Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 描述异基因造血干细胞移植, 并允许重复的微内窥镜评估远端结肠原位的存在, 特点, 和严重程度的结肠炎症在生活患有肠道移植物抗宿主病的小鼠。
Abstract
急性移植物抗宿主病 (gvhd) 是最严重的并发症, 患者以前接受异基因造血干细胞移植 (allo-hct) 的脸, 并经常与不良的临床结果。例如, 皮肤的 gvhd 表现通常对既定的免疫抑制疗法有反应, 因此, 没有采取致命的过程, 肠道 gvhd 的存在和强度, 特别是肠道的中下部,治疗方案基本上仅限于传统的免疫抑制剂, 只对轻度疾病的缓解作用。因此, 迫切需要详细了解组织驻场免疫级联、肠道微生物群的变化以及肠道 gvhd 发病前、肠前和肠道后的基质反应, 以了解其组织居民免疫级联的事件和机制。并开发创新的治疗方案。小鼠模型的 gvhd 经常被用来识别和功能评估分子和途径, 假定驱动肠道 gvhd。然而, 随着时间的推移, 专门监测和评估肠道炎症的手段基本上是缺乏的, 因为评估和评分急性 gvhd 的既定分数通常是由各种参数, 而反映了系统性 gvhd表现。肠道 gvhd 的详细评估仅限于使用安乐死小鼠的研究, 因此基本上排除了在特定实验条件下 (例如抗体介导) 结肠室的纵向 (即动力学) 分析在活小鼠 (即体内) 中阻断促炎细胞因子。这里描述的对所有 hct 治疗小鼠远端结肠的微型内镜原位评估允许: (a) 对肠道炎症的不同方面进行详细的宏观评估, b) 收集组织样本进行下游分析的选项, 可在观察期间的不同时间点。总体而言, 微型内窥镜方法为临床前无创监测和评估肠道 gvhd 提供了一项重大进展。
Introduction
造血恶性肿瘤直接产生的造血干细胞室和不受控制的, 快速进展, 和严重的免疫介导的疾病往往是迹象, 执行全环 hct1,2。然而, 尽管考虑到预后有益的移植物抗肿瘤反应的发生, 供体淋巴细胞经常诱导和促进不需要的免疫介导的攻击健康组织成分在所有 hct 受者, 一个被称为移植物抗宿主病3的过程.肠道中的表现, 即所谓的肠道 gvhd, 是急性 gvhd 最可怕的并发症, 其严重的形式通常与高死亡率1,2,4有关。
总体而言, 小鼠的全聚 hct 模型已成为识别和研究免疫介导机制的宝贵工具, 其发病机制的 gvhd5。然而, 动态评估, 例如, 随着时间的推移, 新的治疗干预措施的有益效果活小鼠通常是基于临床 gvhd 分数6的测定。虽然这些分数适合反映, 例如, 整体疾病负担 (即系统的 gvhd), 临床得分缺乏敏感性, 以可靠地反映器官特定的表现 (例如,在肠道)。因此, 例如关于特定治疗干预措施的肠道保护作用的结论, 以这些评分系统为基础, 通常是不够的。
尽管通过发明新的全身成像模式, 结合生物发光或荧光遗传小鼠模型7,8的结合, 直接和具体的方法取得了重大进展活鼠肠道 gvhd 的评估缺乏。因此, 下一节描述的肠道 gvhd 表型内窥镜评估协议背后的理由是克服这一障碍。此外, 动机还包括减少实验小鼠的数量, 因为到目前为止, 对肠道 gvhd 的细胞、形态和分子特性 (例如,通过组织病理学或分子生物学) 进行了详细评估显化最终需要实验小鼠的牺牲。
我们的机构以前曾报告过在同一性结肠炎模型9 过程中对结肠表现进行小型内镜评估的方法。在这里介绍的协议中, 我们在 mhc 类的 mhc i 中移植同种异体 hct 和供体淋巴细胞后, 对肠道 gvhd 活小鼠的同种异体引起结肠炎的结肠镜评分矩阵进行了细化和调整.我们确定了四个参数, 适合反映肠道 GvHD-related 相关的结肠病变。此外, 我们还建立了一个系统, 允许对任何单个行列式进行微调分级, 从而产生一个新的分数, 很容易通知读者在给定时间点存在的肠道 gvhd 的严重程度。病理组织学分析证实, 超过一定阈值的内窥镜评分可靠地预测中、高级组织炎症。因此, 迷你内窥镜评估似乎是金标准组织病理学的有效替代品, 通常需要实验小鼠的牺牲。重要的是, 该协议几乎可以在任何特定的时间点应用, 并可在疾病发生过程中反复使用, 10、11.此外, 与使用与生物照明有关的方法不同的是, 不需要像转基因小鼠交叉这样的劳动密集和耗时的措施, 因此, 该方法几乎可以应用于任何小鼠。兴趣。
综合来看, 鉴于严重肠道 gvhd 患者的临床观点是有害的, 因此迫切需要快速的科学进步和对免疫发病机制背后的分子机制的更深入的了解。同样, 重要的、合乎道德的考虑要求, 应通过使用最少数量的实验小鼠来获得知识。因此, 通过在实验工作链中对结肠进行连续的微内窥镜评估, 对活体实验小鼠的肠道 gvhd 进行监测和分级, 可以提高研究界探索肠道 gvhd 的公认说法。模型, 如本文中提供的协议中所述和验证。
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Protocol
这里描述的实验方法已经得到了德国巴伐利亚的密特弗兰肯政府的批准。
1. gvhd 感应
- 第0天: 受体细胞小鼠的全身照射
- 使用女性 cd45.2+ h2kd+ balb1 小鼠, 这些小鼠至少有10周大的幼鼠作为受者。
- 在 gvhd 诱导前称量并记录受体细胞的体重。
请注意:确保受者的最小体重为20克。起始体重将作为计算单个鼠标在 gvhd 诱导和进展过程中的减肥的参考值。 - 将最多五个小鼠放置在 x 射线辐照器的容器中。
- 用8戈瑞的单剂量 x 光照射小鼠。使用 c137作为辐射源。
- 第1天: 用 t 细胞耗尽骨髓重建辐照小鼠
注意：如第1.2 节所述和详细的, 同种异体骨髓细胞的移植应在照射后24小时内进行。在无菌组织培养罩中执行下面描述的过程, 并使用过滤后的试剂。使用同种异体 cd45.-半 5.1 b6。sjl-Ptprca Pepcb/boycrl 小鼠作为 t 细胞耗尽骨髓的捐献者。- 安乐死 cd45. 半 5.1 b6。sjl 小鼠将按照机构指南捐献异基因骨髓细胞, 在接受者 balb1 对小鼠进行照射后12-24小时。为此, 麻醉 cd45. 半5.1b6。sjl 小鼠吸入5% 异氟醚。呼吸后1分钟以上继续接触异氟醚, 并确认颈椎脱位实施安乐死。
- 用70% 乙醇彻底消毒小鼠的皮毛和皮肤。
- 将鼠标放置在干净的工作鞘上, 使鼠标处于俯卧位置, 其后腿面向实验者。提起在阿基里斯的脚后跟的毛皮与一个 semken 钳的尖端, 长度为13厘米和锯齿弯曲的尖端。用深部的剪刀切开钳子和脚后跟之间的皮肤, 并有直的尖端。
- 伸长切口颅骨 (即, 从脚后跟在小腿和大腿到臀部区域)。借助钳子, 从后肢中取出皮肤和毛皮。
- 在其他后肢上执行相同的操作。
- 通过切开相邻的髋关节来切除后肢。
- 剪掉后爪。穿过膝关节。将每个后肢的大腿和小腿放在一个92毫米的培养皿中, 其中充满了磷酸盐缓冲的盐水 (pbs) 溶液。
- 通过从每个大腿和小腿中取出尽可能多的肌肉组织, 仔细清洁股骨和胫骨。将股骨和胫骨转移到一个充满无菌 rpmi 1640 培养基的50毫升管中, 并将其放置在湿冰上, 直到1.2.7 的步骤收集的所有胫骨和股骨骨骼从肌肉组织中清洗。
- 要分离骨髓, 一次将一个股骨或胫骨 (如步骤1.2.8 所述进行了清洁) 从50毫升管转移到充满 rpmi 1640 介质的培养皿 (直径为92毫米)。用手术刀切断股骨或胫骨的两端, 进入包含骨髓的骨头的腔。
- 准备一个50毫升的收集管与 rpmi 1640 介质5毫升。将连接在装有1毫升 rpmi 1640 介质的 1 ml 注射器上的 26 g 针插入骨腔, 然后通过推柱塞将骨髓从腔中冲洗到收集管中。
- 重复步骤 1.2.10, 直到骨骼出现光和光泽 (即, 骨腔明显没有红色的骨髓)。丢弃空骨。
- 重复步骤 1.2.9-1.2.11, 使用步骤1.2.8 的所有股骨和胫骨, 并从步骤1.2.10 收集相同的50毫升收集管中的所有恢复的骨髓块。将收集管放在湿冰上, 直到从步骤1.2.8 的所有骨骼都得到相应的处理。
- 通过轻轻地将通红的、可碎的骨髓碎片上下移液来创建单细胞悬浮液。通过放置在新的50毫升收集管上的40μm 网状筛网滤网过滤器过滤骨髓单细胞悬浮液。
- 在4°c 条件下, 以 450 x g 的速度离心包含骨髓单细胞悬浮液的50毫升收集管5分钟。放弃上清液。
- 在5毫升的 ack 裂解缓冲液中重新弹性颗粒 (1 mLna 2edta; 10 mm khco3; 144 mm nh4 cl;ph 7.2) 进行红细胞裂解。在室温下将细胞悬浮液孵化3分钟。然后, 立即在细胞悬浮液中加入10毫升的 pbs 溶液。
- 在4°c 条件下, 以 450 x g 离心悬浮液5分钟。放弃上清液, 在 pbs 溶液的2毫升中重新悬浮细胞。
- 用血细胞仪计数骨髓细胞。保留 6 x10 6 细胞的 aliquot 进行流式细胞仪分析, 以检查细胞纯化后细胞的纯度 (参见步骤 1.2.20)。
- 对于骨髓单细胞悬浮液中 t 细胞的耗尽, 请使用市售的细胞纯化试剂盒。按照制造商的协议, 从骨髓细胞中神奇地耗尽 cd90.2+细胞 (即淋巴细胞)。
- 使用血细胞仪, 数一数已被分离的 t 细胞耗尽骨髓细胞, 如步骤1.2.18 中所述。保留 1 x 106 细胞的 aliquot, 以便以后进行流式细胞术分析, 如步骤1.2.20 中所述。
请注意:一只供体小鼠的平均细胞产量通常为 2 x 10 7至 3.4 x 10 7 t 细胞耗尽骨髓细胞。 - 流式细胞仪成功地确认 t 细胞耗尽。染色 1 x 106 细胞, 从步骤保存 1.2.17 (磁性细胞分离前的骨髓细胞) 和 1.2.19 (t 细胞耗尽的骨髓细胞在磁性细胞分离后), 具有以下抗体: α-cd45.1 (a20), α-cd3 (17a2), α-cd4 (α-cd4) (gk1.5) 和α-cd8α (53-6.7)。使用步骤1.2.17 的剩余细胞作为未染色控制和单染色控制, 以建立流式细胞仪。
- 将每个样品中的 1 x10 6个细胞转移到具有 v-底部的96孔板的井中, 以执行流式细胞仪染色过程。
- 在4°c 下, 以 450 x g 的速度向下旋转96孔板 (步骤 1.2.20.1) 内的细胞5分钟。丢弃上清液, 在100μl 的流式细胞仪缓冲液中重新悬浮细胞 (pbs 补充3% 经过过滤的牛血清)。
- 在4°c 条件下, 以 450 x g的速度离心96孔板内的细胞5分钟。放弃上清液。
- 在单次染色单μl 的流式细胞仪缓冲液中添加适当数量的所选抗体 (与步骤1.2.20 比较)。
- 准备一个混合物的所有抗体 (主混合) 包含适当的量, 足以单独染色骨髓细胞的热量保存从以前 (见步骤 1.2.17) 和之后 (请参阅步骤 1.2.19) 磁性 t 细胞耗尽。在两个等价物中加入100μl 的主混合物。
- 在未染色的样品中只添加100μl 的流式细胞仪缓冲液。
- 在黑暗中的4°c 下, 将96孔板内的细胞培养20分钟。
- 加入100μl 的流式细胞仪缓冲液, 并在4零3°c 下将96孔板内的细胞在 450 x g 处离心5分钟。丢弃上清液, 并在100μl 的流式细胞仪缓冲液中重新悬浮细胞。
- 在4°c 条件下, 以 450 x g 离心细胞5分钟。丢弃上清液, 在250μl 的流式细胞仪缓冲液中重新悬浮细胞。
- 将样品转移到5毫升聚苯乙烯圆底管, 并使用流式细胞仪对其进行分析, 该仪器能够检测用于标记用于表征细胞样品的抗体的荧光分子 (参见步骤 1.2.20)。
- 比较磁性细胞分离前后的细胞组成。
请注意:通常在活门内达到大约 95% cd45.1+cd3- (即 t 细胞耗尽的骨髓) 细胞的纯度。
- 用 pbs 溶液 (4零1xg, 4°c 时 5分钟) 清洗 t 细胞耗尽的骨髓细胞悬浮液 2倍, 最后将 pbs 溶液中的细胞重新悬浮, 将细胞浓度调整为 5 x 107 细胞。将细胞放在湿冰上, 直到注射。
- 将 t 细胞耗尽的骨髓细胞注入接受者小鼠体内, 这些小鼠在前一天接受了照射 (见第1.1 节)。
- 将实验小鼠放置在防漏室中, 吸入高达4% 的异氟烷, 诱导麻醉, 直到小鼠不省人事。通过测试右转反射的损失和踏板退出反射的随后损失, 确认镇痛和意识的丧失。
- 使用装有 30 g 针的1ml 注射器将含有 pbs 的 pbs 溶液的 5 x 10 6 t 细胞耗尽骨髓细胞 (即 100μl 5x10 7 cellsl ) 注入含有静脉窦的后球状空间。
- 第2天: t 细胞的转移
请注意:在无菌组织培养罩中执行下面描述的过程, 并使用过滤后的试剂。使用 cd45.2 c57bl6 (野生型;(wt) 小鼠作为同种异体 t 细胞的捐献者。利用保生标记系统可以区分受者 (cd45.2+ h2kd+ Balb/c Balb/c----和捐献者造血细胞类型 (骨髓细胞: cd45.1+ H2kd+ b6)。sjl 小鼠;同种异体 t 细胞: cd45.2+ h2kb+ c57b bl6 小鼠)。- 根据适用的机构准则和权限对 c57bl过来6只小鼠进行安乐死。因此, 用5% 异氟烷的浓度吸入麻醉小鼠。继续接触异氟烷, 直到呼吸停止后 1分钟, 并确认通过宫颈脱位安乐死。用70% 乙醇彻底消毒小鼠的皮毛和皮肤。
- 将带有40微米网屏的过滤器放置在50毫升的收集管上。取下脾脏, 放在过滤器上。
- 用注射器柱塞, 在滤网中粉碎脾脏。用 pbs 清洗过滤器和注射器柱塞, 收集所有的脾细胞。
- 在4°c 条件下, 以 450 x g的速度离心50毫升收集管内的细胞5分钟。放弃上清液。
- 在3毫升的 ack 裂解缓冲液中重新移植脾细胞, 使红细胞裂解。随后将细胞悬浮液加氢 3分钟, 加入10毫升的 pbs, 并在4°c 下将细胞以 450 x g离心5分钟。丢弃上清液, 重新悬浮 pbs 中的脾细胞。
- 用血细胞仪计数脾脏细胞。将 6 x 10 6 细胞的等值转移到流式细胞仪分析中, 以评估步骤1.3.9 的纯化幅度。
- 对于从总脾细胞中分离出的 cd3+ t 细胞, 请使用市售的细胞纯化试剂盒。按照制造商的协议隔离脾 t 细胞。
- 使用血细胞仪, 数一数按照步骤1.3.7 中所述分离的脾脏 cd3+ t 细胞。保留 1 x10 6 t 细胞的等值用于流式细胞仪分析。
请注意:通过磁性细胞分离分离的每只供体小鼠脾脏 t 细胞的平均产率范围为 1.3 x 10 7 至 2 x 107 细胞。 - 流式细胞仪证实 t 细胞分离的成功。有关染色协议的详细说明, 请协商并遵循 1.2.20.1-1.2.20.10 的步骤。
- 染色 1 x10 6 步数的分化细胞 1.3.6 (磁细胞分离前) 和 1.3.8 (磁细胞分离后) 与以下抗体: α-cd45.2 (104)、α-cd3 (17a2)、α-cd4 (gk1.5) 和α-cdα (537-6.7)。
- 使用步骤1.3.6 的剩余细胞作为未染色控制, 并与相应的抗体进行一次染色, 以建立流式细胞仪。
- 比较磁性细胞分离前后的细胞组成。
请注意:应在淋巴细胞活门内的 cd45.2+cd3+ t 细胞中达到≥95% 的纯度。
- 用 pbs 清洗 t 细胞 2倍 (450 x g在4°c 下 5分钟), 最后在 pbs 溶液中重新悬浮细胞, 将细胞浓度调整为 7 x10 6细胞。将细胞放在冰上, 直到注射。
- 将同种异体的脾脏 t 细胞 (见步骤 1.3.10) 注入此前接受过 cd45.1+ t 细胞耗尽骨髓细胞的辐照 balbe 小鼠 (见步骤 1.2.22)。
- 通过将实验鼠标放置在防漏室中, 在该室内接触多达4% 的异氟醚, 直到失去意识, 从而产生麻醉效果。通过测试右转反射的损失和踏板退出反射的随后损失, 确认镇痛和意识的丧失。
- 使用装有 30 g 针的1毫升注射器 (即含有 pbs 溶液 的 100μl 7 x 6 cellse/ml) 的1毫升注射器 (见步骤 1.3.10), 静脉注射到反球杆中小鼠的空间, 诱导 gvhd. 将这些小鼠作为实验组。
- 仅将100μl 的 pbs 注射不同的小鼠, 静脉注射到反球层空间, 并将该组命名为对照组, 随后称为 "无 t 细胞移植 (ot) 小鼠"。
2. 系统 gvhd 评估
请注意:在一个半无菌的环境中, 在动物设施内获得处理活鼠许可和装备的实验室中执行此过程。
-
遵循 gvhd 在单个小鼠中的临床过程;具体而言, 评估和评分实验小鼠每周3倍的临床 gvhd 症状的存在, 根据下面描述的评分系统, 并根据以前建立的评分系统库克等人.
- 根据实验开始前确定的体重 (相当于 100%), 在第0天 (步骤 1.1.2) 分别称重、记录体重并计算出特殊的体重减轻。在0级的体重下降低于起始重量的 10%, 在1级的体重减轻10% 至25% 之间, 在3级的体重减轻超过25%。
- 得分每只老鼠的活动水平, 区分活动水平正常的小鼠 (评分 = 0) 的小鼠, 其中活动水平略有下降 (评分 = 1), 小鼠的活动水平保持不变, 除非它们受到外部刺激 (评分 = 2)。
- 得分毛皮纹理, 从而区分正常的, 有光泽的, 和杂乱的毛皮 (得分 = 0) 从适度褶皱毛皮 (分数 = 1) 和秃顶斑点的存在 (分数 = 2)。
- 得分的皮肤纹理, 区分正常皮肤 (评分 = 0) 从零星的斑点缩放皮肤 (例如, 在尾巴和爪子) (得分 = 1) 和明显的缩放和皮肤疼痛的区域 (分数 = 2)。
- 分析分泌大便分数的一致性。与等级为0的得分凳子 (即硬一致性), 大便与1级畸形和软的凳子, 大便没有任何一致性, 因此, 与2级严重腹泻。
- 将所有单独得分的参数汇总为每只老鼠12分的最高临床得分。
- 根据应用机构指南和授权的动物协议, 考虑和评估由于单个小鼠目前的疾病严重程度而停止实验的标准。
3. 肠道 gvhd 的评估
- 大肠远端区微内窥镜对 GvHD-related 相关病变的评分
注意：在动物设施内获得处理活鼠许可和装备的实验室的半稳定室中进行此操作。使用一个小型内窥镜工作站, 批准用于小动物的使用。- 准备内窥镜装置, 方法是用内窥镜检查护套覆盖望远镜 (直径1.9 毫米, 长度为10厘米)。用水和乙醇对内窥镜进行清洁和消毒。
- 打开计算机、可调节的氙气光源和相机模块, 并以靠近镜头的物体给出清晰图像的方式设置焦点。
- 将空气泵连接到内窥镜护套。要显示气流, 请将内窥镜的尖端浸入盛满水的烧杯中。通过调节空气泵和内窥镜护套之间的阀门来调节气流。将其调整为缓慢的、恒定的气流, 由几个不断上升的气泡反射。
- 将鼠标放入防漏室。吸入高达4% 的异氟醚, 直到小鼠不省人事, 才会产生麻醉。通过测试右转反射的损失和踏板退出反射的随后损失, 确认镇痛和反射的缺失状态。
- 根据所使用的动物协议, 使用合适的兽医麻醉机。将鼠标从腔内转移到结肠镜检查工作区。在这里, 将麻醉鼠标的鼻子放置在 nosecone (与麻醉仪器相连) 上, 放在干净的工作鞘上, 使鼠标处于俯卧位置, 面对实验者的后肢。
- 为了在结肠镜检查过程中保持麻醉, 将异氟醚浓度降低到约2%。在结肠镜检查过程中监测小鼠的呼吸和对刺激的反应, 并在必要时调整蒸发器上的异氟醚浓度。用药膏捂住老鼠的眼睛, 防止它们变干。
- 通过夹住小鼠的脚趾来控制麻醉的效果。在没有反应的情况下, 继续执行步骤3.1.8。
- 用一只手将尾巴抬起尾根上方, 并通过肛门将内窥镜仔细插入, 并将其放置在另一只手的内窥镜中插入直肠。
- 当气流膨胀结肠直肠腔时, 缓慢而仔细地将内窥镜向前移动到流产的方向。
- 将内窥镜放在结肠腔的中间, 并保持此位置, 以尽量减少与结肠壁的接触, 并避免划痕、更深层次的与墙壁有关的伤害 (例如, 导致出血), 甚至墙体穿孔 (请参见步骤 3.1.17).通过永久观看视频流 (即在结肠隔间的不断可视化下) 来控制此步骤。
- 如果粪便限制视图, 取下内窥镜, 并通过直肠冲洗与高达2毫升的盐水, 使用柔软的巴斯德移液器进行灌肠。使用尽可能少的液体, 以防止意外稀释粪便和其他次要影响对粘膜表面的特性, 并最终, 评分结果。
- 尝试定期将内窥镜放置在远端结肠内的一个定义 (即不同的) 解剖部位, 以规范结肠炎症的评分, 并优化小鼠之间和整个实验之间评分结果的可比性。
请注意:通常情况下, 使用刚性内窥镜, 可以通过直肠通道达到4厘米的最大深度。在2至4厘米的时间里, 结肠经常变成弯曲, 不能用刚性结肠镜传递。使用与弯曲远端相邻的冒号区域作为默认评分点。 - 开始录制视频流, 并从炎症得分开始。
- 通过打分表1和图 3中解释和描述的参数来评估结肠与 GvHD-related 相关的炎症。
- 在得分点轻轻移动内窥镜, 稍微向后和向前移动, 以评估不同的参数。
- 通过将内窥镜定位在相对于结肠壁的更远距离来评估参数 "半透明" 以及 "大便一致性"。
- 通过将内窥镜放置在靠近结肠壁的位置来评估参数 "粒度" 和 "血管"。对于这个任务, 小心地应用剂量良好的张力与内窥镜的尖端的结肠壁。
- 评分过程完成后, 停止录制。
请注意:之后, 录制的视频剪辑可以全部使用或用于生成代表性图像 (即截图) 的迷你内镜评估标准总体导致结肠炎症。 - 小心地取出内窥镜。
- 通过将鼠标转移到暴露在环境空气中的单独保持架, 停止异氟醚的解释。用红灯温暖鼠标, 观察鼠标, 直到它从麻醉中恢复, 并恢复全意识。
请注意:由于内窥镜检查过程中结肠的空气膨胀, 小鼠的腹部区域可能会在手术后直接出现膨胀。虽然这是正常的, 也是短暂的, 但腹部出现了长时间的大规模甚至渐进膨胀的迹象, 老鼠恢复失败, 这可能表明结肠出现了意外的穿孔 (在这种情况下, 老鼠需要安乐死)立即)。 - 完全恢复后, 将鼠标放回各自的笼子。
- 可选方法: 也可以进行视导组织活检。执行以下步骤。
请注意:结肠镜检查将以与步骤3.1.1 中所述的相同方式进行-3.1.18, 并进行以下修改。- 在步骤3.1.1 中, 使用带有内置工作通道的内窥镜检查护套, 而不是没有工作通道的简单检查护套, 用于覆盖望远镜。将活检钳引入工作通道, 直到其尖端在视频屏幕的内窥镜前可见, 因为这在很大程度上可以防止意外的肠道损伤。
- 继续执行步骤 3.1.2-3.1.11。将内窥镜插入结肠, 并小心地将其推至感兴趣的地方。
- 利用第二个实验者的帮助进行结肠组织活检的任务。让第二个实验者将活检钳的尖端导航到所选择的结肠区域, 方法是将工作通道内的钳缓慢向前推进, 直到可以打开钳子的下颌。在此过程中不断观看视频流, 以最大限度地降低伤害结肠壁的风险。
- 通过小心地打开和关闭活检钳的下颚来恢复结肠壁组织样本。
请注意:请谨慎行事, 以防止结肠壁穿孔。在罕见的结肠穿孔的情况下, 立即牺牲受影响的老鼠, 根据机构的准则和在麻醉的持续管理下应用测量。 - 向后拉并将关闭的钳子移出工作通道。浸渍, 小心地晃动无菌 pbs 溶液中打开的钳子, 将标本从活检钳的下颚取出。随后, 根据计划的下游分析, 为组织样品选择合适的储存条件。用70% 乙醇消毒后, 钳子可能会被重新使用, 进行进一步的活检。
- 进行活检后, 取出内窥镜, 完成结肠镜检查, 如步骤 3.1.16-3.1.18 中所述。
- 组织病理学分析
- 在 x 射线照射后的第26天至第30天之间, 根据适用机构的指导原则和授权对所有 hct 受体小鼠实施安乐死。为此, 吸入5% 异氟烷麻醉小鼠。呼吸停止后继续接触异氟醚 1分钟, 并确认颈椎脱位的安乐死。用70% 的乙醇对小鼠的皮毛和皮肤进行彻底消毒。
- 打开腹腔, 取出结肠。将其转移到带有 pbs 的培养皿 (直径为92毫米)。
- 用 pbs 填充一个5毫升的分配器提示。在长度为13厘米的 semken 钳和锯齿弯曲的尖端的帮助下, 将结肠的远端部分 (约5毫米) 滑过分配器尖端。小心地固定结肠与钳子在分配器尖端和冲洗结肠与 pbs 按下分配器尖端的柱塞, 以删除粪便从肠道。
- 在手术刀的帮助下, 剪下一个距离肛门约5毫米的结肠段。
- 将切除的肠道标本在一夜之间固定在4.5% 的甲醛中。在将其嵌入石蜡之前, 请将组织置于直立的位置。
- 使用标准染色协议, 切割石蜡嵌入结肠组织的3μm 横截面, 并用血红素和 eosin (he) 染色。
- 准备结肠组织样本的 hee 染色横截面。
- 改编自 kaplan 等人报告的评分矩阵, 12 人, 组织病理学评分的炎症活性半定量, 评分从 0-3: 无炎症 (得分 = 0), 轻度炎症 (得分 = 1), 中度炎症 (评分 = 2),和严重炎症 (分数 = 3)。
请注意:理想情况下, 利用病理学家的专业知识, 谁是在评估小鼠肠道 gvhd 和盲目的性质的实验和控制组的病理学家。
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Representative Results
目前的协议, 描述了肠道内镜评估的肠道 gvd 相关病变的远端结肠, 已建立和验证的小鼠以前受到严重急性 gvhd 模型的系统诱导。在这项研究中, 我们使用 mhc 类完全不匹配的模型系统, 其中 balb1 小鼠进行了致命的辐照, 其次是 t-细胞耗尽的异基因骨髓的移植和 gvhd 诱导的异位反应 c57bl6 cd3 + 的给药t 淋巴细胞。采用磁选技术对 gvhd 诱导的 t 细胞耗尽骨髓细胞和脾脏 t 细胞进行纯化。这些细胞群的纯度是通过流式细胞仪确定的, 图1显示了纯化过程中的代表性结果, 显示了骨髓总细胞中 t 细胞的充分消耗和一致的富集。在转移到以前经过辐照的小鼠之前, 脾脏衍生的 cd3+ t 细胞。图 2中显示的临床过程表明, 在存在 (wt, 黑色) 与缺乏不活跃供体 t 淋巴细胞的情况下, 全时 hct 上对临床全身 gvhd 表型进行了可重现的有力诱导。cooke等人先前报告的评分系统。表示评估和分级六个参数的总和核心: 体重、姿势、活动、皮肤和毛皮纹理以及大便一致性 6。对照小鼠在第5天至第10天之间只经历了一个早期出现的临床评分高峰, 这在 t 细胞接收小鼠中也有类似的观察, 因此, 主要是由于与辐照相关的全身炎症反应。无论如何, 接受 t 细胞的供体小鼠的临床得分开始较早, 总峰值较高, 只是在最初达到高峰后短暂下降, 然后, 在剩余的时间里, 基本上又连续增加。实验。总体而言, 这些结果与 t 细胞接收小鼠与 not 小鼠相比表现出更强、更进步的全身性 gvhd 迹象的解释是一致的。
供体 t 淋巴细胞-接受全切-hct 小鼠表现出各种急性器官相关和全身 gvhd 表现的迹象, 总体上导致高和得分, 而对照小鼠缺乏中度至重度的影响, 特别是在后期。然而, 肠道 gvhd 的迹象是代表性不足的系统 gvhd 评分系统, 其中唯一评估的肠道相关参数是大便一致性。如表 1所示, 通过调整先前报告的评价标准, 定义了专门用于准确描述、评分和分级肠道 gvhd 相关病变的小型内镜评估标准同义性结肠炎到异位性驱动的结肠炎9的上下文。图 3显示了每个单独标准的典型示例, 说明了肠道 gvhd 相关病变的类型和程度, 从而可视化了在对远端结肠进行微内窥镜评估期间应用的分级矩阵。gvhd 易发小鼠在 mhc 类移植后, 我完全不匹配供体淋巴细胞。
图 4a显示, 肠道 gvhd 和评分结果是基于表 1定义的标准, 并显示在图 2中, 使实验者能够很容易地区分供体淋巴细胞接受小鼠有严重的肠道迹象从控制小鼠的炎症, 基本上是缺乏 gvhd。为了验证基于内镜的小型分级系统, 使用先前报告的微观分级系统12进行了组织病理学研究.图 4b 中的数据证实, 受 GvHD-related 相关炎症严重影响的小鼠结肠, 如结肠镜下的高总和得分所证明, 在组织病理学的情况下, 也显示出类似于强烈的炎症组织病理学迹象总分≥2后。相反, 对照小鼠的结肠组织没有 (得分 0), 最多显示轻度 (得分 1) 炎症的组织病理学症状, 这与几乎没有迷你内镜检测结肠炎的迹象是一致的。此外, 如图 4c, d所示, 进行了小型内镜和组织病理评估结肠炎活动与全身 gvhd 评分之间的相关研究。重要的是, 这些研究表明, 微型内镜下确定的总和分数≤3可靠地预测缺乏中至高等级 (即≥2) 肠道 gvhd 相关的结肠炎症评分获得的组织病理学分级。最后, 内镜下评估肠道 gvhd 的严重程度与全身 gvhd 活性有关。
图 1: 磁纯化 t 细胞耗尽骨髓细胞和异基因脾 cd3+ t 细胞的流动细胞计量质量评估.(a) 利用市售的纯化试剂盒, 通过磁分离实现 cd90.2+骨髓细胞的消耗。用流式细胞法测定 t 细胞耗尽骨髓细胞的纯度, 用 t 细胞耗尽前后用抗 cd45.1 和抗 cd3 染色细胞。显示了一个有代表性的实验的结果。(b) 采用市售的纯化试剂盒, 对脾脏 t 细胞进行了磁净化。采用流式细胞仪测定了 t 细胞分离前后样品的 cd45.2 和 cd3 的频率。显示了一个有代表性的实验的结果。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: gvhd 的临床过程, 采用 mhc 类 i 完全不匹配的模型.为了诱导急性 gvhd, 在第0天对 balb1 小鼠进行全身照射。24小时后, 小鼠接受了 t 细胞耗尽的骨髓细胞 (d1)。第2天, 小鼠注射异基因脾 cd3+ t 细胞 (野型 [wt];n = 9)。作为对照, 一些小鼠单独接受 t 细胞耗尽的骨髓 (无 t;n = 9)。这些小鼠每周被具体评估三次, 以了解 gvhd 临床症状的存在和严重程度。所显示的数据代表了从两个有代表性的实验中获得的所述治疗组单个小鼠的临床评分的平均值±sem。通过双向方差分析对数据进行了分析, 然后进行了邦费罗尼的多次比较后测试。p < 0.0001 被认为是重要的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 有代表性的图像, 说明通过对活体、异种 hct 处理的小鼠结肠进行的小内窥镜评估, 评估肠道 gvhdd 相关结肠改变的评分矩阵的评分示例.为了补充和说明表 1中使用的评分分级和系统的详细描述, 麻醉的结肠中所有参数的评估严重级别 (分级) 的代表性小型内窥镜图像,在图1所示之前, 在26天至30天之间经历全氢 hct 的活鼠将显示在这里。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 微内窥镜评分和分级的肠道 GvHD-related 相关的结肠炎症, 可靠地预测的高等级结肠炎的存在, 评估的组织病理学评分.(a) 如图 1所示, 在 gvhd 诱导后的第26天和第29天之间, 用微型内窥镜对活的麻醉小鼠肠道 gvhd 的表现进行评估。根据表 1和图 2所示的评分和分级系统对结肠变化进行评分和分级。有代表性的内窥镜图像的控制 (无 t 细胞; 诺 t) 和野生类型 (wt), t 细胞接收小鼠和迷你内镜评估评分 (上图) 显示。(b) 小内窥镜评估12周后, 对小鼠进行了牺牲, 并对结肠远端进行了处理和组织病理学评估。分级了远端结肠血红素和 eosin 染色横截面的炎症活性。显示了无 t 细胞和 wt t 细胞接受全切 hct 治疗小鼠远端结肠的血红素和 eosin 染色横截面的代表性和组织学评分。通过学生t检验对a和b面板中的数据进行了分析, 并将其显示为平均±sem * * * p < 0.0001。wt:n = 15; not:n = 15. 数据表示四个单独实验的集合数据。(c) 结肠镜检查评分与组织学评分的相互依赖性。数据显示为框图。每个印迹显示中值 (每个框中的黑线)、数据的范围 (从最小到最大) 和四分位数 (每个框的区域)。wt:n = 15; not:n = 15. 数据表示四个单独实验的集合数据。(d) 结肠镜评分与临床评分的相关性。对照分析包括对照和野生 t 型细胞接收小鼠。实线表示线性回归线。显示了斯皮尔曼相关系数 (r-值) 和p值。wt:n = 12; not:n = 13. 数据表示三个单独实验的集合数据。请点击这里查看此图的较大版本.
| 得分 | 0 | 1 | 2 | 3个 |
| 结肠墙体的半透明 | 肠道外、内脏器官 (如脾脏) 完全可见 | 结肠壁轻度不透明对肠外器官可见性的离散降低 | 结肠壁严重不透明对肠外器官可见性的适度降低 | 缺乏肠外器官的可见性, 即不透明的结肠壁 |
| 粒 度 | 光滑, 不受影响的粘膜表面外观;结肠密码像模式可见 | 黏膜表面的离散粗糙和鹅卵石外观 | 黏膜表面的适度粗糙和鹅卵石外观 | 黏膜表面的严重粗糙和鹅卵石外观;粘膜的坐垫状外观 |
| 血管 | 显示大、小血管交流网络的不变血管形态 | 血管形态的离散改变;容器模式似乎磨损 | 有些容器是看不见的; 有些容器是看不见的。不连续的船舶网络 | 接触诱导出血;像点状的血管模式 |
| 凳子的一致性 | 正常;凳子是硬的;粘液细线 在粪便和结肠壁之间可以观察到 |
凳子仍然是形状, 但可能包含粗糙的边缘;可变形与内窥镜的尖端 | 凳子柔软, 没有形状 凳子明显更加闪亮 (更高的含水量) |
大便松了, 有液体;水汪汪的腹泻。大便可以随机扩散到结肠的粘膜表面 |
表 1: 活体全氢 hct 治疗小鼠结肠肠道 GvHD-related 相关病变的微型内镜评分和分级矩阵.采用结肠镜检查, 用麻醉活鼠结肠结肠镜检查全 hct 预处理小鼠的内腔和经膜结肠形态的变化, 采用小鼠小型内窥镜系统。在内镜评分系统 (改良小鼠内镜结肠炎严重程度指数 [meics]) 的帮助下, 对结肠病变进行了分类, 该系统是从贝克尔等人报告的原始 meics 评分系统中推导出来的, 并适应了阿洛-hct。对远端结肠进行视觉评估, 以了解以下四个参数的存在和大小: 1. 内镜光 (半透明) 通过结肠肠壁的透射率, 如壁增厚;2. 粘膜表面显示内照导向黏膜表面的鹅卵石外观 (粒度);3. 改变血管的模式 (血管);4. 经内镜评估的大便在原位外观 (大便一致性)。每个参数的评分从 0 (无符号) 到 3 (最严重的表型), 加起来最大总和分数为每只老鼠12分。
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Discussion
该方案描述了诱导和微型内镜评估的结肠表型观察过程中的肠道 gvhd。它的作用更广泛的目的, 使科学家能够研究肠道 gvhd 纵向和非侵入整个疾病过程 (即, 从结肠表现和进展的开始, 直到最大的疾病活动)。
然而, 实验者在将技术应用于各自的科学背景之前, 需要注意所提出的方法所固有的一些关键步骤和重要限制。首先, 虽然我们已经成功地使用了微型内窥镜评估肠道 GvHD-related 相关结肠病变在一个小的组织相容性不匹配模型系统 11, 这里提供的协议目前只适用于 mhc类我完全不匹配急性 gvhd 模型。虽然 mhc 类 i 完全不匹配 gvhd 模型是常见的, 并且经常使用5, 它是公认的 gvhd 显化的特点是高度依赖于使用的鼠标子株, 因为这强烈影响, 例如,对辐照的敏感性。此外, 实验小鼠来源, 例如, 不同的组成肠道微生物群和使用的转移同种异体 t 细胞的数量可能会严重影响肠道 gvhd 显着12的动力学和动力学.因此, 一个关键的步骤是仔细测试和验证所指示的措施, 以确定它们成功诱导肠道 gvhd 的能力, 如图所示。
关于急性肠道 gvhd 的现场微型内窥镜评估的成功实施, 我们要强调的是, 虽然处理内窥镜很简单, 但可能需要一些培训, 以最大限度地降低经历最可怕的风险并发症 (即, 用刚性仪器与空气充气结肠的需要一起打孔肠壁)。由于炎症引起的脆弱性增加, 结肠组织的灵活性降低, 在吸虫恢复阶段 (即直到第10天) 和肠道完全表现后, 肠壁完整性可能会更大与 GvHD-related 有关的结肠炎 (即大约第25天之后)。然而, 重要的是, 我们没有观察到根据内窥镜的时间点显著增加并发症率, 只要内窥镜在足够的可见性下轻轻推进。相反, 我们发现次优药物剂量是一个危险因素, 因为麻醉深度不足可能导致实验小鼠发生不必要的身体运动, 并连续发生结肠壁穿孔事件。其次, 在评分过程中最关键的一步是在这个问题上的限制, 因为不需要的固体或液体 (如腹泻) 粪便在肠道腔, 因为实验者移动到得分位置的内窥镜。在这种情况下, 经常需要用柔性塑料移液器冲洗结直肠区域的盐水。但是, 由于此过程可能会影响几个参数 (例如大便一致性) 的评分准确性和特异性, 因此在评分时需要仔细考虑这一警告。
有几个限制限制解释和结论从这种内镜方法。首先, 通过直肠途径使用不灵活内窥镜的方法所固有的评估仅限于胃肠道 (即直肠和结肠远端) 的最后3-4 厘米。因此, 与 gvd 相关的近端结肠甚至小肠的影响默认情况下被排除在评估之外, 这表明侧重于 gvhd 小肠表型的科学问题不会从这种方法中受益。其次, 虽然炎症是肠道 gvhd 的标志性形态特征之一, 但经常会发现额外的特征, 如肠道上皮细胞凋亡率的增加和肠道隐窝结构的丧失, 并且包括在全肠 hct 患者肠道 gvhd 评分和分级的组织病理学工作流程中。在这里, 我们有限制性地将小型内镜评估肠道 gvhd 评分与组织病理学评估的炎症迹象联系起来。通过这种方法, 我们得出的结论是, 结肠炎症超过一定的阈值在结肠镜评分是可靠地预测的存在中度至高级炎症, 评估后组织病理学尸检。然而, 未来的研究需要调查, 例如, 组织病理学评估的细胞凋亡率如何与迷你内窥镜总和得分有关, 或与, 例如, 包含在总和分数中的四个单独参数之一有关。第三, 虽然患有组织病理学中度至中高级 gvhd 的小鼠可以很容易地通过内窥镜评分方法识别, 但鉴于以下事实, 有更微妙的肠道炎症迹象的小鼠可能会被忽略, 因为组织病理学评分显示, 仅在没有同种异体供体淋巴细胞移植的情况下, 仅经历全赫 hct 的诺特小鼠组就存在轻度炎症迹象。从生物学上讲, 这一发现可能是可行的, 因为没有小鼠已经进行了同种异体移植, 而最小的结肠炎确实可能反映出, 由于骨髓细胞部分的 t 细胞的去除不完全或重建, gvhd 水平较低。随着时间的推移, 骨髓中的同种异体 t 细胞。今后的研究需要更详细地解决这些问题。第四, 从形式上讲, 该协议的重点是完全建立的肠道 gvhd 相关结肠炎。然而, 正如之前所显示和发表的, 在第15天左右的结肠炎发病可以在内镜下检测和量化11。在这里, 易患 gvhd 的小鼠可以清楚地与 not 小鼠区分开来, 在这些小鼠中, 结肠表型可能完全是由于辐照引起的组织损伤的残留迹象, 或者, 相反, 反映了辐射 11后的黏膜恢复反应。然而, 未来的研究需要相关的内镜评估, 并旨在详细的组织病理分析的 gvhd 易发小鼠相比, 在早期的时间点控制小鼠。
最后, 肠道 gvhd 内窥镜评分的一个有趣的, 有用的附加应用是使用内窥镜工作通道, 以引导最小化的活检钳到结肠中选择的解剖结构。此功能提供了一种可选的构建, 可以进行视引导组织活检, 可通过一系列下游技术 (如组织病理学、免疫荧光染色和基因实时 pcr 分析) 进行进一步分析。兴趣。然而, 未来的研究需要正式评估, 例如, 内镜下活检的组织病理学评分和分级是否等同于基于常规采集样本 (即从安乐死中提取的) 的组织病理学结果小鼠)。
总体而言, 通过该协议描述肠道 gvhd 的诱导及其微型内窥镜评估, 我们提供了一种方法来评估, 评分和分级肠道 gvhd 在一个相关的小鼠 gvhd 模型系统的 allo-HCT。内窥镜评估可以随着时间的推移在同一只小鼠的多个时间点重复进行, 从而无需对小鼠进行安乐死, 以便对肠道 gvhd 相关组织病理学进行顺序评估 (例如, 在治疗环境中)。小内镜评分结果被证明是可与结肠肠道炎症的组织病理学评估所获得的结果相当, 并与全身 gvhd 活性密切相关。此外, 此过程可以通过内窥镜的工作通道与视图引导活检相结合。然而, 最终, 未来的研究必须评估在肠道 gvhd 影响的病变中经常发现的炎症以外的组织病理学形态学特征与由此获得的结果有多大的关系微型内窥镜评估和评分方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了合作研究中心 221 (CRC/TR221-DFG) 的支持, #324392634; 项目 b03) (至 k. h.) 和 crc 11181 (crc-dfg, 项目 b05) (至 k. h.), 均由德国妇女基金会 (德国研究基金会) 供资。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26 G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30 G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5.0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
References
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E.
- Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
- Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, Suppl 2 58-64 (2008).
- Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
- Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).
- Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).
- Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
- Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).
