मोटे तौर पर विकिरण से जुड़े प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया के कारण. चाहे, दाता टी के नैदानिक स्कोर-सेल चूहों को पहले उठना शुरू कर दिया, एक उच्च कुल चोटी दिखाया, केवल क्षणिक शुरू में पीक के बाद कमी आई, और फिर, अनिवार्य रूप से फिर से वृद्धि हुई, लगातार, की शेष अवधि से अधिक प्रयोग. कुल मिलाकर, इन परिणामों की व्याख्या के साथ समझौते में है कि टी सेल प्राप्त चूहों को मजबूत और प्रणालीगत GvHD के अधिक प्रगतिशील संकेत नहीं चूहों की तुलना में दिखाते हैं ।

दाता टी-लिम्फोसाइटों-प्राप्त करने वाली एलो-HCT चूहों ने तीव्र अंग-संबंधी और प्रणालीगत GvHD अभिव्यक्तियों के विभिन्न लक्षण दिखाई, कुल मिलाकर उच्च राशि स्कोर में जिसके परिणामस्वरूप, नियंत्रण चूहों गंभीर प्रभाव के लिए उदार कमी आई, विशेष रूप से बाद में समय बिंदुओं पर. हालांकि, आंतों GvHD के लक्षण प्रणालीगत GvHD स्कोरिंग प्रणाली में रेखांकित कर रहे हैं, जहां केवल आंत से संबंधित मानदंड स्टूल स्थिरता है । के रूप में 1 तालिका में दिखाया गया है, मिनी endoscopically assessable मानदंड परिभाषित किया गया है, विशेष रूप से सटीक विवरण के लिए इरादा, स्कोरिंग, और आंत्र GvHD-जुड़े घावों के ग्रेडिंग, पहले मूल्यांकन के लिए रिपोर्ट मानदंड अनुकूल द्वारा alloresponse-संचालित कोलाइटिस के संदर्भ के लिए syngeneic कोलाइटिस के9। चित्रा 3 प्रत्येक व्यक्ति की कसौटी के लिए विशिष्ट उदाहरण प्रदर्शित करता है, प्रकार और आंतों GvHD-जुड़े घावों की हद illustrating, जिससे ग्रेडिंग मैट्रिक्स के बाहर के बृहदांत्र के मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन के दौरान लागू visualizing GvHD-प्रवण चूहों MHC वर्ग के प्रत्यारोपण पर मैं पूरी तरह से बेमेल दाता लिम्फोसाइटों ।

चित्र 4 एक दिखाता है कि आंत्र GvHD राशि स्कोर परिणाम है कि 1 तालिका में परिभाषित मानदंडों पर आधारित है और चित्र 2 में प्रदर्शित आसानी से भेदभाव दाता लिम्फोसाइट के लिए प्रयोगकर्ता सक्षम-आंतों के गंभीर लक्षण के साथ चूहों प्राप्त नियंत्रण चूहों कि GvHD से अनिवार्य रूप से रहित है से सूजन । मिनी endoscopically आधारित ग्रेडिंग प्रणाली को मांय करने के लिए, histopathological अध्ययन एक पहले रिपोर्ट सूक्ष्म ग्रेडिंग प्रणाली12का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया । चित्रा 4बी में डेटा की पुष्टि करें कि चूहों के बृहदांत्र बुरी तरह से प्रभावित GvHD से संबंधित सूजन, उच्च colonoscopic राशि स्कोर द्वारा सबूत के रूप में, सूजन के इसी तरह मजबूत histopathological लक्षण प्रदर्शन, एक histopathological दिया ≥ 2 गुजाइश का योग स्कोर । इसके विपरीत, नियंत्रण चूहों के बृहदांत्र ऊतकों (स्कोर 0) नहीं प्रदर्शित या, सबसे कम, हल्के (स्कोर 1) सूजन के histopathological लक्षण, लाइन में मिनी की आभासी अनुपस्थिति के साथ-endoscopically कोलाइटिस का पता लगाने के लक्षण । इसके अलावा, के रूप में चित्रा 4सी, डी, मिनी endoscopically और histopathologically मूल्यांकन कोलाइटिस गतिविधि और प्रणालीगत GvHD स्कोर के बीच सहसंबंध अध्ययन में दिखाया गया । महत्वपूर्ण बात, इन अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि मिनी endoscopically ≤ की राशि स्कोर निर्धारित 3 मज़बूती से मध्य के अभाव की भविष्यवाणी करने वाली उच्च ग्रेड (यानी, ≥ 2) आंत्र GvHD-संबंधित बृहदांत्र सूजन स्कोर histopathological ग्रेडिंग से प्राप्त की । अंत में, endoscopically का आकलन आंत्र GvHD की गंभीरता प्रणालीगत GvHD गतिविधि के साथ एक संबंध से पता चलता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : चुंबकीय शुद्ध टी कोशिका घट अस्थि मज्जा कोशिकाओं और allogeneic प्लीहा CD3+ टी कोशिकाओं के प्रवाह cytometric गुणवत्ता मूल्यांकन । (क) सीडी की कमी 90.2+ अस्थि मज्जा चुंबकीय जुदाई द्वारा हासिल की कोशिकाओं, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शोधन किट का उपयोग कर । टी कोशिका समाप्त अस्थि मज्जा कोशिकाओं की पवित्रता प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था, से पहले और विरोधी सीडी 45.1 और विरोधी CD3 के साथ टी सेल कमी के बाद कोशिकाओं धुंधला द्वारा । एक प्रतिनिधि प्रयोग से परिणाम दिखाए जाते हैं. (ख) प्लीहा टी कोशिकाओं चुंबकीय शुद्ध थे, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शोधन किट रोजगार । पवित्रता प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था, सीडी 45.2 की आवृत्तियों और पहले से और टी सेल अलगाव के बाद व्युत्पंन नमूनों की CD3 costaining तुलना । एक प्रतिनिधि प्रयोग से परिणाम दिखाए जाते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : GvHD के नैदानिक पाठ्यक्रम, एक MHC वर्ग को रोजगार मैं पूरी तरह से बेमेल मॉडल । तीव्र GvHD प्रेरित करने के लिए, बालब/सी चूहे पूरे शरीर विकिरणित 0 दिन पर थे । चूहों टी सेल समाप्त अस्थि मज्जा कोशिकाओं 24 एच बाद में (d1) प्राप्त किया । 2 दिन पर, चूहों allogeneic प्लीहा CD3 के साथ इंजेक्शन थे+ टी कोशिकाओं (जंगली-प्रकार [WT]; n = 9). एक नियंत्रण के रूप में, कुछ चूहों टी सेल समाप्त अस्थि मज्जा अकेले प्राप्त (नहीं; n = 9). चूहों विशेष रूप से उपस्थिति और GvHD के नैदानिक लक्षणों की गंभीरता के लिए एक सप्ताह में तीन बार मूल्यांकन किया गया । प्रदर्शित डेटा दो प्रतिनिधि प्रयोगों से संकेत उपचार समूह के व्यक्तिगत चूहों से प्राप्त नैदानिक स्कोर का मतलब मान ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं. डेटा दो तरह ANOVA द्वारा विश्लेषण किया गया, Bonferroni के कई तुलना posttest के बाद । पी < ०.०००१ महत्वपूर्ण माना जाता था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रतिनिधि छवियां ग्रेडिंग उदाहरण के लिए आंतों GvHD के स्कोरिंग मैट्रिक्स अंतर्निहित-एक मिनी द्वारा मूल्यांकन संबंधित बृहदांत्र परिवर्तन रहते हैं, एलो-HCT-चूहों के बृहदांत्र के इंडोस्कोपिक मूल्यांकन । के लिए पूरक और प्रयुक्त स्कोरिंग ग्रेडिंग और 1 तालिकामें प्रणाली का विस्तृत विवरण वर्णन, प्रतिनिधि मिनी-मूल्यांकन गंभीरता स्तर के इंडोस्कोपिक छवियों (ग्रेडिंग) anesthetized के बृहदांत्र में व्यक्तिगत रूप से सभी मापदंडों के लिए, चित्रा 1 में वर्णित पहले 26 और 30 दिनों के बीच एलो-HCT के दौर से गुजर रहे चूहों को यहाँ प्रदर्शित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : मिनी इंडोस्कोपिक स्कोरिंग और पेट की आंतों GvHD से संबंधित सूजन की ग्रेडिंग, मज़बूती से histopathological स्कोरिंग द्वारा मूल्यांकन उच्च ग्रेड कोलाइटिस की उपस्थिति की भविष्यवाणी. (A) 26 और 29 दिनों के बीच GvHD के रूप में चित्रा 1में वर्णित की प्रेरण के बाद, आंतों GvHD की अभिव्यक्ति लाइव, anesthetized चूहों में मिनी एंडोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था. कालोनी परिवर्तन रन बनाए और ग्रेडिंग और तालिका 1 और चित्रा 2में चित्रित प्रणाली के अनुसार वर्गीकृत किया गया । प्रतिनिधि इंडोस्कोपिक नियंत्रण के छवियों (कोई टी सेल; नहीं) और जंगली-प्रकार (WT), टी सेल-चूहों प्राप्त करने और मिनी endoscopically मूल्यांकन स्कोर (ऊपर) दिखाया गया है । (ख) चूहों मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन के बाद 12 ज बलिदान दिया गया था, और बृहदांत्र के बाहर का हिस्सा संसाधित किया गया था और histopathologically मूल्यांकन । बाहर बृहदांत्र के hematoxylin-और eosin दाग क्रॉस वर्गों के भड़काऊ गतिविधि वर्गीकृत किया गया था । प्रतिनिधि hematoxylin-और eosin-दाग नहीं टी-सेल-और WT टी-सेल-प्राप्त करने वाली एलो-HCT-इलाज चूहों और इसी प्रोटोकॉल स्कोर के बाहर की बृहदांत्र के पार वर्गों दिखाया जाता है । पैनल ए और बी में डेटा का विश्लेषण किया गया है छात्र टीपरीक्षण द्वारा और के रूप में दिखाया गया है ± SEM. * * * *p < ०.०००१ महत्वपूर्ण माना जाता था । WT: n = 15; नहीं: n = 15 । डेटा चार व्यक्तिगत प्रयोगों से परित डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग) colonoscopy स्कोरिंग और ऊतकवैज्ञानिक स्कोरिंग की निर्भरता. डेटा बॉक्स प्लॉट के रूप में दिखाया जाता है । प्रत्येक दाग औसत (प्रत्येक बॉक्स के भीतर काली रेखा) प्रदर्शित करता है, डेटा की सीमा (अधिकतम करने के लिए ंयूनतम), और quartiles (प्रत्येक बॉक्स के क्षेत्रों) । WT: n = 15; नहीं: n = 15 । डेटा चार व्यक्तिगत प्रयोगों से परित डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं । (घ) colonoscopy स्कोरिंग और नैदानिक स्कोरिंग के बीच सहसंबंध. नियंत्रण और वंय-प्रकार टी-सेल-प्राप्त चूहों दोनों सहसंबंध विश्लेषण में शामिल हैं । ठोस रेखा रेखीय प्रतीपगमन रेखा का प्रतिनिधित्व करता है । स्पीमरन सहसंबंध गुणांक (r-value) और p-मान दिखाए जाते हैं । WT: n = 12; नहीं: n = 13 । डेटा तीन व्यक्तिगत प्रयोगों से परित डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

स्कोर 0 1 2 3
Translucency कालोनी की दीवार अतिरिक्त आंत्र, भीतरी अंगों (जैसे तिल्ली) अच्छी तरह से दिखाई पेट की दीवार की हल्के अस्पष्टता के कारण अतिरिक्त आंत्र अंगों की दृश्यता के असतत कमी पेट की दीवार की महत्वपूर्ण अस्पष्टता के कारण अतिरिक्त आंत्र अंगों की दृश्यता के उदारवादी कमी अतिरिक्त आंत्र अंगों की दृश्यता की कमी, यानी गैर पारदर्शी कालोनी दीवार
Granularity चिकनी, अप्रभावित श्लैष्मिक सतह उपस्थिति; बृहदांत्र तहखाना पैटर्न दिखाई श्लैष्मिक सतह के असतत roughening और cobblestone उपस्थिति श्लैष्मिक सतह के मॉडरेट roughening और cobblestone प्रकटन श्लैष्मिक सतह के गंभीर roughening और cobblestone प्रकटन; तकिया-म्यूकोसा की उपस्थिति की तरह
vascularity वृद्धि बड़े और छोटे जहाजों के संचार नेटवर्क प्रदर्शित अनछुए संवहनी पैटर्न संवहनी पैटर्न के असतत परिवर्तन; पोत पैटर्न को लगता है मैदान कुछ जहाजों अदृश्य कर रहे हैं; सतत पोत नेटवर्क प्रेरित रक्तस्राव से संपर्क करें; जहाजों की तरह डॉट-पैटर्न
स्टूल संगति सामान्य मल कठिन है; बलगम के ठीक धागे
मल और बृहदांत्र दीवार के बीच मनाया जा सकता है		 मल अभी भी आकार का है, लेकिन प्रचंड किनारों को शामिल कर सकते हैं; एंडोस्कोपी की नोक के साथ विकृत मल नरम और अनआकृतिपूर्ण है
मल दिख रहा है अधिक चमक (उच्च जल सामग्री)		 मल ढीला है, तरल; पानी दस्त । मल बेतरतीब ढंग से बृहदांत्र के श्लैष्मिक सतह पर फैल सकता है

तालिका 1: लाइव एलो-HCT-इलाज चूहों के बृहदांत्र में आंतों के GvHD-संबंधी घावों की मिनी इंडोस्कोपिक स्कोरिंग और ग्रेडिंग मैट्रिक्स । endoluminal और transmural बृहदांत्र में परिवर्तन की एलो-HCT का इलाज चूहों मलाशय के एक colonoscopy और anesthetized, लाइव चूहों के बाहर बृहदांत्र, एक murine मिनी एंडोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया । बृहदांत्र घावों इंडोस्कोपिक स्कोरिंग प्रणाली की मदद से वर्गीकृत किया गया (कोलाइटिस गंभीरता [MEICS] के murine इंडोस्कोपिक सूचकांक) है कि मूल MEICS स्कोरिंग प्रणाली से मुजे बेकर एट अल.9 द्वारा रिपोर्ट और के संदर्भ के लिए अनुकूलित है एलो-HCT. बाहर बृहदांत्र नेत्रहीन उपस्थिति और निंनलिखित चार मापदंडों की भयावहता के लिए मूल्यांकन किया गया है: 1. दीवार के और अधिक मोटा होना के रूप में बृहदांत्र आंत्र दीवार के माध्यम से इंडोस्कोपिक लाइट (translucency) के प्रसारण; 2. श्लैष्मिक सतह endoluminal उंमुख श्लैष्मिक सतह के एक cobblestone उपस्थिति (दानेदार) प्रदर्शित; 3. एक बदल vascularization पैटर्न (संवहनी); 4. सीटू (मल संगति) में endoscopically का मूल्यांकन मल प्रकटन. प्रत्येक पैरामीटर से रन बनाए है 0 (कोई संकेत) करने के लिए 3 (सबसे गंभीर phenotype), प्रति माउस 12 का अधिकतम योग स्कोर करने के लिए जोड़ रहा है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल की कार्यप्रणाली का वर्णन करता है प्रेरण और मिनी-इंडोस्कोपिक मूल्यांकन के बृहदांत्र phenotype के पाठ्यक्रम में मनाया आंतों GvHD । यह वैज्ञानिकों आंतों GvHD longitudinally अध्ययन करने के लिए सक्षम करने के व्यापक प्रयोजन के कार्य करता है और पूरी तरह से रोग पाठ्यक्रम पर इनवेसिव (यानी, बृहदांत्र अभिव्यक्ति और प्रगति तक अधिक से अधिक रोग गतिविधि की शुरुआत से).

हालांकि, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम और महत्वपूर्ण प्रस्तुत तरीके से निहित सीमाओं को प्रयोगकर्ता के लिए संबंधित वैज्ञानिक संदर्भ में प्रौद्योगिकियों को लागू करने से पहले के बारे में पता होना चाहिए रहे हैं । सबसे पहले, यद्यपि हम सफलतापूर्वक एक छोटी histocompatibility-बेमेल मॉडल प्रणाली11में आंत्र GvHD से संबंधित बृहदांत्र घावों के मिनी इंडोस्कोपिक आकलन का इस्तेमाल किया है, यहां प्रदान की प्रोटोकॉल वर्तमान में विशेष रूप से लागू है MHC वर्ग मैं पूरी तरह से बेमेल एक्यूट GvHD मॉडल । जबकि MHC वर्ग मैं पूरी तरह से बेमेल GvHD मॉडल आम है और अक्सर5इस्तेमाल किया, यह अच्छी तरह से स्थापित है कि GvHD अभिव्यक्ति की विशेषताओं इस जोरदार प्रभावों के बाद से इस्तेमाल माउस उपउपभेदों पर अत्यधिक निर्भर हैं, उदाहरण के लिए, विकिरण के प्रति संवेदनशीलता । इसके अलावा, प्रयोगात्मक माउस स्रोत के साथ, उदाहरण के लिए, आंतों microbiota और हस्तांतरित allogeneic टी कोशिकाओं की संख्या का इस्तेमाल किया गंभीर रूप से कैनेटीक्स और आंत्र GvHD अभिव्यक्ति12की गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं की एक अलग रचना । इसलिए, एक महत्वपूर्ण कदम के लिए सावधानी से परीक्षण और अपने को सफलतापूर्वक आंत्र GvHD के रूप में प्रेरित करने की क्षमता के लिए संकेत दिया उपायों को मांय है दिखाया ।

तीव्र आंत्र GvHD के लाइव मिनी इंडोस्कोपिक आकलन के सफल कार्यान्वयन के बारे में, हम तनाव करना चाहते हैं, जबकि एंडोस्कोप हैंडलिंग सीधा है, यह कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है, सबसे खूंखार अनुभव के जोखिम को कम करने के लिए जटिलता (यानी, हवा-पेट फुलाना करने की आवश्यकता के साथ संयोजन में कठोर साधन के साथ आंतों की दीवार छिद्र करने के लिए) । एक वृद्धि की सूजन प्रेरित भेद्यता और बृहदांत्र ऊतक की कमी लचीलापन के कारण, आंत की दीवार अखंडता जोखिम में अधिक हो सकता है postradiation वसूली चरण के दौरान (यानी, 10 दिन तक) और आंतों की पूर्ण अभिव्यक्ति पर GvHD-संबंधित कोलाइटिस (यानी, लगभग 25 दिन के बाद) । महत्वपूर्ण बात, तथापि, हम काफी वृद्धि हुई जटिलता एंडोस्कोपी के समय बिंदु पर निर्भर दर, के रूप में लंबे समय के रूप में पर्याप्त दृश्यता के तहत धीरे उंनत है । इसके विपरीत, हम एक जोखिम कारक होने के लिए की पहचान की उपइष्टतम दवा खुराक के बाद से एक अपर्याप्त गहराई के प्रयोगात्मक माउस के अवांछित शरीर आंदोलनों की घटना में परिणाम कर सकते हैं और, लगातार, बृहदांत्र दीवार वेध घटनाओं. दूसरा, स्कोरिंग प्रक्रिया के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम ठोस या तरल की अवांछित उपस्थिति के कारण इस मामले में प्रतिबंध का प्रतिनिधित्व करता है (जैसे, दस्त) के रूप में प्रयोगकर्ता लुमेन में स्कोरिंग की स्थिति में ले जाता है । इस स्थिति में, एक लचीला प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर खारा समाधान के साथ कोलोरेक्टल क्षेत्र निस्तब्धता अक्सर आवश्यक है । हालांकि, के बाद से इस प्रक्रिया स्कोरिंग सटीकता और कई मापदंडों (जैसे, स्टूल निरंतरता) की विशिष्टता समझौता हो सकता है, इस चेतावनी सावधानी से स्कोरिंग पर ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

वहां कई व्याख्या और इस इंडोस्कोपिक दृष्टिकोण से तैयार निष्कर्ष सीमित सीमाएं हैं । सबसे पहले, एक पद्धति को आंतरिक मलाशय मार्ग के माध्यम से एक लचीला एंडोस्कोप का उपयोग करने के लिए, मूल्यांकन जठरांत्र संबंधी पथ के पिछले 3-4 सेमी (यानी, मलाशय और बाहर बृहदांत्र) तक ही सीमित हैं । इसलिए, GvHD-समीपस्थ बृहदांत्र के प्रभाव से जुड़े और भी छोटी आंत डिफ़ॉल्ट रूप से मूल्यांकन से बाहर रखा गया है, यह दर्शाता है कि वैज्ञानिक सवाल GvHD के छोटे आंत्र phenotype पर ध्यान केंद्रित इस दृष्टिकोण से लाभ नहीं होगा । दूसरा, हालांकि सूजन आंत्र GvHD की पहचान सुघड़ सुविधाओं में से एक है, अतिरिक्त विशेषताओं, आंत्र उपकला कोशिकाओं की वृद्धि हुई apoptosis दर और आंतों तहखाना वास्तुकला का एक नुकसान की तरह, अक्सर पाए जाते हैं और आंतों GvHD स्कोरिंग और एलो-HCT रोगियों में पैथोलॉजिस्ट द्वारा ग्रेडिंग अंतर्निहित histopathological कार्यप्रवाह में शामिल. यहां, हम प्रतिबंधित histopathologically सूजन के आकलन के संकेत के साथ मिनी endoscopically आकलन आंत्र GvHD स्कोर को संबद्ध । इस दृष्टिकोण को लेकर, हम निष्कर्ष है कि colonoscopic स्कोरिंग में एक निश्चित सीमा के ऊपर बृहदांत्र सूजन मज़बूती से उदारवादी-उच्च ग्रेड सूजन की उपस्थिति की भविष्यवाणी है, के रूप में histopathological गुजाइश विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन करने के लिए आया था । हालांकि, भविष्य के अध्ययनों की जांच कैसे, उदाहरण के लिए, histopathologically मूल्यांकन apoptosis दरों मिनी इंडोस्कोपिक कुल राशि स्कोर करने के लिए या करने के लिए संबंधित की जरूरत है, उदाहरण के लिए, चार व्यक्तिगत मापदंडों में से एक योग स्कोर में एंबेडेड । तीसरा, जबकि चूहों histopathologically उदारवादी से पीड़ित उच्च ग्रेड GvHD आसानी से इंडोस्कोपिक स्कोरिंग दृष्टिकोण से पहचाना जा सकता है, आंतों की सूजन के अधिक सूक्ष्म लक्षण के साथ चूहों वर्णित दृष्टिकोण से याद किया जा सकता है, इस तथ्य को देखते हुए कि histopathological स्कोरिंग नहीं चूहों के समूह में सूजन के हल्के लक्षण की उपस्थिति से पता चला HCT अकेले, alloreactive दाता लिम्फोसाइटों के प्रत्यारोपण के बिना । जैविक रूप से, इस खोज संभव हो सकता है, के बाद से नहीं चूहों allotransplanted गया है, और ंयूनतम कोलाइटिस, वास्तव में, अस्थि मज्जा सेल अंश या पुनर्गठन से टी कोशिकाओं की एक अपूर्ण हटाने के कारण GvHD के निंन स्तर की उपस्थिति को प्रतिबिंबित समय के साथ अस्थि मज्जा से alloreactive टी कोशिकाओं. भविष्य के अध्ययन के लिए और अधिक विस्तार में इन सवालों के पते की जरूरत है । चौथा, औपचारिक रूप से, इस प्रोटोकॉल पूरी तरह से स्थापित आंत्र GvHD-जुड़े कोलाइटिस पर केंद्रित है । हालांकि, के रूप में दिखाया गया है और पहले प्रकाशित, 15 दिन के आसपास कोलाइटिस की शुरुआत endoscopically का पता लगाया जा सकता है और11quantitated । यहां, GvHD-प्रवण चूहों स्पष्ट रूप से नहीं चूहों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है जिसमें कालोनी phenotype केवल विकिरण प्रेरित ऊतक क्षति के अवशिष्ट लक्षण के कारण हो सकता है या, बल्कि, विकिरण11के बाद श्लैष्मिक वसूली प्रतिक्रिया दर्पण. हालांकि, भविष्य के अध्ययन के लिए इंडोस्कोपिक मूल्यांकन सहसंबंधी और GvHD-प्रवण चूहों के विस्तृत histopathological विश्लेषण पर उद्देश्य के लिए पहले समय बिंदुओं पर चूहों पर नियंत्रण की तुलना में की जरूरत है ।

अंत में, एक दिलचस्प, उपयोगी जोड़ें आंत्र GvHD के इंडोस्कोपिक स्कोरिंग के आवेदन पर इंडोस्कोपिक काम चैनल के उपयोग के लिए एक छोटी सी बायोप्सी बृहदांत्र में पसंद की शारीरिक संरचना के लिए संदंश प्रत्यक्ष है । यह सुविधा अंतर्निहित विकल्प का एक प्रकार के रूप में प्रदान करता है, संभावना को देखने के लिए निर्देशित ऊतक बायोप्सी कि आगे histopathology की तरह बहाव तकनीकों की एक श्रृंखला द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, और वास्तविक समय पीसीआर के जीन का विश्लेषण ब्याज. हालांकि, भविष्य के अध्ययनों को औपचारिक रूप से आकलन करने की जरूरत है कि क्या, उदाहरण के लिए, histopathological स्कोरिंग और endoscopically लिया बायोप्सी की ग्रेडिंग परंपरागत रूप से लिया नमूनों पर आधारित histopathological परिणाम के बराबर हैं (यानी, euthanized से चूहे) ।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल के साथ प्रेरण और इसकी मिनी-आंतों GvHD के इंडोस्कोपिक मूल्यांकन का वर्णन, हम एक पद्धति प्रदान करने के लिए मूल्यांकन, स्कोर, और एलो-HCT के एक प्रासंगिक murine GvHD मॉडल प्रणाली में ग्रेड आंत्र GvHD । इंडोस्कोपिक आकलन एक ही माउस में समय के साथ एकाधिक समय बिंदुओं पर दोहराया जा सकता है, चूहों euthanize आंतों GvHD-जुड़े ऊतक विकृति का आकलन करने के लिए की जरूरत को नष्ट करने (जैसे, एक चिकित्सीय सेटिंग में). मिनी इंडोस्कोपिक स्कोरिंग परिणाम बृहदांत्र में आंतों की सूजन के histopathological आकलन द्वारा प्राप्त परिणामों के तुलनीय साबित और प्रणालीगत GvHD गतिविधि के साथ अच्छी तरह से संबद्ध । साथ ही, इस कार्यविधि को व्यू-गाइडेड बायोप्सी के माध्यम से एंडोस्कोप के कार्यशील चैनल के माध्यम से संयोजित किया जा सकता है । अंत में, तथापि, भविष्य के अध्ययन के लिए कितनी दूर histopathologically निर्धारित रूपात्मक सूजन के अलावा अंय सुविधाओं का आकलन है, कि अक्सर आंत्र GvHD प्रभावित घावों में पाए जाते हैं, इस के साथ प्राप्त परिणामों से संबंधित मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन और स्कोरिंग दृष्टिकोण ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह अध्ययन सहयोगी अनुसंधान केन्द्रों (सीआरसी) २२१ (सीआरसी/TR221-DFG, #324392634; परियोजना B03) (K.H. को) और सीआरसी ११८१ (सीआरसी-DFG, परियोजना B05) (K.H.), दोनों ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS ) Sigma-Aldrich Co. LLC. D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) Fine Science Tools 11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) Fine Science Tools 14090-09
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich Co. LLC. R8758-500ML 
Hypodermic needle (26 G) B. Braun Melsungen AG 4657683
1 mL syring B. Braun Melsungen AG 9166017V
50 mL tube Sarstedt Ag & Co.KG 62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen BD Falcon 352340
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma-Aldrich Co. LLC. 11209 ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) Carl Roth GmbH & Co.KG 8043.2 ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3) Merck KGaA 1,048,540,500 ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-049-101 magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-095-130 magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) Biolegend 109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) Biolegend 100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) Biolegend 100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) Biolegend 110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) Biolegend 100714
Filtrated bovine serum  Pan Biotec P40-47500 ingredient of FACS buffer 
96-well polystyrene V-bottom plates Greiner Bio-One 651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) Falcon 352052
BD LSRFortessa II flow cytometer BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G) BD 324826
Oxy Vet Oxymat 3 Eickemeyer oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet  Eickemeyer 213062
Plexiglass chamber  Eickemeyer 214620
Straight Forward Telescope KARL STORZ SE &Co KG 64301 AA part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath KARL STORZ SE &Co KG 61029 C part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel KARL STORZ SE &Co KG 61029 D part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps KARL STORZ SE &Co KG 61071 ZJ  part of the experimental setup for colonoscopy
 175 Watt SCB XenonLight Source KARL STORZ SE &Co KG 20132120 part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable KARL STORZ SE &Co KG 495 NL part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head KARL STORZ SE &Co KG 22220030 part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit KARL STORZ SE &Co KG 22200020 part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor Olympus OEV181H part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran AbbVie Inc.  B506
Formaldehyde solution 37 % Carl Roth GmbH & Co.KG 7398.1
5.0 mL Dispenser tip  Eppendorf AG 30089456

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
  2. Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
  3. Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, Suppl 2 58-64 (2008).
  4. Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
  5. Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
  6. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  7. Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).
  8. Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
  9. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
  10. Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).
  11. Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
  12. Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४४ रुधिर गैस्ट्रोएंटरोलॉजी इम्यूनोलॉजी allogeneic टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण कोलाइटिस आंत्र GvHD एंडोस्कोपी श्लैष्मिक सूजन जठरांत्र संबंधी मार्ग histopathology
आंतों भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग और अपने लाइव चूहों में मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन की प्रेरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchele, V., Büttner-Herold,… More

Buchele, V., Büttner-Herold, M., Vogler, T., Neurath, M. F., Hildner, K. Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice. J. Vis. Exp. (144), e58871, doi:10.3791/58871 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter