本文提出了一种用烟碱不加污染的方法研究小鼠脑片中烟碱乙酰胆碱受体 (nachr)。当与同时膜片钳记录和 2-光子激光扫描显微镜, 尼古丁发现连接烟碱受体功能与细胞形态, 提供了更深入的了解胆碱能神经生物学。
乙酰胆碱 (ach) 通过受体调节各种神经元的过程, 但它一直是一个挑战, 连接 ach 受体功能与细胞内的亚细胞位置, 其中这个功能进行。为了研究烟碱 ach 受体 (nacr) 在原生脑组织中的亚细胞位置, 提出了一种在电生理记录过程中在神经元膜附近离散位置精确释放尼古丁的光学方法。在 2-光子激光扫描显微镜下, 大脑切片中的斑块夹紧神经元充满染料, 以显示其形态, 而尼古丁的不老化是通过将 405 nm 激光束聚焦在一个或多个细胞膜附近而通过光闪光进行的。测量了细胞电流偏转, 并制作了记录神经元的高分辨率三维 (3d) 图像, 以便将 nahr 响应与细胞形态进行协调。该方法可以详细分析 nahr 在复杂组织制剂中的功能分布, 有望提高对胆碱能神经传递的认识。
胆碱能信号调节许多大脑过程, 包括注意力控制、意志运动和奖励1, 2.增强乙酰胆碱 (ach) 传播的药物被用来治疗与阿尔茨海默氏症相关的认知障碍, 这意味着胆碱能系统在认知3中的重要作用。改善对健康和患病状态中胆碱能受体和电路的了解, 可以为几种神经疾病带来更好的治疗方法。
烟碱性 ach 受体 (nahr) 是一个由配体门控离子通道组成的家族, 可根据烟草制品的内源性 ach 或外源性尼古丁来控制阳离子。考虑到它们是最早被描述为4的神经递质受体之一, nahr 的药理学和在肌肉纤维中的位置是很好理解肌肉类型的受体。相比之下, 对本地 nahr 在大脑中的药理和亚细胞分布的了解相对较少。最近开发了一种新型化学探针, 在细胞成像和电生理记录5的过程中, 通过空间限制和快速激活脑组织中的 nahr 来解决这一知识差距问题。在这里, 介绍了这种方法所涉及的关键方法步骤, 其总体目标是提高将 nahr 功能与神经元结构连接的能力。
可活性尼古丁 (pa-nic; 化学名称: 1-[之二 (羧甲基-氨基] 香豆素-4——可以用 ~ 405 纳米激光闪光光解, 有效释放尼古丁5,6。在发现之前, pa-nic 在溶液中是稳定的, 没有不愉快的药理或光化学特征5。光解后, 释放出的尼古丁可预见地激活 nahr 和未消毒的副产品是药理惰性5。采用连续波激光作为光解光源, 在样品上测量输出功率 & gt;1 mw。局部时, 有针对性的光刺激与用2光子激光扫描显微镜 (2plsm) 定位细胞膜的能力相结合, 充分实现了该方法的两个关键优点: 光解速度和空间精度。
在大多数方面, pa-nic 的光解优于其他将 nahr 配体传递到脑片内受体的方法。这种方法包括洗澡应用7和通过吸管器8号在当地输送药物.前一种方法往往过分强调应用药物的长期影响, 而后一种方法可能会受到试验之间和细胞间反应动力学的变异性的影响。这两种替代方法都不能充分区分不同细胞位置的受体活性和同一个神经元。光基因激活的 ach 释放已被用于研究本地 nahr9,10,11, 但它已被证明是有用的映射亚细胞 nahr 位置。此外, 大多数利用这种方法的研究都依赖于具有异常胆碱能传播的 chr2 表达的细菌人工染色体转基因小鼠,12、13、14、15,16,17岁
pa-nic 光解并不是研究胆碱能受体的唯一光学方法。在 pa-nic 的发育过程中, 用一种笼型卡巴酚对培养细胞 18 和大脑切片19 中的 ach 受体活性进行了功能映射, 但在商业上无法用于比较研究。据报道, 一种二 (双吡啶)-尼古丁复合物 (rubi-ticantis) 允许尼古丁氧化老化20, 但在面对面比较研究5中, rubi-anticine 的商业制剂被证明不如 pa-nic。用非商业的、高度纯化的 rubi-tin假定重复这种比较实验可能是有用的, 因为它的可见吸收可以补充 pa-nic 的胆碱能研究功能。最后, nAChRs 也被光可转换配体和基因修饰受体21的组合进行了光学操作.该方法是对脑组织中 pa-nic 光解的补充, 对改性性 nahr 的遗传靶向能力要求既被视为优势又被视为缺点。
应注意到这一办法的几个关键要求。首先, 需要一种合适的可视化方法来准确定位神经元膜。在研究培养细胞时, 使用传统的表荧光显微镜进行成像可能就足够了, 但对于从脑片或其他厚组织制剂中的神经元记录, 2plsm 或共聚焦显微镜是一项要求。其次, 需要一种合适的光解激光束定位方法。这种方法利用双电流计扫描头与两个独立的 x-y 反射镜的光栅扫描成像光束和点光激活使用不变的激光束22,23,24。其他更有限的解决方案是可能的, 例如 (1) 单电流计扫描头, 交替栅格扫描成像光束和未造影光束, 或 (2) 简单地将未造影光束定向到视场的中心, 使电池被带到这个位置的闪光光解。第三, 如果希望在实验过程中收集生理信号, 需要一个系统同时进行电生理记录。上述要求可以满足与一个合适的全光学成像技术, 如最近所述5。下面包含了一个详细的协议, 描述了此方法的关键步骤。
pa-nic 应用交付方法的选择是这一局部光刺激技术中最关键的一步。两种方法, 洗浴应用和局部灌注, 各具有明显的优势和局限性。在感兴趣的细胞类型中, nahr 功能表达水平在很大程度上影响了选择。通常最好在功能表达水平较高的情况下使用洗澡时使用洗澡水, 因为洗澡水应用允许在记录的细胞周围有一个均匀的探针浓度, 从而方便了数据解释。浴应用还消除了组织中对第二灌注移液器的需求, 使整个过程更容易。然而, 昂贵的化合物的沐浴应用每次实验的成本更高。
通常, 故障排除包括试图了解为什么在闪光灯光解之后看不到 nahr 激活。当使用以前没有使用 pa-nic 研究过的细胞类型时, 研究人员应在当地进行 ach 或尼古丁的应用, 以确定是否有足够的受体在功能上表达 5.为了验证该系统是否能够检测光解反应, 应在表达大量受体30的内侧哈伯努拉神经元中进行控制实验。在这个大脑区域, pa-nic 浴应用是可能的, 这是最好的验证实验。只有在执行了这些验证实验后, 才应该进入未研究过的细胞类型。如果实验系统已经验证, 响应仍然很小或无法检测到, 则可能需要增加 pa-nic 的浓度, 增加闪光强度或脉冲持续时间, 添加 nahr 正异构调制器, 以增强 nahr活动6, 或这些的一些组合。
有时, 未控制的响应太大, 具有显著的 nahr 激活, 导致间接电压门控 na +通道激活和未夹紧的内电流, 由于空间夹具差。这些伪影完全掩盖了 nachr 的内电流, 使数据解释成为不可能, 通过在记录移液器中加入 qx-314 (2 mm) 可以消除这些伪影。它们也可以通过降低 pa-nic 的浓度或减少闪光强度或脉冲持续时间来消除。在所有可见光光刺激实验中, 在选择刺激部位时必须小心, 以避免在所需的焦面上方或下方进行意外的刺激光解。此外, 在适用的情况下, 必须始终滴定激光功率以再现生理反应。特别重要的是要注意 z 轴光刺激时, 与笼状配体的工作, 因为在焦点下方激活的配体仍可能扩散并与所研究的生物系统 (即受体) 相互作用.
pa-nic 激光闪光光解可能并不适合所有的研究人员, 因为存在一些限制。首先是合适的设置成本相对较高。在处理完整的大脑切片时, 像树突这样在小直径结构附近进行发现需要一个复杂的可视化系统, 如2光子显微镜。除了用于执行 2-光子显微镜的钛蓝宝石 (可调谐红外脉冲激光) 的高成本外, 能够独立定位两种激光束的双电流计系统还进一步增加了系统成本。如果调查员有足够的专业知识和时间来构建、故障排除和维护这样的系统, 则可以通过使用自制系统来降低系统总成本。第二个限制通常涉及低 nahr 功能表达式, 可以通过采取上述步骤部分缓解, 但这可能不能保证成功。通常情况下, 如果不能测量在应用激动剂后的配体激活电流, 在电压钳下的 pa-nic 闪存光解可能不会产生可接受的结果。第三个限制涉及 pa-nic 的固有荧光. pa-nic 吸收 ~ 405 纳米光, 并在类似于绿色荧光蛋白 (gfp) 或亚历克莎 4055 的范围内发出。当 pa-nic 浓度超过 ~ 1 mm 时, 这种荧光特性会使同时可视化神经元结构变得具有挑战性。为了缓解这种情况, 能够轻松控制灌注移液器中的 pa-nic 流量至关重要。pa-nic 的流动会定期停止, 以使荧光分子扩散出去。这允许重新成像的神经元, 以检查未发现的光束的点位置。第四个潜在的限制是使用405纳米光进行光解。较短的波长 (如405纳米) 更容易在复杂的组织 (如大脑切片) 中散射。因此, 在给定的闪光强度和持续时间内, 不腐蚀的响应振幅和衰变动力学可能会受到切片内不变焦点深度的不同影响。关于 nahr 生物学方面的结论应考虑到这一重要的警告。
这种局部激光闪光光解技术最近被用来发现有关 nahr 神经生物学的新细节。例如, 慢性尼古丁暴露增强了间生和树突状的 nahr 功能在内侧哈贝努拉神经元5。它也被用来帮助证明, 第一次, 腹侧结节状神经元表达功能 najr 在他们的外生和树突状细胞隔间 6.这项技术有许多潜在的未来用途, 这种方法可以应用于其他关键神经元类型, 已知表达 nahr, 如皮质锥体神经元31或大脑皮层32的间神经元, 纹状体33, 海马体 19。这项技术也可以结合药理学和/或 nahr 基因编辑34 , 定位特定受体亚型到不同的神经元隔间。该方法可以很容易地适应其他香豆素笼化合物, 包括但不限于与 pa-nic5平行开发的化合物。最后, pa-nic 闪光光解有一天可能会被用于一种有光照行为的动物, 以研究尼古丁在新的行为药理学范式中的作用。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢西北大学以下主要调查人员的实验室成员: ryan drenan、d. james surmeier、yevgenia Kozorovitskiy 和 anis 承包商。这项工作得到了美国国立卫生研究院 (nih) (向 r. c. d. 提供 da035942 和 DA035942)、phrma 基金会 (向医学博士提供研究金) 和 hmi 的支持。
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |