Induksjon av Intestinal Graft - versus - host sykdom og sin Mini-endoskopisk vurdering i levende mus

Summary

Her presenterer vi en protokoll som beskriver allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon, og lar repeterende mini-endoskopisk evalueringer av distale kolon i stedet for tilstedeværelse, egenskaper og alvorlighetsgraden av colonic betennelser i live mus lider av intestinal graft - versus - host sykdom.

Abstract

Akutt graft - versus - host sykdom (GvHD) representerer de mest alvorlige komplikasjon at pasienter som gjennomgår tidligere allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon (allo-HCT) ansikt og er ofte assosiert med en dårlig kliniske utfall. Stund, for eksempel GvHD manifestasjoner av huden er vanligvis lydhør overfor etablerte immun-undertrykkende terapier og er derfor ikke tar en dødelig kurs, tilstedeværelse og intensiteten av intestinal GvHD, spesielt av midt-til-nedre deler av tarmen, påvirke sterkt utfallet total overlevelse av pasienter med akutt GvHD. behandlingsalternativer er i hovedsak begrenset til klassiske immun-undertrykkende agenter gir bare moderat sykdom-begrensende effekter. Derfor detaljert kunnskap om vev-resident immun cascade, endringer i tarmen bakterieflora og stromal svaret før, på, og etter intestinal GvHD utbruddet er presserende nødvendig å forstå hendelser og mekanismene bak sin patogenesen og å utvikle nyskapende behandlingsalternativer. Murine modeller av GvHD brukes ofte til å identifisere og funksjonelt vurdere molekyler og trasé åpenbart kjører intestinal GvHD. Men er betyr å spesielt overvåke og evaluere intestinale betennelsen over tid egentlig mangler siden etablerte score å vurdere og Vurder akutt GvHD rutinemessig består av ulike parametere som heller gjenspeile systemisk GvHD manifestasjoner. Detaljert evaluering av intestinal GvHD er begrenset til studier med euthanized mus, og dermed egentlig unntatt langsgående (dvs. kinetic) analyser av colonic kupé under en gitt eksperimentelle tilstand (f.eks antistoff-mediert blokade av en proinflammatory cytokin) i levende mus (dvs. i vivo). Mini-endoskopisk i situ vurdering av distale kolon allo HCT-behandlet mus beskrevet her kan a) en detaljert makroskopisk evaluering av ulike aspekter av intestinal betennelser og b) muligheten til å samle vevsprøver for nedstrøms analyser på ulike tidspunkt i løpet av perioden som observasjon. Total, mini-endoskopisk tilnærmingen gir et stort fremskritt i preklinisk noninvasive kartlegging og vurdering av intestinal GvHD.

Introduction

Blodkreft malignitet direkte som oppstår fra blodkreft stamcelletransplantasjon rommet og ukontrollert, er raskt utvikler seg, og alvorlige immun-mediert lidelser ofte indikasjoner for å utføre allo-HCT^1,2. Selv regnskap for forekomsten av prognostiske gunstig graft-versus-tumor respons, er donor lymfocytter imidlertid ofte inducing og fremme et uønsket immun-mediert angrep sunt vev komponenter i Tillat-HCT mottakeren , en prosess som kalles graft - versus - host sykdom³. Manifestasjoner i tarmen, den såkalte intestinal GvHD, representerer den mest fryktede komplikasjonen av akutt GvHD, alvorlige former som er rutinemessig forbundet med en høy dødelighet^1,2,4.

Samlet, murine modeller av allo-HCT har dukket opp som uvurderlig verktøy for å identifisere og studere immun-mediert mekanismene bak patogenesen av GvHD⁵. Men kinetic vurdering av, for eksempel gunstige effekter av romanen terapeutisk intervensjon over tid i levende mus er rutinemessig basert på fastsettelse av klinisk GvHD score⁶. Mens disse resultatene er egnet til å reflektere, for eksempel generelle sykdom byrden (dvs. systemisk GvHD), klinisk score mangel følsomheten til pålitelig speile organ-spesifikke manifestasjoner (f.eks, i tarmen). Derfor bommer konklusjoner, for eksempel med hensyn til gut-beskyttende effekten av en gitt terapeutisk intervensjon, som er basert på disse scoring systemer vanligvis.

Til tross for store fremskritt gjennom oppfinnelsen av romanen hele kroppen imaging modaliteter i kombinasjon med bruk av enten bioluminescent eller fluorescerende genetisk musen modeller^7,8, metoder til direkte og spesielt vurdere den intestinal manifestasjon av GvHD i levende mus mangler. Derfor er begrunnelsen bak protokollen for endoskopisk vurdering av intestinal GvHD fenotypen beskrevet i neste del å overvinne denne hindringen. Videre motivasjon er også redusere eksperimentelle mus numbers siden, så langt, en detaljert vurdering av mobilnettet morfologiske og molekylære egenskaper (f.eks, av histopatologi eller molekylærbiologi) av intestinal GvHD manifestasjon slutt kreves ofringen av eksperimentelle musen.

Våre institusjon har tidligere rapportert på metoder for en mini-endoskopisk vurdering av colonic manifestasjoner i syngeneic kolitt modeller⁹. I protokollen presenteres her, vi har raffinert og tilpasset den colonoscopic scoret matrise for alloresponse-drevet kolitt i levende mus med intestinal GvHD på transplantasjon av alloreactive HCT og donor lymfocytter i en MHC, klasse jeg fullt feil innstilling . Vi identifisert fire parameterne egnet gjenspeiler tarm GvHD-relaterte colonic lesjoner. Videre etablerte vi en system det innrømmer en finjustert gradering av enhver enkelt determinant, noe som resulterer i en ny poengsum som lett informerer leseren om alvorlighetsgraden av intestinal GvHD i en gitt mus på et gitt tidspunkt. Histopathological analyser bekreftet at en endoskopisk score over en bestemt dørterskel er pålitelig forutsi moderat til høy klasse vev betennelse. Derfor synes mini-endoskopisk evaluering å representere arbeider erstatning for gullstandarden histopatologi som rutinemessig krever ofringen av eksperimentelle musene. Viktigst, denne protokollen kan brukes til nesten enhver tid og kan brukes flere ganger i løpet av sykdommen^10,11. Videre, i motsetning til bruk av bioluminescens-avhengige, ingen arbeid-intens og tidkrevende tiltak som intercrossing genetisk endret mus er nødvendig, og derfor metodikken kan brukes på nesten alle mus-linje interesse.

Til sammen har gitt skadelig klinisk perspektiv allo-HCT pasienter med alvorlig intestinal GvHD, er rask vitenskapelig fremgang og mer innsikt i molekylære mekanismer bak immun patogenesen sterkt behov. Tilsvarende krever viktig, etiske betraktninger at gevinsten av kunnskap skal oppnås med bruk av minimal antall eksperimentelle mus. Derfor anerkjent både krav på forskningen fellesskapet å utforske intestinal GvHD kan være avansert ved å implementere serielle mini-endoskopisk evalueringer av kolon i eksperimentelt arbeid kjeden å overvåke og Vurder intestinal GvHD i live eksperimentelle mus modeller, som beskrevet og validert i protokollen presenteres her.

Protocol

Eksperimentell metodene som er beskrevet her er godkjent av myndighetene i Mittelfranken, Bayern, Tyskland.

1. GvHD induksjon

1. Dag 0: Hele kroppen bestråling av mottakeren mus
   1. Bruke kvinnelige CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c mus som er minst 10 uker gammel som mottakere.
   2. Veie og ta vekten av mottakeren musene før GvHD induksjon.
      Merk: Kontroller at mottakeren har en minimal kroppsvekt 20 g. Start kroppsvekten vil tjene som referanseverdi beregne vekttap av personlige musen i løpet av GvHD induksjon og progresjon.
   3. Sett opp til fem mus i av X-ray-irradiator.
   4. Irradiate musene av hele kroppen bestråling med en enkelt dose av 8 Gy av X-ray. Bruke Cs¹³⁷ som en strålingskilder.
2. Dag 1: Rekonstituering av bestrålt mus med T-celle-utarmet benmarg
   MERK:Transplantasjon av allogene bein margtransplantasjon celler, som skissert og detaljert under paragraf 1.2, bør skje innen 24 timer etter bestråling. Utføre fremgangsmåtene nedenfor i et sterilt vev kultur hette og bruke filtrerte reagenser. Bruk allogene CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl mus som donorer for T-celle-utarmet benmarg.
   1. Euthanize CD45.1/Ly5.1 B6. SJL mus som vil donere allogene bein margtransplantasjon celler i henhold til institusjonelle veiledning, 12-24 h etter irradiation av mottakerens BALB/c mus. For dette, bedøve CD45.1/Ly5.1 B6. SJL mus ved inhalasjon av 5% isoflurane. Fortsette med isoflurane eksponering over 1 min etter puste arrestasjon og Bekreft euthanasia cervical forvridning.
   2. Desinfiser det fur og hud av musen grundig med 70% etanol.
   3. Posisjon musen på en ren arbeider skjede slik at musen er i en utsatt posisjon, med sin bakfjerding overfor eksperimentator. Løft pelsen på akilleshæl med spissen av en Semken tang med en lengde på 13 cm og taggete buet tips. Incise huden mellom tang og hælen med herdet 8,5 cm fine saks rett tips.
   4. Forlenge innsnitt cranially (dvs. fra hælen over lavere leggen og låret til hip-regionen). Fjern i hud og pels fra hind ben ved hjelp av pinsett.
   5. Utfør samme prosedyre på andre hind lem.
   6. Fjerne bakbeina ved å skjære gjennom tilstøtende hoften skjøt.
   7. Klippe bort poter bak. Skjære gjennom kneleddet. Lagre lår og skaft av hver hind lem sammen i en 92 mm Petriskål fylt med fosfat-bufret (PBS) saltvann på is.
   8. Rengjør femur og tibia bein nøye ved å fjerne så mye muskelvev som mulig fra enhver lår og skaft. Overføre femur og tibia bein til en 50 mL tube fylt med sterilt RPMI 1640 medium og sted den på våt is til alle tibia og femur Ben samlet i trinn 1.2.7 fjernes fra muskelvev.
   9. Å isolere benmargen, overføre en femur eller tibia bein samtidig (som har blitt renset som beskrevet i trinn 1.2.8) fra 50 mL røret til en Petriskål (med en diameter på 92 mm) fylt med RPMI 1640 medium. Skjær endene av femur eller tibia med skalpell å få tilgang til i hulrommet i benet som inneholder benmargen.
   10. Forberede en 50 mL samling rør med 5 mL av RPMI 1640 medium. Sett inn en 26 G nål knyttet til en 1 mL sprøyte fylt med 1 mL av RPMI 1640 medium inn i hulrommet i benet og tømme benmargen av hulrommet inn i samling røret ved å skyve stempelet.
   11. Gjenta trinn 1.2.10 til benet vises lett og blankt (dvs. bein hulrommet er synlig uten rødlig benmarg). Kast tom benet.
   12. Gjenta 1.2.9 - 1.2.11, med alle femur og tibia bein fra trinn 1.2.8, og samle alle gjenopprettede benmarg brikker i samme 50 mL samling rør fra trinn 1.2.10. Holde samling røret på våt is til alle bein fra trinn 1.2.8 er behandlet deretter.
   13. Opprette en encellet suspensjon av sakte pipettering spyles, smuldrete benmarg bitene opp og ned. Filtrere benmarg encellede suspensjon gjennom en 40 µm mesh skjermen celle sil plassert på en ny 50 mL samling rør.
   14. Sentrifuge 50 mL samling rør som inneholder benmarg encellede suspensjon 450 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
   15. Resuspend pellet i 5 mL ACK lysing bufferen (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7.2) for røde blodlegemer lysis. Inkuber celle suspensjon for 3 min ved romtemperatur. Etterpå umiddelbart legge 10 mL PBS løsning til celle suspensjon.
   16. Sentrifuge suspensjon 450 x g i 5 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend cellene i 2 mL PBS løsning.
   17. Telle bein margtransplantasjon celler, med en hemocytometer. Bevare en aliquot av 6 x 10⁶ celler for flyt cytometri analyse sjekke renheten av cellene etter celle rensing (se trinn 1.2.20).
   18. For uttømming av T-celler fra benmargen encellede suspensjon, kan du bruke en kommersielt tilgjengelig celle rensing kit. Magnetisk tømmes CD90.2⁺ celler (dvs. lymfocytter) fra total bein margtransplantasjon celler, etter produsentens protokoll.
   19. Telle T-celle-utarmet bein margtransplantasjon celler som har vært isolert som beskrevet i trinn 1.2.18, med en hemocytometer. Bevare en aliquot 1 x 10⁶ celler for flyt cytometri analyse utføres senere som beskrevet i trinn 1.2.20.
       Merk: På middels celle avkastningen fra en donor musen er vanligvis fra 2 x 10⁷ til 3.4 x 10⁷ T-celle-utarmet bein margtransplantasjon celler.
   20. Bekrefte en vellykket T-celle uttømming av flowcytometri. Stain 1 x 10⁶ celler, bevart fra trinn 1.2.17 (bein margtransplantasjon celler før magnetiske celle separasjon) og 1.2.19 (T-celle-utarmet bein margtransplantasjon celler etter magnetiske celle separasjon), med følgende antistoffer: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 ( GK1.5), og α-CD8α (53-6,7). Bruk de gjenværende cellene fra trinn 1.2.17 som en unstained kvinne kontroll og enkelt flekker kontroller, til å angi flyt-cytometer.
       1. Overføre 1 x 10⁶ celler fra hver prøve til et godt av en 96-brønns plate med V-bunn utføre flyt cytometric flekker prosedyren.
       2. Nedspinning cellene i 96-brønnen platen (trinn 1.2.20.1) på 450 x g i 5 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend cellene i 100 µL av FACS buffer (PBS med 3% filtrert bovin serum).
       3. Sentrifuge cellene i 96-brønnen platen på 450 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
       4. Legge til en passende mengde antistoffer valgfrihet (Sammenlign med trinn 1.2.20) prøver for enkelt farging i 100 µL FACS bufferen.
       5. Forbered en blanding av alle antistoffer (master mix) som inneholder de passende mengder tilstrekkelig separat stain benmarg celle dele bevart fra tidligere (se trinn 1.2.17) og etter (se trinn 1.2.19) magnetiske T-celle uttømming. Legg 100 µL av master mix til begge dele.
       6. Legge til bare 100 µL av FACS buffer unstained kvinne prøven.
       7. Inkuber cellene i 96-brønnen platen etter 20 min på 4 ° C i mørket.
       8. Legg 100 µL FACS bufferen og sentrifuge cellene i 96-brønnen platen på 450 x g i 5 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend cellene i 100 µL FACS bufferen.
       9. Sentrifuge cellene på 450 x g i 5 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend cellene i 250 µL FACS bufferen.
       10. Overføre prøvene slik 5 mL polystyren runde bunn og analysere dem med en flyt cytometer instrument som er kjøpedyktig merker fluorescerende molekylene som ble brukt til å merke antistoffer ansatt å karakterisere celle prøvene (se trinn 1.2.20).
       11. Sammenligne celle sammensetningen fra før og etter magnetiske celle separasjon.
           Merk: Renhet av ca 95% CD45.1⁺CD3^- (dvs. T-celle-utarmet bein margtransplantasjon) celler i levende porten er vanligvis oppnås.
   21. Vask av T-celle-utarmet benmarg celle suspensjon 2 x med PBS løsning (450 x g i 5 min på 4 ° C) og, til slutt, resuspend cellene i PBS løsningen, justere celle konsentrasjonen til 5 x 10⁷ celler/mL. Holde cellene på våt is til injeksjon.
   22. Injisere T-celle-utarmet bein margtransplantasjon celler i mottakerens musene, som var irradiated dagen før (se avsnitt 1.1).
       1. Plassere eksperimentelle musen i en lekkasjesikker kammer og indusere anestesi ved inhalasjon av opp til 4% isoflurane, til musen er bevisstløs. Bekreft analgesi og tap av bevissthet ved testing tap av rettende refleks og påfølgende tap av pedalen trekke refleks.
       2. Injisere 5 x 10⁶ T-celle-utarmet bein margtransplantasjon celler (dvs. 100 µL av 5 x 10⁷ celler/mL) som inneholder PBS løsning ved hjelp av en 1 mL sprøyte utstyrt med en 30 G nål intravenøst i retrobulbar plass som inneholder venøs sinus.
3. Dag 2: Overføring av T-celler
   Merk: Utføre beskrevet fremgangsmåtene nedenfor i sterilt vev kultur hette og bruke filtrerte reagenser. Bruk CD45.2 C57Bl/6 (vill-type; WT) mus som givere for alloreactive T celler. Bruken av congenic markør systemer tillater distinguishability mellom mottaker (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c mus) og donor blodkreft celletyper (bein margtransplantasjon celler: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. SJL mus; allogene T celler: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 mus).
   1. Euthanize C57Bl/6 mus i samsvar med den bruke institusjonelle retningslinjer og myndigheter. Derfor bedøve mus ved innånding med en konsentrasjon av 5% isoflurane. Fortsett isoflurane eksponering til 1 min etter puste arrestasjon og Bekreft euthanasia cervical forvridning. Desinfiser det fur og hud av musen grundig med 70% etanol.
   2. Plass en sil med en 40 µm mesh skjermen på en 50 mL samling rør. Fjern milten og plassere den på silen.
   3. Med en sprøytestempelet, comminute milten i silen. Vask sil og sprøytestempelet med PBS å samle alle splenocytes.
   4. Sentrifuge cellene i 50 mL samling røret på 450 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
   5. Resuspend splenocytes i 3 mL ACK lysing buffer lyse røde blodlegemer. Inkuber celle suspensjon for 3 min. etterpå legge 10 mL PBS og sentrifuge cellene på 450 x g i 5 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend splenocytes i PBS.
   6. Telle milt celler, med en hemocytometer. Avlede en aliquot av 6 x 10⁶ celler for flyt cytometri analyse, for å vurdere omfanget av rensing i trinn 1.3.9.
   7. For en total CD3⁺ T-celle isolasjon fra total splenocytes, bruke en kommersielt tilgjengelig celle rensing kit. Isolere splenic T celler, etter produsentens protokoll.
   8. Telle splenic CD3⁺ T celler isolert som beskrevet i trinn 1.3.7, ved hjelp av en hemocytometer. Bevare en aliquot 1 x 10⁶ T celler for flyt cytometri analyse.
      Merk: På middels avkastningen av splenic T celler per donor musen isolert av magnetiske celleområder separasjon fra 1,3 x 10⁷ 2 x 10⁷ celler.
   9. Bekrefte suksessen med T-celle isolasjonen av flowcytometri. En detaljert beskrivelse av fargeprotokoll, tildele og følg trinnene 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Stain 1 x 10⁶ splenocytes trinn 1.3.6 (før magnetiske celle separasjon) og 1.3.8 (etter magnetiske celle separasjon) med følgende antistoffer: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) og α-CD8α (53-6,7).
      2. Bruk de gjenværende cellene fra trinn 1.3.6 som en unstained kvinne kontroll og enkelt farging med respektive antistoffer, til å angi flyt-cytometer.
      3. Sammenligne celle sammensetningen før og etter magnetiske celle separasjon.
         Merk: En renhet av ≥95% av CD45.2⁺CD3⁺ T celler i lymfocytt live porten skal oppnås.
   10. Vask T celler 2 x med PBS (450 x g i 5 min på 4 ° C) og, til slutt, resuspend cellene i PBS løsningen, justere celle konsentrasjonen til 7 x 10⁶ celler/mL. Holde cellene på is til injeksjon.
   11. Sette inn alloreactive, splenic T-celler (se trinn 1.3.10) i bestrålt BALB/c mus som tidligere har mottatt CD45.1⁺ T-celle-utarmet bein margtransplantasjon celler (se trinn 1.2.22).
       1. Indusere anestesi ved å plassere eksperimentelle musen i en lekkasjesikker kammer som det er utsatt for opp til 4% isoflurane til det mister dens bevissthet. Bekreft analgesi og tap av bevissthet ved testing tap av rettende refleks og påfølgende tap av pedalen trekke refleks.
       2. Injisere 0,7 x 10⁶ alloreactive CD3⁺ T celler ved hjelp av en 1 mL sprøyte utstyrt med en 30 G nål   (dvs., 100 µL av 7 x 10⁶ celler/mL) som inneholder PBS løsning (se trinn 1.3.10), intravenøst inn i retrobulbar plass av mus, å indusere GvHD. Denominate disse musene som forsøksgruppen.
       3. Sette inn en annen gruppe av mus med 100 µL av PBS alene, intravenøst i retrobulbar plass og denominate denne gruppen som kontrollgruppen, senere kalt "no-T-celle-transplantert (ikke) mus".

2. vurdering av systemisk GvHD

Merk: Denne fremgangsmåten i et halvt sterilt rundt en eksperimentell rommet lisensiert og utstyrt for å håndtere live mus i dyr anlegget.

1. Følg klinisk løpet av GvHD i individuelle mus; spesielt vurdere og score eksperimentelle musene 3 x i uken for tilstedeværelsen av klinisk GvHD symptomer, basert på et poengsystem beskrevet nedenfor og tilpasset fra poengberegningssystem etablert tidligere av Cook et al.⁶.
   1. Veie hver musen individuelt, ta vekten og beregne thespecific kroppen vekttap referanse til kroppsvekten ble det bestemt før starten av eksperimentet (tilsvarende 100%) på dagen 0 (trinn 1.1.2). Score et vekttap på mindre enn 10% av startvekt med klasse 0, en vekttap mellom 10% og 25% klasse 1 og et vekttap på mer enn 25% klasse 3.
   2. Score aktivitetsnivået hver mus, diskriminerende mus med et vanlig (poeng = 0) fra mus med et moderat redusert aktivitet (score = 1) og mus med stasjonære atferd med mindre de er eksternt stimulert (poeng = 2).
   3. Score fur tekstur, diskriminerende og dermed en normal, skinnende og kempt pels (score = 0) fra en moderat ruffled pels (poeng = 1) og tilstedeværelsen av bare flekker (poeng = 2).
   4. Score hudteksturen, diskriminerende normal hud (poeng = 0) fra sporadisk flekker av skalering huden (f.eks på hale og paws) (score = 1) og åpenbare skalering og sår hudområder (poeng = 2).
   5. Analysere konsistensen av utskilles krakk fraksjoner. Score krakk med en normal (dvs., hard konsistens) med karakteren 0 krakk med deformerbare og myke krakk med klasse 1 og krakk uten noen konsistens og dermed med meget streng diaréen med grad 2.
   6. Oppsummere alle separat scoret parametere maksimal klinisk poengsummen 12 per musen.
2. Vurdere og evaluere kriteriene for opphør forsøket på grunn av gjeldende sykdom alvorlighetsgraden nivå av personlige musen, bruk institusjonelle retningslinjer og autorisert animalsk-protokollen.

3. vurdering av Intestinal GvHD

1. Scoring av GvHD-relaterte lesjoner av mini endoskopi i distale colorectal regionen
   MERK:Utføre dette i et semisterile rundt en eksperimentell rommet lisensiert og utstyrt for å håndtere live mus i dyr anlegget. Bruk en mini-endoskopisk arbeidsstasjon som er godkjent for bruk av liten dyrene.
   1. Klargjør endoskopisk enheten ved å dekke teleskop med (1,9 mm diameter) og en lengde på 10 cm med endoscopic undersøkelse skjede. Rengjøres og steriliseres endoskop med vann og etanol.
   2. Slå på datamaskinen og justerbar xenon lyskilden Kameramodul, og satt fokus på en måte at objekter like ved objektivet gir et klart bilde.
   3. Koble luftpumpe til endoskopisk skjede. Visualisere luftstrøm, dyppe spissen av endoskop i et beaker glass fylt med vann. Regulere luftstrøm ved å justere ventilen mellom luftpumpen og endoskopisk skjede. Juster den til en langsom, konstant luftstrøm, reflektert av noen kontinuerlig stigende bobler.
   4. Plass musen i en lekkasjesikker kammer. Indusere anestesi ved inhalasjon av opp til 4% isoflurane til musen er bevisstløs. Bekrefte analgesi og en fraværende delstaten reflekser av testing tap av rettende refleks og påfølgende tap av pedalen trekke refleks.
   5. Bruk en passende veterinær-anestesi maskin i samsvar med dyr protokollen som brukes. Overføre musen fra kammer til koloskopi arbeidsområdet. Her arbeider posisjon bedøvet musen, med nesen sin i nosecone (som er koblet til anestesi instrumentet), på en ren skjede slik at musen er i en utsatt posisjon mot eksperimentator med sin bakfjerding.
   6. For å opprettholde anestesi under koloskopi prosedyren, redusere isoflurane konsentrasjonen til ca 2%. Dataskjerm musen er åndedrett og respons på stimulering under koloskopi og justere isoflurane konsentrasjonen på vaporizer om nødvendig. Dekk musen er øynene med salve å hindre dem fra å bli tørr.
   7. Kontroll effekten av anestesi ved pinching mellom tærne på musen. I tilfelle av fraværende reaktivitet, Fortsett å gå 3.1.8.
   8. Løft halen like over halen roten med én hånd og nøye setter endoskop, plassert i den andre hånden, via anus i endetarmen.
   9. Mens luftstrøm utløses colorectal lumen, sakte og forsiktig flytte endoskop frem i aboral retning.
   10. Plasser endoskop i colonic lumen og opprettholde denne posisjonen for å minimere kontakt med colonic veggen og unngå å gjøre riper, dypere vegg-relaterte skader (f.eks resulterer i blødning), eller selv vegger perforering (se trinn 3.1.17) . Kontrollere dette trinnet ved permanent ser det video strømmen (dvs. under konstant visualisering av colonic kupé).
   11. Hvis avføring constrict visningen, fjerne endoskop og utføre en klystèr rectally rødme med opptil 2 mL saltoppløsning, bruke en myk Pasteur pipette. Bruk som lite væske som mulig, for å forhindre en uønsket fortynning av avføring og andre sekundære effekter negativt påvirker slimhinnen, og til slutt, scoring resultatene.
   12. Prøv å regelmessig plassere endoskop på en definert (dvs., tydelig) anatomiske området distale kolon å standardisere scoring av colonic betennelse og å optimalisere sammenlignbarheten scoring resultatene mellom mus og eksperimenter.
       Merk: Vanligvis med stive endoskop, kan en maksimal dybde på 4 cm nås via endetarms rute. Mellom 2 og 4 cm aborally, blir kolon regelmessig til en flexure som ikke kan sendes med den stive colonoscope. Bruk regionen kolon distally ved flexure som standard scoring spot.
   13. Begynne å registrere videostrømmen og begynner med scoring av betennelse.
   14. Evaluere GvHD-relaterte betennelser i tykktarm scoret parametrene forklart og avbildet i tabell 1 og Figur 3.
       1. Flytt endoskop scoring spot forsiktig og litt tilbake - og fremover for å vurdere de ulike parametrene.
       2. Vurdere parameteren "gjennomskinnelighet", samt "krakk konsistens", ved å plassere endoskop i større avstand i forhold til colonic veggen.
       3. Vurdere parametere "nivåer" og "vascularity" ved å plassere endoskop i nærheten colonic veggen. For denne oppgaven, nøye bruke godt dosed spenning på colonic veggen med spissen av endoskop.
   15. Ved ferdigstillelse av scoring prosessen, stoppe innspillingen.
       Merk: Etterpå kan innspilt videoklippet brukes sammen eller brukes til å generere representant bilder (dvs. skjermbilder) mini-vanndampsteri vurdert kriteriene samlet bidra til colonic betennelse.
   16. Fjern forsiktig i endoskop.
   17. Avslutte isoflurane utstilling ved å overføre musen til separate bur der det er eksponert for luft. Varm musen med røde lys lampe og observere musen før den gjenoppretter fra anesthetic og gjenvinner full bevissthet.
       Merk: På grunn av luft inflasjonen i tykktarmen under endoscopy vises mageregionen museklikk opphovnet opp direkte etterpå. Mens dette er normalt og av forbigående Art, kan langvarig tegn til massiv og selv progressive inflasjon av magen og feil på utvinning av musen indikere en utilsiktet perforering av kolon (i dette tilfellet må musen være euthanized umiddelbart).
   18. Ved fullstendig gjenoppretting, plasserer du musen tilbake i sine respektive bur.
   19. Valgfri tilnærming: det er også mulig å ta visning-guidede vev biopsier. Ta følgende trinn.
       Merk: Koloskopi utføres på samme måte som beskrevet i trinnene 3.1.1 - 3.1.18, med følgende endringer.
       1. I trinn 3.1.1, bruker du en endoscopic undersøkelse slire med en innebygd kanal som fungerer, i stedet for en enkel undersøkelse skjede uten arbeider kanaler, for å dekke teleskopet. Innføre en biopsi tang i arbeider kanalen til sine tips er bare synlig foran endoskop på skjermen fordi dette i stor grad hindrer utilsiktet skade på tarmen.
       2. Fortsett med trinnene 3.1.2 - 3.1.11. Sett inn endoskop i tykktarm og skyv det nøye fremover til stedet av interesse.
       3. Ansette ved hjelp av en andre eksperimentator for vervet av tar colonic vev biopsier. Spør den andre eksperimentator navigere spissen av biopsi tang til colonic regionen valgfrihet ved å skyve tang innenfor arbeider kanalen sakte frem til kjevene av Tang kan åpnes. Stadig se videostrømmen under denne prosedyren for å minimere risikoen for skade colonic veggen.
       4. Gjenopprette en colonic veggen Vevsprøve nøye åpner og lukker kjevene av biopsi tang.
          Merk: Gjør dette med forsiktighet for å hindre perforering av colonic veggen. I sjeldne tilfelle av en colonic perforering, umiddelbart ofre berørte musen ved å bruke målinger i henhold til institusjonelle veiledning og under kontinuerlig administrasjon av anestesi.
       5. Trekke tilbake og fjerne lukket tang ut av arbeider kanalen. Ta prøven ut kjevene av biopsi tang dyppe og forsiktig risting åpnet tang i sterilt PBS løsning. Etterpå Velg riktig lagringsforhold for vev prøven, i henhold til planlagte nedstrøms analysene. Etter desinfeksjon med 70% etanol, kan tang gjenbrukes for å ta videre biopsier.
       6. Etter å ta biopsies, fjerne endoskop og ferdig koloskopi som beskrevet i trinnene 3.1.16 - 3.1.18.
2. Histopathological analyse
   1. Mellom dager 26 og 30 etter X-ray bestråling, euthanize allo-HCT mottaker musene i samsvar med bruk av institusjonelle retningslinjer og myndigheter. For dette, bedøve mus ved inhalasjon av 5% isoflurane. Fortsette med isoflurane eksponering for 1 min etter puste arrestasjon og Bekreft euthanasia cervical forvridning. Grundig Desinfiser det fur og hud av musen med 70% etanol.
   2. Åpne bukhulen og fjerne tykktarmen. Overføre det til en Petriskål (med en diameter på 92 mm) med PBS.
   3. Fyll en 5 mL dispenser tips med PBS. Ved hjelp av en Semken tang med en lengde på 13 cm og taggete buet tips, slip den distale del av kolon (ca. 5 mm) over tuppen av dispenser spissen. Nøye fikse kolon med tang på dispenser spissen og tømme colon med PBS ved å trykke inn stempelet dispenser tips å fjerne avføring fra tarmen.
   4. Klipp ut en colonic segmentet ligger cirka 5 mm fra anus, ved hjelp av en skalpell.
   5. Fikse resected gut prøven på 4,5% formaldehyd over natten. Før bygge det inn i parafin, plassere vevet i oppreist stilling.
   6. Klipp 3 µm tverrsnitt av parafin-embedded kolon vev og stain dem med hematoxylin og eosin (han), ved hjelp av standardprotokoller flekker.
   7. Forberede han-farget tverrsnitt av kolon.
   8. Tilpasset fra scoring matrix rapportert av Kaplan et al.¹², histopathologically score inflammatorisk aktiviteten semiquantitatively, med score 0-3: ingen betennelse (poeng = 0), mild betennelse (score = 1), moderat betennelse (poeng = 2), og alvorlig betennelse (poeng = 3).
      Merk: Ideelt sett bruke for denne oppgaven ekspertisen til en patologen som er erfarne i evalueringen av murine intestinal GvHD og blindet natur av den eksperimentelle og kontroll grupper.

Representative Results

Gjeldende protokollen, beskriver mini-endoskopisk evalueringen av intestinal GvHD-assosiert lesjoner i distale kolon, er opprettet og godkjent i mus tidligere utsatt for systemisk induksjon av en alvorlig akutt GvHD modell. I denne studien vi brukte en MHC, klasse jeg fullt Feilkoblede modellsystem i som BALB/c mus var drepende bestrålt, etterfulgt av transplantasjon av T-celle-utarmet allogene benmargen og av administrasjonen av GvHD-inducing alloreactive C57BL/6 CD3⁺ T-lymfocytter. T-celle-utarmet bein margtransplantasjon celler og splenic T celler for GvHD induksjon ble renset av magnetiske separasjon. Renheten av disse celle populasjoner ble bestemt av flowcytometri og representant resultatene av en renselsesprosess vises i figur 1, viser en tilstrekkelig uttømming av T-celler fra total bein margtransplantasjon celler og en konsekvent anriking av milt-avledet CD3⁺ T celler før deres overføring skal tidligere bestrålt mus. Klinisk kurset vises i figur 2 viser reproduserbar robust induksjon av klinisk systemisk GvHD fenotypen ved allo-HCT i nærvær (WT, svart) vs fravær (ikke grå) av alloreactive donor T-lymfocytter. Scoring system tidligere rapportert av Cooke et al. representerer en Summer kjerne som seks parametere er vurdert og gradert: kropp vekt, holdning, aktivitet, tekstur hud og pels og krakk konsistens⁶. Kontroll mus erfarne bare tidlig forekommende toppen av klinisk score, mellom dager 5 og 10, som var tilsvarende observert i T-celle-mottak mus og er derfor hovedsakelig på grunn av at bestråling-assosiert systemisk inflammatorisk respons. Uansett, kliniske resultater av donor T-celle-mottak mus begynte å stige tidligere viste en høyere totale topp, bare transiently redusert etter først topp og deretter i hovedsak økt igjen, kontinuerlig gjenværende den eksperiment. Samlet sett er disse resultatene med tolkningen som T-celle-mottak mus viser sterkere og mer progressive tegn til systemisk GvHD forhold til mus.

Donor T-lymfocytter-mottak allo-HCT musene viste ulike tegn til akutt orgel-relaterte og systemisk GvHD manifestasjoner, samlet som resulterer i høy summen score, mens kontroll mus manglet moderat til alvorlig følelser, spesielt på senere tidspunkt. Imidlertid er underskriver av intestinal GvHD underrepresented i den systemiske GvHD scoring system, der bare vurdert gut-relaterte parameteren er krakk konsistens. Som vist i tabell 1, mini-vanndampsteri assessable kriterier ble definert, beregnet spesielt for presis beskrivelse, scoring og gradering av intestinal GvHD-assosiert lesjoner, ved å tilpasse kriterier tidligere rapportert for evalueringen syngeneic kolitt til sammenhengen av alloresponse-drevet kolitt⁹. Figur 3 viser vanlige eksempler for hvert enkelt kriterium, illustrerer type og omfanget av intestinal GvHD-assosiert lesjoner, visualisere og dermed gradering matrisen brukes under mini-endoskopisk evalueringen av det distale kolonet av GvHD utsatt mus på transplantasjon av MHC, klasse jeg fullt Feilkoblede donor lymfocytter.

Figur 4 En viser at intestinal GvHD summen score resultater som er basert på kriteriene definert i tabell 1 og vises i figur 2 enkelt aktivere eksperimentator å diskriminere donor lymfocytt-mottak mus med alvorlig underskriver av intestinal betennelse fra kontroll mus som er essensielt blottet for GvHD. For å validere den mini-vanndampsteri basert karakterskala, ble histopathological studier utført ved hjelp av en tidligere rapportert mikroskopiske gradering systemet¹². Dataene i Figur 4B bekrefter at kolon mus er alvorlig påvirket av GvHD-relaterte betennelse, noe som gjenspeiles av høy colonoscopic summen score, vise tilsvarende sterke histopathological tegn til betennelse, gitt en histopatologisk summere score på ≥2 postmortem. Derimot kolon vev av kontroll mus vise nei (skala 0) eller i de fleste, mild (score 1) histopathological underskriver av betennelse, i tråd med fraværet av mini-vanndampsteri synlig tegn på kolitt. Videre, som vist i Figur 4C, D, vurdert korrelasjon studier mellom mini-vanndampsteri og histopathologically kolitt aktivitet og systemisk GvHD score ble utført. Viktigere, vist disse studier at mini-vanndampsteri bestemt sum scorene til ≤3 sikkert forutsi fravær av midten til høyere klasse (dvs. ≥2) intestinal GvHD-assosiert colonic betennelse score fra histopathological gradering. Til slutt, alvorlighetsgraden av vanndampsteri vurdert intestinal GvHD viser en sammenheng med systemisk GvHD aktivitet.

Figur 1 : Flow cytometric kvalitetsvurdering av magnetisk renset T-celle-utarmet bein margtransplantasjon celler og allogene splenic CD3⁺ T celler. (A) uttømming av CD90.2⁺ bein margtransplantasjon celler av magnetiske separasjon, ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig rensing kit. Renheten av T-celle-utarmet bein margtransplantasjon celler ble bestemt av flowcytometri, av flekker celler før og etter T celle uttømming med anti-CD45.1 og anti-CD3. Resultatene fra en representant eksperiment vises. (B) Splenic T celler ble magnetisk renset, ansette en kommersielt tilgjengelig rensing kit. Renhet ble bestemt av flowcytometri, sammenlignende frekvenser av CD45.2 og CD3 costaining av prøver avledet fra før og etter T cellen Aisolering. Resultatene fra en representant eksperiment vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Klinisk selvfølgelig GvHD, ansette en MHC, klasse jeg fullt feil modell. For å indusere akutt GvHD, var BALB/c mus hele kroppen bestrålt dag 0. Mus mottatt T-celle-utarmet bein margtransplantasjon celler 24 timer senere (d1). På dag 2, musene ble injisert med allogene splenic CD3⁺ T celler (vill-type [WT]; n = 9). Som en kontroll mottatt noen mus T-celle-utarmet benmarg alene (ikke; n = 9). Mus var spesielt vurdert tre ganger i uken for tilstedeværelse og alvorlighetsgraden av kliniske symptomer på GvHD. Dataene representerer mener verdier ± SEM av de kliniske resultatene innhentet fra personlige mus av gruppen angitt behandling fra to representant eksperimenter. Dataene ble analysert av toveis VARIANSANALYSE, etterfulgt av Bonferronis flere sammenligninger posttest. p < 0,0001 ble ansett som viktig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Representant bilder illustrerer gradering eksempler underliggende scoring matrisen intestinal GvHD-relaterte kolon endringer vurdert av en mini-endoskopisk evaluering av kolon av live, allo HCT-behandlet mus. For å utfylle og illustrere den detaljerte beskrivelsen av brukte scoring gradering og systemet i tabell 1, representant mini-endoskopisk bilder av evaluerte alvorlighetsgrad nivåene (gradering) for alle parametere individuelt i tykktarmen av anesthetized, Live mus gjennomgår allo-HCT mellom dager 26 og 30 før som beskrevet i figur 1 , vises her. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 : Mini-endoskopisk scoring og gradering av intestinal GvHD-relaterte betennelser i tykktarm, pålitelig forutsi tilstedeværelsen av materialer av høyere kolitt vurdert histopathological scoret. (A) mellom dager 26 og 29 etter induksjon av GvHD som beskrevet i figur 1, manifestasjonen av intestinal GvHD ble evaluert av mini endoskopi i live, bedøvet mus. Colonic endringer ble scoret og gradert etter scoring og gradering systemet avbildet i tabell 1 og figur 2. Representant endoskopisk bilder av kontroll (ingen T celle ikke) og vill-type (WT), T-celle-mottak mus og mini-vanndampsteri vurdert score (øverst) vises. (B) musene ble ofret 12t etter mini-endoskopisk evalueringen, og den distale del av kolon ble behandlet og histopathologically vurdert. Inflammatorisk aktiviteten til hematoxylin - og eosin-farget tverrsnitt av distale kolon ble sensurert. Representant hematoxylin - og eosin-farget tverrsnitt av distale kolon av ingen T-celle - og WT T-celle-mottak allo HCT-behandlet mus og den tilsvarende histology score vises. Dataene i paneler A og B ble analysert av Student t-test og vises som gjennomsnittlig ± SEM. ***p < 0,0001 ble ansett som viktig. WT: n = 15; Ikke: n = 15. Dataene representerer grupperte data fra fire individuelle eksperimenter. (C) avhengighet av koloskopi scoring og histologiske scoring. Dataene vises som boksen plott. Hver blot viser medianen (svart linje i hver boks), rekke data (min til max) og kvartiler (områder av hver boks). WT: n = 15; Ikke: n = 15. Dataene representerer grupperte data fra fire individuelle eksperimenter. (D) sammenheng mellom koloskopi scoring og klinisk scoring. Både kontrollen og vill-type T-celle-mottak mus er inkludert i sammenheng analysen. Den heltrukne linjen representerer den lineære regresjonslinjen. Spearman korrelasjonskoeffisient (r-verdien) og p-verdien vises. WT: n = 12; Ikke: n = 13. Dataene representerer grupperte data fra tre individuelle eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Poengsum	0	1	2	3
Gjennomskinnelighet av colonic veggen	Ekstra intestinal, indre organer (f.eks milt) grundig synlig	Diskret reduksjon av synligheten av ekstra intestinal organer på grunn av milde ugjennomsiktigheten av colonic veggen	Moderat reduksjon av synligheten av ekstra intestinal organer på grunn av betydelig ugjennomsiktigheten av colonic veggen	Mangelen på sikt av ekstra intestinal organer, dvs. ikke-gjennomsiktige colonic vegg
Detaljnivå	Glatt, upåvirket mucosal overflaten utseende; colonic krypten mønster synlig	Diskret avgrading og brosteinsbelagte utseendet på slimhinnen	Moderat avgrading og brosteinsbelagte utseende slimhinnene overflaten	Alvorlig avgrading og brosteinsbelagte utseende slimhinnene overflaten; pute utseende mucosa
Vascularity	Uendret vaskulær mønster vise kommuniserende nettverket av store og små skip	Diskret endringer av vaskulær mønster; fartøyet mønsteret synes å fray	Noen skip er usynlig; usammenhengende fartøyet nettverk	Kontakt indusert blødning; dot-lignende mønster av fartøyene
Krakk konsistens	Normal; krakk er vanskelig; fine tråder av slim mellom avføring og colonic veggen kan observeres	Krakk er fortsatt formet men kan inneholde fillete kanter; deformerbare med spissen av endoskop	Krakk er myk og unshaped krakk er synlig mer skinnende (høyere vanninnhold)	Krakk er løs, flytende; vannaktig diaré. Krakk kan spres tilfeldig over slimhinnen i tykktarmen

Tabell 1: Mini-endoskopisk scoring og gradering matrise av intestinal GvHD-relaterte lesjoner i tykktarmen live allo HCT-behandlet mus. Endringer av endoluminal og transmuralt kolon morfologi i Tillat-HCT forbehandlet mus ble vurdert av en kolonoskopi i endetarmen og distale kolon bedøvet, live mus, bruker murine mini endoskopi system. Colonic lesjoner ble klassifisert med hjelp av endoskopisk scoring system (endret murine endoskopisk indeks kolitt alvorlighetsgrad [MEICS]) som er utledet fra de opprinnelige MEICS poengsystem rapportert av Becker et al.⁹ og tilpasset sammenheng med Allo-HCT. Distale kolon er visuelt vurdert for tilstedeværelse og omfanget av følgende fire parametere: 1. Transmisjon av endoskopisk lys (gjennomskinnelighet) gjennom colonic tarmveggen som jevning av muren. 2. slimhinnen viser et brosteinsbelagte utseende (oppløsning) av endoluminal-orientert slimhinnen; 3. en endret endometrial blodkar mønster (vascularity); 4. vanndampsteri vurdert krakk utseende på stedet (krakk konsistens). Hver parameter er scoret fra 0 (ingen tegn) 3 (alvorligste fenotypen), legge til en maksimal summen score på 12 per musen.

Discussion

Protokollen beskriver metoder for induksjon og mini-endoskopisk vurdering av colonic fenotypen observert i løpet av intestinal GvHD. Det serverer bredere hensikten slik at forskerne kan studere intestinal GvHD langs- og noninvasively gjennom hele sykdom (dvs. fra utbruddet av colonic manifestasjon og progresjon til maksimal sykdomsaktivitet).

Det er imidlertid noen viktige trinn og viktige begrensninger iboende til presentert metodikkene eksperimentator må være klar over før du installerer teknologiene i respektive vitenskapelige sammenheng. Først, selv om vi har brukt mini-endoskopisk vurdering av intestinal GvHD-relaterte colonic lesjoner i en mindre histocompatibility-feil modell systemet¹¹, forutsatt protokollen her er utelukkende gjelder MHC klasse I fullt umake akutt GvHD modeller. MHC klassen jeg fullt Feilkoblede GvHD modell er vanlige og ofte brukte⁵, det er godt etablert at egenskapene til GvHD manifestasjon er svært avhengig av brukte musen substrains siden dette sterkt påvirker, for eksempel den følsomhet for bestråling. Videre kan eksperimentell musen kilden, for eksempel, en varierende sammensetning av tarmen bakterieflora og brukt Antall overførte allogene T celler kritisk påvirke kinetics og dynamikk av intestinal GvHD manifestasjon¹². Derfor er en avgjørende skritt nøye teste og validere de angitte tiltakene for deres evne til å indusere vellykket intestinal GvHD som vist.

Om den vellykkede implementeringen av live mini-endoskopisk vurderingen av akutte intestinal GvHD ønsker vi å understreke at ved håndtering av endoskop er enkelt, det krever litt trening, å minimere risiko for å oppleve den mest fryktede komplikasjoner (dvs. å autoperforering tarmveggen på stive apparatet sammen med behovet for å air-blåse kolon). En økt inflammasjon-indusert sikkerhetsproblemet og redusert fleksibilitet av colonic vev, kan gut veggen integritet være mer utsatt i postradiation restitusjonsfasen (i.e.,until dag 10) og full manifestasjonen av intestinal GvHD-relaterte kolitt (dvs. etter ca dag 25). Viktigere, men har vi ikke observert betydelig økt komplikasjon priser avhengig av tid utgangspunktet endoscopy, så lenge endoskop er forsiktig Avansert under tilstrekkelig synlighet. Derimot vi identifisert suboptimal medikamentprotokoller for å være en risikofaktor siden en utilstrekkelig dybdeskarpheten anestesi kan resultere i forekomsten av uønskede bevegelser av eksperimentelle musen og konsekvent, colonic veggen perforering hendelser. Andre, det viktigste trinnet under scoring prosessen representerer begrensninger i denne saken på grunn av uønskede tilstedeværelsen av solid eller flytende (f.eks diaré) avføring i tarmen lumen eksperimentator beveger seg på endoskop i scoring posisjon. I denne situasjonen er rødme colorectal regionen med saltvann med en fleksibel plastikk pipe ofte nødvendig. Men siden denne prosedyren kan kompromittere scoring nøyaktigheten og spesifisitet av flere parametere (f.eks krakk konsistens), må denne påminnelse nøye tas i betraktning ved scoring.

Det er flere begrensninger begrense tolkning og konklusjonene fra denne endoskopisk. Først innebygd metode bruker et lite fleksible endoskop via endetarms rute, evalueringene er begrenset til de siste 3-4 cm i mage-tarmkanalen (dvs., endetarmen og distale kolon). GvHD-assosiert følelser proksimale kolon og selv tynntarmen er derfor som standard ekskludert fra evalueringen, indikerer at vitenskapelige spørsmål med fokus på små intestinal fenotypen av GvHD ikke vil dra nytte av denne tilnærmingen. Andre, selv om betennelse er en av de kjennetegn morfologiske funksjonene av intestinal GvHD, flere egenskaper, som en økt apoptose hastighet av tarm epitelceller og tap av tarm krypten arkitektur, finnes ofte og inkludert i histopathological arbeidsflyten underliggende intestinal GvHD scoring og gradering av patologer i Tillat-HCT pasienter. Her korrelert vi restrictedly mini-vanndampsteri vurdert intestinal GvHD resultatet histopathologically vurdert tegn til betennelse. Ta denne tilnærmingen, kom vi til konklusjonen at colonic betennelse over en viss terskel i colonoscopic scoring er pålitelig forutsi tilstedeværelsen av moderat til høy-grade betennelse, som vurdert av histopathological postmortem analyser. Imidlertid fremtidige studier må undersøke hvordan, for eksempel histopathologically vurdert apoptose priser gjelder mini-endoskopisk totalt summen score eller, for eksempel en av de fire enkelte parametrene innebygd i summen score. Tredje, mens mus lider histopathologically moderat-til-høy-grade GvHD kan lett identifiseres av endoskopisk scoring tilnærming, mus mer subtile tegn til intestinale betennelsen kan gå glipp av beskrevet tilnærming, gitt faktum at histopathological scoring avsløre tilstedeværelsen av mild tegn av betennelse i gruppen av mus gjennomgår allo-HCT alene, uten transplantasjon av alloreactive donor lymfocytter. Biologisk, kan dette funnet være mulig, siden mus har vært allotransplanted og minimal kolitt kan faktisk er reflektere tilstedeværelsen av lave nivåer av GvHD på grunn av en ufullstendig fjerning av T-celler fra benmargen celle brøkdel eller rekonstituering av alloreactive T celler fra benmargen over tid. Fremtidige studier måtte håndtere disse spørsmålene i mer detalj. Fjerde, formelt denne protokollen fokuserer på fullt etablert intestinal GvHD-assosiert kolitt. Men som vist og publisert tidligere, utbruddet av kolitt rundt dag 15 kan oppdages vanndampsteri og quantitated¹¹. Her kunne GvHD utsatt mus tydelig skjelnes fra mus som colonic fenotypen kan skyldes utelukkende gjenværende tegn av bestråling-indusert vevsskade, eller snarere speil mucosal utvinning svaret etter bestråling¹¹. Imidlertid må fremtidige studier koordinere endoskopisk evalueringer og sikte på detaljerte histopathological analyser av GvHD utsatt mus sammenlignet kontroll mus på tidligere tidspunkt.

Endelig, en interessant og nyttig tillegg anvendelse av endoskopisk scoring av intestinal GvHD er bruken av endoskopisk arbeider kanalen å lede en minimert biopsi tang anatomiske strukturen valgfrihet i tykktarmen. Denne funksjonen gir, som en slags innebygde-i-alternativet, muligheten til å ta visning-guidede vev biopsies som kan analyseres videre av en rekke nedstrøms teknikker som histopatologi immunofluorescence flekker og sanntid PCR analyser av gener av interesse. Imidlertid fremtidige studier vil vurdere formelt om, for eksempel histopathological scoring og gradering av vanndampsteri tatt biopsier er tilsvarende histopathological resultater basert på konvensjonelt tatt prøver (dvs.fra euthanized mus).

Samlet, med denne protokollen som beskriver induksjon og en mini-endoskopisk evaluering av intestinal GvHD, tilbyr vi en metodikk for å vurdere score og Vurder intestinal GvHD i et relevant murine GvHD modellsystem av allo-HCT. Endoskopisk vurderingen kan gjentas i samme musen på flere tidspunkt over tid, eliminerer behovet å avlive mus for å vurdere sekvensielt intestinal GvHD-assosiert vev patologi (f.eks i en terapeutisk innstilling). Mini-endoskopisk scoring resultatene viste seg for å være sammenlignbare resultater oppnås ved histopathological vurdering av intestinal betennelser i tykktarm og korrelert med systemisk GvHD aktivitet. Denne fremgangsmåten kan i tillegg kombineres med visningen-guidede biopsier via arbeider kanalen av endoskop. Til slutt, men fremtidige studier har å vurdere hvor langt histopathologically bestemt morfologiske funksjoner enn betennelse, som er ofte funnet i intestinal GvHD-berørte lesjoner, gjelder resultatene med dette Mini-endoskopisk vurdering og scoring tilnærming.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456