腸管移植片対宿主病と生きたマウスのミニ内視鏡評価の誘導

Summary

ここでは、同種造血幹細胞移植を説明し遠位結腸の反復的なミニ内視鏡評価、存在、特性、およびライブ内で大腸の炎症の重症度をその場でプロトコルを提案します。マウス腸管移植片対宿主病に苦しんでいます。

Abstract

急性移植片対宿主病 (GvHD) は最も重篤な合併症が患者以前同種造血幹細胞移植 (同種 HCT) 顔を表します、頻繁に悪い臨床結果と関連付けられる。しばらくの間、例えば、皮膚 GvHD 症状は通常確立された免疫抑制療法に反応と致命的なコース、存在および腸の半ば-に-低部分の特に、腸管 GvHD の強度、したがってを取っていません。結果に強く影響、全体的な急性 GvHD。 治療選択肢を患者の生存率は中等度疾患を緩和する効果のみをもたらす古典的な免疫抑制剤に本質的に限られています。したがって、腸内細菌叢の変化組織住民免疫カスケードについての詳細な知識とイベントの基になるメカニズムを理解する前、及び腸管 GvHD 発症後に、間質反応が急務、病因と革新的な治療方法を開発します。GvHD のマウスモデルが頻繁に識別し、分子および推定腸管 GvHD を運転経路を機能的評価に採用します。評価し、グレードの急性 GvHD に確立されたスコアは日常的にむしろ全身 GvHD を反映するさまざまなパラメーターで構成されていますので具体的に監視し、時間をかけて腸内の炎症を評価する手段はない本質的に症状です。消化管 GvHD の詳細な評価は、それによって本質的に縦を除く、安楽死のマウスを用いた研究に制限されている (すなわち、キネティック) 与えられた実験条件下で結腸のコンパートメントの分析 (例えば、抗体炎症性サイトカインの封鎖) (すなわち、生体内) 生きているマウスで。ここで説明した同種 HCT 投与マウスの遠位結腸のミニ内視鏡その場で評価できます) 腸の炎症や b) 下流解析のための組織サンプルを収集するオプションのさまざまな側面の詳細な巨視的評価観察期間のコースを介して様々 な時間ポイント。全体的に、ミニ-内視鏡的アプローチは、臨床非侵襲的モニタリングおよび腸管 GvHD の影響評価の主要な進歩を提供します。

Introduction

直接造血幹細胞コンパートメントからと制御不能を生じた造血器腫瘍、急速に進んでいると重篤な免疫介在性疾患は、しばしば兆候同種 HCT^1,2を実行します。しかし、予後の有益な移植片対腫瘍反応の発生の会計処理がドナーのリンパ球がよく誘発・助長する同種 HCT 受信者内の健康な組織のコンポーネントの不要な免疫介在性攻撃、移植片対宿主病³を呼び出されるプロセス。腸、いわゆる腸管 GvHD の症状は、急性 GvHD、重度のフォームは、関連付けられ、高い死亡率^1,2,4の最も恐ろしい合併症を表しています。

同種 HCT の全体的なマウスのモデルは、識別や GvHD⁵病態免疫メカニズムを調査する貴重なツールとして浮上しています。ただし、運動評価の例えば、生きたマウスに時間をかけて新規治療の有益な効果は日常的に基づいて臨床 GvHD によるスコア⁶。これらのスコアが反映するように適切な例えば、全体的な疾病負担 (すなわち、全身の GvHD) 臨床スコア不足臓器特異症状を確実にミラーへの感受性 (例,腸内で)。したがって、結論は、スコアリング システム通常これらに基づく特定の治療的介入の腸保護効果に関して、例えば短い落ちる。

新規全身の発明によって主要な進歩にもかかわらず画像診断法、発光や蛍光遺伝子マウス モデル^7,8の使用法との組み合わせで直接、具体的は方法論腸内を評価する生きているマウスで GvHD の症状が欠けています。したがって、次のセクションで説明されている腸管 GvHD 表現型の内視鏡的評価のプロトコルの後ろの理論的根拠は、この障害を克服するためにです。さらに、モチベーションは以来、これまでのところ、細胞、形態学的、および分子特性の詳細な評価実験マウスの数を減らすにも (例えば,病理組織学的、分子生物学) 腸管 gvhd症状は、実験マウスの犠牲を最終的に必要があります。

当院は大腸の症状同系大腸炎モデル⁹間のミニ内視鏡的評価の方法論上以前報告しています。ここで提示されたプロトコル、洗練され、内視鏡を適応して私は完全に設定を一致しない alloresponse 駆動 alloreactive の移植時に腸管 GvHD と生きたマウス大腸炎 MHC クラスで HCT およびドナーのリンパ球のためのスコアリング マトリックス.腸管 GvHD 関連大腸病変を反映するように適した 4 つのパラメーターを同定しました。さらに、我々 は容易に腸管 GvHD 時点時点で与えられたマウスでの重症度について読者に知らせる新しいスコアの結果により、任意の 1 つの決定要因の微調整グレーディング システムを設立しました。病理組織学的分析は、特定のしきい値以上の内視鏡スコアは中程度の高級組織の炎症を予測して確実に確認しました。したがって、ミニ内視鏡的評価は、日常的に実験的マウスの犠牲を必要とする金本位制の病理組織学的に動作している代替を示す表示されます。重要なは、このプロトコルは、実質的に任意の特定の時点に適用できるし、病気^10,11のコースの間に繰り返し使用できます。さらに、発光依存アプローチの使用と対照をなして交配遺伝子改変マウスのような激しい労働や時間がかかる対策も不要と、あらゆるマウスの線上の方法論を適用できるそれ故に、関心します。

まとめると、重症の消化管 GvHD 同種 HCT 患者の有害な臨床的視点を与えて急速な科学の進歩と免疫病態分子メカニズムに洞察力が急務します。同様に、重要な倫理的な考慮事項を要求する知識のゲインが実験的マウスの最小限の使用と達成されるべき。したがって、両方の実験的な作品チェーンを監視し、ライブの実験的マウス腸管 GvHD をグレードでコロンのシリアル ミニ内視鏡評価を実装して腸管 GvHD を探索研究コミュニティの要求を進めることができる認識モデルとして説明し、ここで提示されたプロトコルで検証。

Protocol

ここで説明する実験方法は、Mittelfranken, ババリア, ドイツの政府によって承認されています。

1. GvHD 誘導

1. 0 日目: 受信者のマウス全身照射
   1. 女性 CD45.2⁺ H2kd を使用して⁺ BALB/c マウス 10 週間、少なくとも受信者として古い。
   2. 計量し、GvHD 誘導前に受信者のマウスの体重を記録します。
      注:受信者が最小の本体重量 20 g を持っていることを確認します。開始体重、GvHD の誘導、進行の過程で個々 のマウスの体重減少を計算する基準値となります。
   3. X 線照射のコンテナーに最大 5 つのマウスを置きます。
   4. X 線の 8 Gy の単回投与による全身照射法によるマウスを照射します。Cs¹³⁷を放射線源として使用します。
2. 1 日目: T 細胞除去骨髄に放射線照射したマウスの再構成
   メモ:セクション 1.2, の下で詳細なアウトラインの同種骨髄細胞の移植は、照射後 24 h 内で起こるべきであります。実行無菌培養で以下に述べる手続フードし、フィルター処理された試薬を使用します。同種の CD45.1/Ly5.1 B6 を使用します。SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl マウスの T 細胞除去骨髄ドナーとして。
   1. CD45.1/Ly5.1 B6 を安楽死させます。受信者の BALB/c マウスの照射後 12-24 時間制度ガイドライン同種骨髄細胞を寄付 SJL マウス。このため、CD45.1/Ly5.1 B6 を麻酔します。5% イソフルレンの吸入による SJL マウス。呼吸停止後 1 分以上のイソフルラン暴露を続行し、頚部転位によって安楽死を確認します。
   2. 毛皮、70% エタノールで十分にマウスの皮膚を消毒します。
   3. きれいにマウスの位置は、腹臥位では実験者に直面してその後半部、マウス、鞘を取り組んでいます。長さ 13 cm Semken 鉗子の先端と鋸歯状の湾曲したヒント アキレス腱に毛皮を持ち上げます。鉗子と硬化 8.5 cm 高級はさみストレート ヒントとかかとの間の皮膚を切開します。
   4. (すなわち、上下肢と腰背部に太ももかかと) から頭側切開を延長します。鉗子の助けを借りて、後肢から皮膚や毛を削除します。
   5. 他の後肢で同じ手順を実行します。
   6. 隣接する股関節を介して切断して後肢を削除します。
   7. リアの足を切り取る。膝関節をカットします。太ももと 92 mm のペトリ皿リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 液氷の上でいっぱいで一緒にすべての後肢のシャンクを格納します。
   8. すべての太もも、すねからできるだけ多くの筋肉組織を削除することによって、大腿骨と脛骨の骨を慎重にきれい。大腿骨と脛骨の骨を 50 mL チューブ ステップ 1.2.7 で収集したすべての脛骨と大腿骨の骨まで濡れた氷上筋肉組織から掃除が生殖不能 RPMI 1640 媒体と場所に転送します。
   9. 骨髄を分離するには、RPMI 1640 媒体でいっぱい (92 の mm の直径) をシャーレに 50 mL のチューブから (これに記載されているステップ 1.2.8 として掃除されている) 時に 1 つの大腿骨や脛骨の骨を転送します。大腿骨や脛骨骨髄を含む骨の空洞へのアクセスを取得するメスとの両端を切ってください。
   10. RPMI 1640 培地 5 mL を 50 mL 採取管を準備します。骨の空洞に RPMI 1640 培地 1 ml 充填 1 mL 注射器に接続されている 26 G 針を挿入し、プランジャーを押すことによってコレクションの管にキャビティから骨髄をフラッシュします。
   11. 1.2.10 軽くて光沢のある骨が表示されるまで、手順を繰り返します (すなわち、骨空洞が目に見えて赤みを帯びた骨髄を欠いている)。空の骨を破棄します。
   12. 1.2.9 - 1.2.11、ステップ 1.2.8 からすべての大腿骨と脛骨の骨を使用しての手順を繰り返し、ステップ 1.2.10 から同じ 50 mL コレクションの管ですべての回復した骨髄の部分を収集します。1.2.8 のステップのすべてのボーンがそれに応じて処理されるまで濡れた氷の上コレクションの管を保ちます。
   13. フラッシュ、もろい骨髄の部分を上下にそっとピペッティングによる単一細胞懸濁液を作成します。新しい 50 mL コレクション チューブに配置 40 μ m メッシュ スクリーン携帯こし器を通って骨髄単一細胞懸濁液をフィルターします。
   14. 4 ° C で 5 分間 450 x gで骨髄単一細胞懸濁液を含む 50 mL コレクション チューブを遠心分離します。上清を捨てます。
   15. 5 mL の ACK 溶解バッファー (1 mM ナ₂EDTA; 10 mM KHCO₃; 144 mM NH₄Cl pH 7.2) 赤い血セル換散のためにペレットを再懸濁します。室温で 3 分間細胞懸濁液を孵化させなさい。その後、すぐに細胞懸濁液に PBS 溶液 10 mL を追加します。
   16. 450 x g 4 ° C で 5 分間の懸濁液を遠心分離します。上澄みを廃棄し、PBS 溶液 2 mL に細胞を再懸濁します。
   17. 診断を使用して、骨髄のセルをカウントします。6 x 10⁶細胞細胞精製後、細胞の純度を確認する流れフローサイトメトリー解析のための因数を保持 (1.2.20 の手順を参照してください)。
   18. 培養骨髄細胞から T 細胞の枯渇、市販細胞精製キットを使用します。次の製造元のプロトコル全骨髄細胞から CD90.2⁺細胞 (すなわち、リンパ球) を使い果たす磁気。
   19. 1.2.18、診断の手順で説明するように分離されている T 細胞除去骨髄細胞を数えます。1.2.20 の手順で説明されているように流れフローサイトメトリー分析後に実行される 1 x 10 の⁶セルの因数を保持します。
       注:マウスの 1 つのドナー由来の平均細胞収率は、通常、2 x 10⁷ 10⁷ T 細胞除去骨髄細胞 x 3.4 〜。
   20. フローサイトメトリーを用いた正常な T 細胞の枯渇を確認します。1 x 10⁶セル、手順 1.2.17 (磁気細胞分離前に骨髄細胞) と次抗体 1.2.19 (磁気細胞分離後の T 細胞除去骨髄細胞) から保持を染色: α-CD45.1 (A20)、α-CD3 (17A2)、α CD4 (GK1.5) と α-CD8α (53-6.7)。無染色のコントロールとコントロールの単一染色、流れの cytometer を設定するステップ 1.2.17 から残りのセルを使用します。
       1. 汚損プロシージャ フロー フローサイトメトリーを実行する V 下 96 ウェル プレートのウェルに各サンプルから 1 x 10 の⁶セルを転送します。
       2. 4 ° C で 5 分間 450 x gで 96 ウェル プレート (ステップ 1.2.20.1) 内のセルをスピンします。上澄みを廃棄し、FACS バッファー (3% を添加した PBS は、ウシ血清をフィルタ リング) を 100 μ l 添加の細胞を再懸濁します。
       3. 遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 450 x gで 96 ウェル プレート内のセル上清を捨てます。
       4. 単一染色 FACS バッファーの 100 μ L のサンプルを選択 (ステップ 1.2.20 と比較) の抗体の適切な量を追加します。
       5. 前から保存骨髄細胞採取を別々 に染色する十分な適切な量を含む全ての抗体 (マスター ミックス) の混合物を準備 (手順 1.2.17 参照) と後 (手順 1.2.19 参照) 磁気 T 細胞の枯渇。両方の因数にマスター ミックスの 100 μ L を追加します。
       6. FACS バッファーのだけ 100 μ L を無染色のサンプルに追加します。
       7. 暗闇の中で 4 ° C で 20 分の 96 ウェル プレート内のセルを孵化させなさい。
       8. FACS バッファーを 100 μ l 添加し、遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 450 x gで 96 ウェル プレート内のセル上澄みを廃棄し、FACS バッファーの 100 μ L に細胞を再懸濁します。
       9. 4 ° C で 5 分間 450 x gで細胞を遠心分離します。上澄みを廃棄し、FACS バッファーの 250 μ L で細胞を再懸濁します。
       10. 5 mL ポリスチレン丸底チューブにサンプルを転送し、(手順 1.2.20 参照) 細胞サンプルを特徴づけるために用いる抗体のラベルに使用された蛍光分子を検出することができる流れの cytometer 楽器でそれらを分析します。
       11. 磁気細胞分離前後の細胞組成を比較します。
           注:約 95% の純度 CD45.1⁺CD3^- (すなわち、T 細胞除去骨髄) ライブのゲート内のセルは通常達成されます。
   21. T 細胞除去骨髄細胞懸濁液 2 を洗う x PBS 溶液 (450 x g 4 ° C で 5 分間) で、最後に、5 x 10⁷セル/mL に細胞濃度を調整する PBS 溶液中の細胞を再懸濁します。注射まで濡れた氷の上細胞を保ちます。
   22. (参照セクション 1.1) 前日に照射した受信者のマウス T 細胞除去骨髄細胞を注入します。
       1. 防漏室で実験的マウスを置き、最大 4% の吸入による麻酔イソフルラン、マウスが意識するまで。立ち直り反射の消失をテストすることによって鎮痛や意識消失を確認し、ペダルの後の損失が反射を撤回します。
       2. 5 x 10⁶ T 細胞除去骨髄細胞 (すなわち、5 x 10⁷セル/mL の 100 μ L) 注入 PBS 溶液 1 mL 注射器 30 G 針装備を使用して 静脈静脈洞を含む球空間に。
3. 2 日目: T 細胞伝
   注:滅菌のティッシュ文化フードの下記載されている手順を実行し、フィルター処理された試薬を使用します。CD45.2 C57Bl/6 (野生型; を使用します。Alloreactive T 細胞のドナーとして WT) マウス。コンジェニック マーカー システムの使用により、受信者の識別 (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c マウス) とドナーの造血細胞型 (骨髄細胞: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6。SJL マウス;同種の T 細胞: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 マウス)。
   1. 適用に従って c57bl/6 マウスを安楽死制度のガイドラインと当局。そのため、濃度 5% イソフルレンの吸入によるマウスを麻酔します。呼吸停止後 1 分までイソフルラン暴露を続行し、頚部転位による安楽死を確認します。毛皮、70% エタノールで十分にマウスの皮膚を消毒します。
   2. 50 mL のコレクション チューブに 40 μ m メッシュ スクリーンとストレーナーを配置します。脾臓を取り外し、こし器の上に置きます。
   3. シリンジのプランジャーをこし器に脾臓を comminute します。ストレーナーとシリンジのプランジャーはすべて脾細胞を収集する PBS で洗います。
   4. 遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 450 x gで 50 mL のコレクション チューブ内のセル上清を捨てます。
   5. 3 mL の赤血球を溶解する ACK 溶解バッファーで脾細胞を再懸濁します。3 分後、10 mL の PBS を追加、および遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 450 x gで細胞に細胞懸濁液を孵化させなさい上澄みを廃棄し、PBS の脾細胞を再懸濁します。
   6. 診断を使用して、脾臓のセルをカウントします。1.3.9 のステップで精製の大きさを評価するための流れの cytometry 分析 6 x 10 の⁶セルの因数をそらします。
   7. 合計 CD3 の⁺ T 細胞総脾細胞から分離市販細胞精製キットを使用します。次の製造元のプロトコル、脾 T 細胞を分離します。
   8. 脾の CD3 をカウント⁺ T 細胞に従ってステップ診断 1.3.7。フローサイトメトリー解析のための 1 x 10 の⁶ T セルの因数を保持します。
      注:脾 T の平均収量は 1.3 × 10 から磁気細胞分離範囲によって分離されたドナー マウスあたりセル 2 x 10 の⁷セルに⁷ 。
   9. フローサイトメトリーによる細胞分離の成功を確認します。汚損のプロトコルの詳細についてを与えるし、1.2.20.1 - 1.2.20.10 の手順に従います。
      1. 次抗体で (磁気細胞分離) 後のステップ (前磁気細胞分離) に、1.3.6 と 1.3.8 1 x 10⁶脾細胞を染色: α CD45.2 (104)、α-CD3 (17A2)、α-CD4 (GK1.5)、α-CD8α (53-6.7)。
      2. 無染色コントロールと単一それぞれ抗体染色の流れの cytometer を設定するステップ 1.3.6 から残りのセルを使用します。
      3. 磁気細胞分離前後の細胞組成を比較します。
         注:純度 CD45.2⁺CD3 の ≥95%⁺ T のリンパ球のライブ ゲート内のセルを達成べきであります。
   10. 洗浄 T 細胞 PBS で 2 倍 (4 ° C で 5 分間g 450 x)、最後に、7 × 10⁶セル/mL に細胞濃度を調整する PBS 溶液中の細胞を再懸濁します。注射まで氷の上細胞を保ちます。
   11. Alloreactive、以前 CD45.1⁺ T 細胞除去骨髄細胞 (手順 1.2.22 参照) を受けた照射の balb/c マウスに、(手順 1.3.10 参照)、脾の T 細胞を注入します。
       1. その意識を失うまで最大 4% イソフルランにさらされて防漏室でマウスの実験を配置することによって麻酔を誘導します。立ち直り反射の消失をテストすることによって鎮痛や意識消失を確認し、ペダルの後の損失が反射を撤回します。
       2. 0.7 x 10⁶ alloreactive CD3⁺ T を注入 30 G 針装備 1 mL 注射器を用いた細胞 (すなわち7 x 10⁶セル/mL の 100 μ L) PBS 溶液 (1.3.10 のステップを参照)、球後に静脈内誘発する GvHD。 マウスの空間は、これらのマウスを実験群として命名します。
       3. 100 μ L の PBS、単独での球空間に静脈内投与マウスの別のグループを注入し、その後と呼ばれる対照群としてこのグループを命名"いいえ T 細胞移植マウス (ない)」。

2. 全身 GvHD の評価

注:ライセンスし、動物の施設内で生きたマウスを処理するために装備の実験室周辺の不稔にこの手順を実行します。

1. 個々 のマウスで GvHD の臨床経過をたどる具体的には、評価し、実験的マウス 3 倍以下、クックら⁶が以前に確立したスコアリング システムから適応の得点システムに基づく GvHD 症状の有無を 1 週間のスコアします。
   1. 個別に各マウスの重量を量る、重量を記録し、特定日 0 (ステップ 1.1.2) 実験 (100% 相当) の開始前に決定された体重参考体重を計算します。グレード 0、体重減少 10% と 25% グレード 1、グレード 3 の 25% 以上の減量と開始の重量の 10% 未満の重量損失をスコアします。
   2. それぞれのマウスは、通常のアクティビティ レベルで目の肥えたマウスの活動レベルをスコア (スコア = 0) 緩やかな減少の活動レベルをマウスから (スコア = 1) と静止の動作とマウス外的刺激でない限り、(スコア = 2)。
   3. 通常、光沢のある、ボサボサの毛皮をそれによって差別毛皮テクスチャをスコア (スコア = 0) 適度に波立たせられた毛皮から (スコア = 1) とはげスポットの存在 (スコア = 2)。
   4. 肌の質感は、正常な皮膚を差別をスコア (スコア = 0) (例えば、尾および足) で皮膚をスケーリングの散発的なスポットから (スコア = 1)、明白なスケーリングと痛い皮膚エリア (スコア = 2)。
   5. 分泌されたスツール分数の整合性を分析します。スコアをグレード 0 正常 (すなわち、ハードの一貫性) 便、グレード 1 の変形と柔らかい便と便と一貫性なしと、それ故に、2 級の重度の下痢便。
   6. マウスあたり 12 の最大の臨床スコア別に得点パラメーターはすべてをまとめます。
2. 検討し制度適用のガイドラインに従い、個々 のマウスの現在の病気の重大度レベルによる実験を中止の条件を評価し、動物のプロトコルを許可します。

3. 消化管 GvHD の評価

1. 遠位大腸領域の小型内視鏡による GvHD 関連病変の得点
   メモ:実験室ライセンス、動物の施設内で生きたマウスを処理するためにので以下の実験周辺でこれを実行します。小動物用が承認されたミニ内視鏡ワークステーションを使用します。
   1. 内視鏡検査鞘 (1.9 mm の直径) と長さ 10 cm の望遠鏡を覆うことによって内視鏡デバイスを準備します。きれいにし、水とエタノールで内視鏡を消毒します。
   2. コンピューター、調節可能なキセノン光源とカメラ モジュールの切り替え、レンズに近いオブジェクトが明確なイメージを与えることの方法でフォーカスを設定します。
   3. 内視鏡の鞘に空気ポンプを接続します。空気の流れを可視化、水で満たされたビーカーのガラスに、内視鏡の先端を浸し。空気ポンプと内視鏡の鞘の間の弁を調整することにより空気の流れを調節します。いくつか連続して昇順で反映、ゆっくりと、一定の空気の流れを調整する泡。
   4. 防漏チャンバーにマウスを配置します。4% の吸入による麻酔イソフルラン マウスが意識するまで。立ち直り反射の消失をテストすることによって鎮痛および反射の不在の状態を確認し、ペダルの後の損失を撤回する反射。
   5. 使用される動物のプロトコルに従って適切な獣医の麻酔機を使用します。大腸内視鏡検査ワークスペースに商工会議所からマウスを転送します。ここでは、粗野で (これは、麻酔器に接続)、きれいな上に鼻と、麻酔下マウスの位置は、マウスは腹臥位でその後半部と実験者に直面して、鞘を取り組んでいます。
   6. 大腸内視鏡検査のプロシージャの間に麻酔を維持するためにおよそ 2% にイソフルラン麻酔濃度を低減します。マウスの呼吸と、内視鏡検査中の刺激への応答を監視し、必要に応じて、気化器はイソフルラン濃度を調整します。乾燥を得ることからそれらを防ぐために軟膏でマウスの目をカバーします。
   7. マウスの指の間をつまんで麻酔の効果を制御します。反応性不在の場合は、3.1.8 のステップに進んでください。
   8. 片方の手で尾のルート上尾を持ち上げ、内視鏡で、直腸に肛門を介して他の手の位置を慎重に挿入します。
   9. 一方、空気の流れは、ゆっくりと慎重に著るしく拡大方向に進む内視鏡を移動大腸内腔を膨らませます。
   10. 大腸の内腔の真ん中に内視鏡を置き、大腸の壁との接触を最小限に抑えるため、傷、深い壁に関連した傷害を避けるためにこの位置を維持 (出血の結果など)、またはも壁の穿孔 (手順 3.1.17 参照).この手順を制御するには、完全に (すなわち、大腸のコンパートメントの一定の可視化) の下でビデオ ストリームを見ています。
   11. 糞便は、ビューを収縮し、内視鏡を削除、直腸まで 2 ml の生理食塩水、ソフト パスツール ピペットを使用してフラッシュで浣腸を実行します。糞便や否定的粘膜面と、最終的には、採点結果の特性に影響を与える他の副次効果の意図しない希薄化を防ぐために、可能な限り少量の液体として使用します。
   12. 定期的に内視鏡を配置しようとすると、(すなわち,異なる) 遠位結腸大腸炎症の得点を標準化し、マウス間および実験の結果を得点の比較を最適化する内の解剖学的部位。
       注:通常、硬性内視鏡と 4 cm の最大深さは直腸ルート経由でアクセスできます。2 ~ 4 cm aborally、コロン定期的に化す曲げ剛性内視鏡に渡したことはできません。遠位撓曲デフォルト得点としてスポットに隣接するコロンの領域を使用します。
   13. ビデオ ストリームを記録し、炎症の得点で始まるを開始します。
   14. 説明し、表 1及び図 3に示されているパラメーターを得点でコロンの GvHD に関連する炎症を評価します。
       1. スポットを優しく得点と若干戻る - 内視鏡を移動し、別のパラメーターを評価するために転送します。
       2. 大腸の壁に関連してより広い距離で内視鏡の位置によってパラメーター「半透明」として「スツールの一貫性」を評価します。
       3. 内視鏡を大腸の壁に近接配置することで、パラメーターの「粒度」と「血管」を評価します。このタスクでは、内視鏡の先端で大腸の壁によく投与緊張を慎重に適用します。
   15. スコアリング プロセスが完了したら、記録を停止します。
       注:その後、記録ビデオ クリップを合計で使用または大腸の炎症に貢献する全体的なミニ内視鏡評価基準の代表的なイメージ (すなわち、スクリーン ショット) の生成に使用できます。
   16. 内視鏡を慎重に取り外します。
   17. マウスを周囲の空気にさらされて別々 のケージに移すことによってイソフルラン博覧会を中止します。赤いランプとマウスを温める、それが麻酔から回復し、完全な意識を取り戻すまでマウスを観察します。
       注:大腸内視鏡検査中に空気のインフレのため、マウスの腹部はその後直接パフをあります。これは通常、一時的な性質の長期徴候腹部の大量でも進歩的なインフレとマウスの回復の障害の可能性があります (この場合、安楽死されるマウス ニーズでコロンの予期せぬ穿孔すぐ)。
   18. 完全復旧時にそのそれぞれのケージにマウスを配置します。
   19. オプションの方法: ビュー ガイド下組織生検を取ることもあります。以下の手順を実行します。
       注:内視鏡は、3.1.1 - 3.1.18 以下の変更の手順で説明するように同じ方法で実行されます。
       1. 3.1.1 ステップで望遠鏡をカバーするため動作しているチャネルのない簡単な検査シースではなく、組み込み作業チャネルに内視鏡検査シースを使用します。これは主腸へ予期せぬ損傷を防止するため、その先端がビデオ画面で内視鏡の前にちょうど目に見えないまで作業チャネルに生検鉗子を紹介します。
       2. 3.1.11 3.1.2 - の手順に進みます。コロンとプッシュは、関心のスポットを慎重に前方に内視鏡を挿入します。
       3. 大腸組織生検のタスクの 2 番目の実験者の助けを採用してください。鉗子の顎を開くことができるまで楽しみにするゆっくりと作業チャネル内で鉗子を押す選択の大腸領域に生検鉗子の先端を移動する 2 番目の実験者を求めます。大腸の壁を傷つけるリスクを最小限に抑えるこの手順中にビデオ ストリームを常に監視します。
       4. 慎重に生検鉗子の顎の開閉により結腸壁組織サンプルを回復します。
          注:これは大腸の壁の穿孔を防ぐために慎重に。大腸穿孔のまれな場合は、すぐに制度のガイドラインに従い、麻酔薬の継続的な管理の下での測定を適用することで影響を受けるマウスを犠牲に。
       5. 引き戻すし、閉じ鉗子で作業チャネルからを削除します。生検鉗子の顎から試料を浸漬滅菌 PBS 溶液で開かれた鉗子を慎重に揺することによって削除します。その後、計画された下流解析に従って、組織サンプルの適切な保管条件を選択します。70% エタノールで消毒後さらに生検を行う鉗子が再利用されます。
       6. 生検を取った後内視鏡を削除し、手順 3.1.16 - 3.1.18 で大腸内視鏡検査を終了します。
2. 病理組織学的解析
   1. 日の 26、x 線照射後 30、間制度のガイドラインおよび当局の適用に従い同種 HCT 受信者マウスを安楽死させます。このため、5% イソフルレンの吸入によるマウスを麻酔します。呼吸停止後 1 分のイソフルラン暴露を続行し、頚部転位による安楽死を確認します。徹底的に毛皮や 70% エタノールでマウスの皮膚を消毒します。
   2. 腹腔内を開き、コロンを削除します。PBS で (92 の mm の直径) をペトリ皿に転送します。
   3. PBS で 5 mL ディスペンサー チップを埋めます。長さ 13 cm および鋸歯状の湾曲したヒントのスリップ ディスペンサー チップの先端の上コロン (約 5 mm) の遠位部 Semken 鉗子の助けを借りて。慎重にディスペンサー先端に鉗子でコロンを修正し、腸から便を削除するディスペンサー チップのプランジャーを押し、PBS でコロンをフラッシュします。
   4. メスの助けを借りて、肛門から約 5 mm に位置する結腸を切り取る。
   5. 一晩、腸の切除標本を 4.5% のホルムアルデヒドに修正します。パラフィンに埋め込む、前に直立位置にティッシュを置き。
   6. カット 3 μ m コロンのパラフィン包埋組織の断面積と染色標準プロトコルを使ってそれらヘマトキシリンとエオシン (HE) 染色します。
   7. 大腸組織サンプルの断面を彼ステンド グラスを準備します。
   8. カプランら¹²によって報告されたスコア行列から適応、病理組織学的炎症性活動重大度とスコア 0-3 のスコア: 炎症がない (スコア = 0)、軽度の炎症 (スコア = 1)、中等度の炎症 (スコア = 2)、や重度の炎症 (スコア 3 を =)。
      注:理想的には、このタスクのマウス腸管 GvHD の評価で経験され、実験の性質と制御グループに目がくらんで病理学者の専門知識を採用してください。

Representative Results

ミニ内視鏡遠位結腸の腸管 GvHD 関連病変評価を記述する、現在のプロトコルの確立し、以前深刻な急性 GvHD モデルの全身誘導を受けるマウスで検証されています。この研究で使用して私は完全に一致しない BALB/c マウスが致死的照射、続いて T 細胞除去同種骨髄移植と GvHD を誘発する alloreactive C57BL/6 CD3^{の投与によるモデル システム MHC クラス +}T リンパ球。T 細胞除去骨髄細胞と GvHD 誘導脾 T 細胞を磁気分離による精製しました。これらの細胞集団の純度は cytometry 流れによって決定され、浄化プロセスの代表の結果が図 1、合計骨髄細胞から T 細胞の十分な枯渇との一貫性のある濃縮を示すに表示されます。脾臓由来 CD3⁺ T 細胞以前への移転前に放射線照射したマウス。図2 臨床コースは、alloreactive ドナーの T リンパ球の不在 (ない、グレー) 対 (黒では WT) の存在下で同種 HCT に臨床全身 GvHD 表現の再現性をもって堅牢な誘導を示します。以前、クックらによって報告されたスコアリング システム合計コア、6 つのパラメーターを評価され、傾斜を表します: 本体重量、姿勢、活動、皮膚、毛皮質と一貫性⁶のスツールします。コントロール マウス経験豊富な 1 つだけ、初期発生のピーク日 5 と 10 の間の臨床スコアそれは T セル受信マウスで観察された同様に、したがって、主に照射による全身性炎症反応のためです。関係なく、ドナー T セル受信マウスの臨床スコア以前上昇し始めた、最初ピーク後の一過性減少より高い合計のピークを示したし、本質的に増加したもう一度、継続的の残りの期間にわたって、実験。全体的にみて、これらの結果は、T 携帯受信マウスを強く示す解釈としないマウスに比べて全身の GvHD のより進歩的な徴候と一致しています。

ドナーの T リンパ球受信同種 HCT マウス急性臓器関連と全身 GvHD 症状、コントロール マウス後時点で特に中等度から重度の愛情はありませんでしたが全体的に高い合計得点の結果、様々 な兆候を示した。ただし、腸管 GvHD の兆候はスコアリング システム、唯一評価腸関連パラメーターがスツールの一貫性である全身の GvHD の過小評価します。正確な説明については、得点と過去に報告された評価基準を適応することにより腸管 GvHD 関連病変の評価対象として表 1に示す、ミニ内視鏡課税基準が定義されて、alloresponse 駆動型大腸炎⁹のコンテキストに同系の大腸炎。図 3が表示されます個々 の基準の典型的な例として示す種類と腸管 GvHD 関連病変の範囲によりミニ内視鏡の遠位結腸評価中に適用されるグレーディングのマトリックスの可視化GvHD を起こしやすいマウス MHC クラスの移植の時に完全にドナーのリンパ球を一致しません。

図 4A テーブル 1で定義されている、図 2で簡単に表示の基準に基づく腸の GvHD の合計のスコアの結果が腸の深刻な兆候とドナーのリンパ球受信マウスを差別する実験者を有効にすることを示しています。本質的に GvHD に欠けているマウスからの炎症。ミニ内視鏡ベースのグレーディング システムを検証するため、以前に報告された微細なグレーディング システム¹²を使用して病理組織学的研究を行った。図 4Bのデータ確認マウスの大腸は、GvHD 関連炎症によって深刻な影響を与え、病理組織学的炎症の病理組織学的標識同様に強い高大腸内視鏡合計スコアによって証明されるよう≥2 死後のスコアを合計します。対照的に、コントロール マウスの大腸組織表示なし (スコア 0) または、ほとんど、軽度 (スコア 1) 大腸炎の内視鏡ミニ検出兆候の事実上の不在に伴い、炎症の病理組織学的徴候。さらに、図 4C、Dのように間相関研究ミニ内視鏡と病理組織学的大腸炎活動と査定全身 GvHD スコアを行った。重要なは、これらの研究は、3 のミニ内視鏡断固とした合計スコアが確実に病理組織学的評価から得られた - 高い等級 (すなわち、≥2) 腸の GvHD 関連大腸炎症スコアの不在を予測を示した。最後に、評価内視鏡的消化管 GvHD の重症度は、全身の GvHD 活性との相関性を示しています。

図 1: 磁気精製 T 細胞除去骨髄細胞と同種の脾 CD3 のフローサイトメトリーによる品質評価の流れ⁺ T セル。市販の精製キットを使用して磁気分離によって達成 CD90.2⁺骨髄細胞の枯渇を (A)。T 細胞除去骨髄細胞の純度は前にアンチ CD45.1 と抗 CD3 T 細胞の枯渇後の細胞を染色、フローサイトメトリーによって決定されました。1 つの代表的な実験の結果が表示されます。(B) 脾 T 細胞は市販の精製キットを採用、磁気精製しました。純度は、フローサイトメトリー、CD45.2 の周波数を比較することによって決定され、T 細胞分離の前後から派生したサンプルの CD3 costaining。1 つの代表的な実験の結果が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 私は完全にモデルを一致しない MHC クラスを用いた GvHD の臨床経過.急性 GvHD を誘発するには、BALB/c マウスは全身照射日 0.マウス T 細胞除去骨髄細胞 24 h 後 (d1) を受け取った。同種の脾 CD3 を注入したマウス 2 日目、⁺ T 細胞 (野生型 [WT];n = 9)。コントロールとして、いくつかのマウス受け取った T 細胞除去骨髄だけで (ない;n = 9)。マウスは具体的には週 3 回に存在し、GvHD の臨床症状の重症度を評価しました。表示されるデータは、2 つの代表的な実験から示された処置のグループの個々 のマウスから得られた臨床スコアの平均値 ± SEM を表します。データは、ボンフェローニの複数比較試験後に続いて双方向の分散分析によって分析しました。p < 0.0001 が重要と考えられていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 代表画像ライブ、同種 HCT 扱われるマウスのコロンのミニ内視鏡的評価による評価腸管 GvHD 関連コロン変化のスコア行列の基礎となるグレーディング例。補完するため、使用されるスコアリング グレーディングと表 1にシステムの詳細な説明を説明するには、代表的なミニ内視鏡画像のコロンで個別にすべてのパラメーター (グレーディング) 評価された重大度レベルの麻酔、26 と図 1に記載されている前に 30 日間同種 HCT を受けて生きているマウスがここに表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: ミニ-内視鏡得点と大腸の腸管 GvHD に関連する炎症のグレーディング上級大腸炎の病理組織学的の得点を評価の存在を確実に予測します。(A) ライブ、麻酔下マウスにおけるミニ内視鏡検査日の 26、図 1に示すように GvHD の誘導の後の 29、間腸管 GvHD の症状を評価しました。大腸の変更された獲得し、表 1と図 2に示されている得点とグレーディング システムに応じて傾斜します。コントロールの代表的な内視鏡画像 (T 細胞;) 野生型 (WT)、T 携帯受信マウスとミニ内視鏡評価スコア (上) が表示されません。(B) マウスがミニ内視鏡評価後 12 時間を犠牲にし、コロンの遠位部が処理および病理組織学的評価。ヘマトキシリンとエオシン染色断面は遠位結腸の炎症性活動は傾斜だった。代表ヘマトキシリンとエオシン-染色はない T 細胞と WT T セル受信同種 HCT 扱われるマウスとスコアが表示されます、対応する組織の遠位結腸の断面します。パネルAとBのデータは分析されたスチューデントのt-テスト、平均 ± SEM. として表示されます * * *p < 0.0001 が重要と考えられていた。WT: n = 15;ない: n = 15。データは、4 つの個々 の実験からプールされたデータを表します。(C) 大腸内視鏡検査得点と組織学的スコアリングの相互依存。箱ひげ図データが表示されます。それぞれのしみには、中央 (各ボックス内の黒い線)、データ (最大分)、範囲、四分位数 (各ボックスの領域) が表示されます。WT: n = 15;ない: n = 15。データは、4 つの個々 の実験からプールされたデータを表します。(D) 大腸内視鏡検査得点と臨床得点の相関コントロールと野生型 T 細胞受信マウスの両方は、相関分析に含まれます。実線は、線形回帰の行を表します。スピアマン相関係数 (r-値) とp-値が表示されます。WT: n = 12。ない: n = 13。データは、3 つの個々 の実験からプールされたデータを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

スコア	0	1	2	3
大腸の壁の透光性	超腸、内部器官 (例えば脾臓) 徹底的に目に見える	大腸の壁の軽度の不透明度による超腸器官の視認性の離散化	大腸の壁の重要な不透明度による超腸器官の可視性の中等度の削減	超腸器官、すなわち透明な結腸壁の可視性の欠如
粒度	滑らかな、影響を受けない粘膜表面の外観;大腸クリプト パターン表示	粘膜表面の離散のあれと石畳の外観	粘膜面の適度な粗と石畳の外観	重度のあれと粘膜表面のコブルス トーン外観粘膜のクッションのような外観
血管	大小様々 な船舶の通信ネットワークを表示する不変の血管パターン	血管パターンの個別変更思われる血管パターン争い	いくつかの船が表示されます。不連続な血管網	誘発出血; お問い合わせ血管のドット状のパターン
スツールの一貫性	通常;便は難しいです。粘液の罰金スレッド 糞便と大腸の壁の間を観察できます。	便の形が不規則なエッジを含めることができます。内視鏡の先端を変形	便は柔らかく、漠然としました。 便が目に見えて多く輝いて (高水内容)	便がゆるい、液体;水様性下痢。便は大腸の粘膜表面にランダムに広がる可能性があります。

表 1: ミニ内視鏡得点とライブ同種 HCT 投与マウスの結腸に腸管 GvHD 関連病変の行列をグレーディングします。同種 HCT 前処理したマウスにおける腔内および貫コロンの形態の変化は、直腸の大腸内視鏡検査と麻酔、ライブのマウス、マウス ミニ内視鏡システムを使用しての遠位結腸によって評価しました。大腸病変は、ベッカーら⁹によって報告されのコンテキストに適応したシステムを得点元の MEICS からみた内視鏡スコアリング システム (大腸炎重大度 [MEICS] の変更されたマウス内視鏡インデックス) の助けを借りて、分類されました。同種 HCT。遠位結腸が視覚的に存在し、次の 4 つのパラメーターの大きさ評価: 1 内視鏡光 (トランスルー セント) 壁の肥厚として結腸の腸管壁の透過率。2. 粘膜指向の腔粘膜表面のコブルス トーン外観 (粒度) を表示します。3. 変更された血管パターン (血管);4. 内視鏡便外観原 (スツールの一貫性) を評価しました。各パラメーターの 0 (兆候) から 3 (最も厳しい表現型) にスコアはマウスあたり 12 の最大合計スコアまで追加。

Discussion

プロトコルでは、誘導の方法論と腸管 GvHD 間観測された大腸の表現型のミニ内視鏡評価について説明します。科学者 (すなわちから大腸の症状と最大の疾患活動性までの進行の発症) 全体の病気にわたって縦方向と非侵襲的腸管 GvHD を調査するを有効にするのより広い目的を提供しています。

ただし、本質がありますいくつかの重要なステップと重要な制限事項提示の方法論を実験者、それぞれ科学的な文脈の技術を適用する前に注意する必要。まず、正常にマイナーな組織適合性の不一致モデル システム¹¹腸管 GvHD 関連大腸病変の内視鏡ミニ評価を使いました、ここに提供されているプロトコルが現在 mhc 排他的に適用私は完全に一致していない急性 GvHD モデル クラスです。私は完全に一致しない GvHD モデル MHC クラスは共通および頻繁に使用される⁵が、それはよく確立されて以来、これは強く、例えば、影響、GvHD 症状の特性、使用マウス亜に大きく依存、照射する感度。さらに、速度と消化管 GvHD 症状¹²のダイナミクス、インスタンス、腸内細菌叢と使用される転送同種 T 細胞数のさまざまな組成のため、実験的マウス ソース批判的に影響があります。したがって、重要なステップは慎重にテストし、正常に示すように、消化管 GvHD を誘導する能力のための示された措置を検証します。

急性腸管 GvHD のライブ ミニ内視鏡評価の成功の実装について私たちは、内視鏡の処理中は簡単です、それは最も発生しているのリスクを最小限に抑えるためのいくつかの訓練を必要と可能性があります恐ろしいを強調したいです。合併症 (すなわち、空気は大腸を膨らませる必要性との組み合わせで剛性計測器と腸の壁を穿孔する)。増加炎症誘起脆弱性と大腸組織の減らされた柔軟性のための腸の壁の保全かもしれないリスクの詳細 postradiation 回復期 (i.e.,until 10 日目) 腸管の完全な現れにGvHD 関連大腸炎 (すなわち後、約 25 日目)。重要なは、しかし、我々 が観察されなかった大幅に増加した合併症発生率内視鏡の時点に依存して内視鏡は優しく十分な見通しの下で高度な限り。対照的に、最適な薬物投与麻酔の不十分な深さの実験的マウス不要な体の動きの発生につながりますのでリスク要因であることがわかりましたし、連続して、結腸壁穿孔イベント。第二に、スコアリング プロセス中に最も重要なステップは実験者は、採点上の位置に内視鏡を移動すると固体の不要な存在のためにこの問題で制限または腸内腔の液体 (例えば、下痢) 糞便を表します。この状況では、柔軟なプラスチック製のピペットを使用して食塩水で大腸領域をフラッシュが必要頻繁です。ただし、この手順スコアの精度といくつかのパラメーター (例えば、スツールの一貫性) の特異性を危険にさらす可能性があります、のでこの警告慎重に得点時に考慮する必要が。 あります

この内視鏡的アプローチから引き出される結論、解釈を制限するいくつかの制限があります。まず、直腸経由強い内視鏡を用いた方法論に本質的な評価 (すなわち、直腸および遠位結腸) 消化管の最後の 3-4 cm に限られています。そのため、近位結腸と小腸も GvHD 関連付けられている愛情は、既定で GvHD の小さい腸型に焦点を当てて科学的な質問がありませんこのアプローチの恩恵を受けることを示す評価から除外。第二に、炎症腸管 GvHD の特徴の形態的特徴の 1 つですが、腸上皮細胞のアポトーシスの増加率と腸陰窩アーキテクチャの損失のような付加的な特徴は頻繁にあるし、消化管 GvHD 得点と同種 HCT 患者の病理学者によって等級の基礎となる病理組織学的ワークフローに含まれます。ここでは、我々 は芽炎症の病理組織学的評価の徴候にミニ内視鏡評価腸管 GvHD スコアを関連付けられます。死後の病理組織学的解析による評価このアプローチを取る、我々 は内視鏡の得点で特定のしきい値以上の大腸の炎症は、中程度の高グレード炎症の存在を予測して確実に結論に来た。ただし、今後の研究調査にどのように、例えば、病理組織学的評価のアポトーシス率関連ミニ内視鏡合計スコアを合計または、例えば、4 つの個別のパラメーターの一つに埋め込まれている必要がある合計スコア。第三に、マウスの病理組織学的穏健派-に-高-グレード GvHD に苦しんでは、内視鏡のスコアリング方法によって容易に識別できる中、マウス腸内細菌叢の微妙な兆候を見逃す可能性があります説明のアプローチによってという事実を考える病理組織学的スコアリング軽度の兆しなく、マウス同種 HCT 単独 alloreactive ドナーのリンパ球移植を受ける群の炎症の存在を明らかにしました。生物学上、この発見可能性があります実行可能ではなく、マウスが allotransplanted されているので、最小限の大腸炎、骨髄細胞画分からの T 細胞の削除が不完全またはの再構成による GvHD の低レベルの存在を反映して確かに、時間をかけて骨の髄から alloreactive T 細胞。将来の研究より詳細にこれらの質問に対処する必要があります。第四に、正式に、このプロトコルは完全に確立されて腸管 GvHD 関連大腸炎について説明します。しかし、示されている以前、15 日大腸炎の発症内視鏡的に検出することができますおよび発行¹¹量的に表わされます。ここでは、GvHD が発生しやすいマウスは明確に区別なく、マウス大腸の表現型が照射¹¹後照射誘起組織の損傷や、ミラーではなく、粘膜の回復応答の残留徴候のためにもっぱらあるかもしれない。ただし、将来の研究は内視鏡的評価を関連付ける、GvHD を起こしやすいマウス以前の時点でコントロール マウスと比較しての詳細な病理組織学的解析を目指す必要があります。

最後に、内視鏡的消化管 GvHD の得点の面白い、役に立つアドオン アプリケーションはコロンで選択の解剖学的構造に最小化された生検鉗子を直接内視鏡チャンネルの使い方です。この機能内蔵のオプションのようなものとして、一連の病理組織学的、免疫蛍光染色、遺伝子のリアルタイム PCR 解析などの下流の手法によってさらに分析することができますビュー ガイド下組織生検を取るために可能性を提供しています関心します。ただし、将来研究を正式に評価するかどうか、例えば、病理組織学的採点、内視鏡撮影生検のグレーディングが従来撮影サンプルに基づく病理組織学的結果に相当する必要があります (すなわちから安楽死マウス)。

全体的にみて、誘導と腸管 GvHD のミニ内視鏡評価を記述するこのプロトコルで、評価、スコア、および同種 HCT の関連するマウス GvHD 系における消化管 GvHD をグレードする方法論を提供します。内視鏡的評価は、順番に (例えばの治療上の設定) 腸管 GvHD 関連組織病理学を評価するためにマウスを安楽死する必要がある、時間をかけて複数の時点で同じマウスで繰り返し指定できます。ミニ内視鏡の得点結果は結腸に腸管炎症の病理組織学的評価によって得られる全身の GvHD 活動とよく相関した結果に匹敵することが分かった。また、この手順は、内視鏡の作業チャネル経由でビュー ガイド下生検と組み合わせることができます。最終的には、将来の研究がどれ以外の炎症、腸管 GvHD の影響を受けた病変で頻繁に見られる病理組織学的判断の形態学的特徴は、これにより得られた結果を評価する必要があるただし、ミニ内視鏡的評価とアプローチを得点します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456