מאמר זה מציג שיטה ללימוד קולטני אצטילכולין nicotinic (nAChRs) העכבר פרוסות המוח על-ידי uncaging ניקוטין. כאשר משולב עם הקלטה מלחציים תיקון בו זמנית של סריקת מיקרוסקופ לייזר הפוטונים 2, ניקוטין uncaging מחבר קולטן nicotinic פונקציה עם מורפולוגיה הסלולר, מתן הבנה עמוקה יותר של שימוש הנוירו-ביולוגיה.
אצטילכולין (ACh) פועל באמצעות קולטנים לווסת מגוון רחב של תהליכים עצביים, אבל זה מאתגר לקשר ACh פונקציה קולטן עם subcellular מיקום בתוך התאים שם פונקציה זו מבוצעת. ללמוד את המיקום subcellular של הקולטנים ACh nicotinic (nAChRs) בתוך רקמת המוח מקורית, פותחה שיטה אופטית לשחרור מדויק של ניקוטין מקומות דיסקרטית ליד ממברנות העצבית במהלך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. תיקון מהודקי נוירונים במוח פרוסות מלאים לצבוע כדי להמחיש את המורפולוגיה שלהם במהלך מיקרוסקופ לייזר הפוטונים 2 סריקה, ניקוטין uncaging מתבצע בעזרת הבזק אור על ידי התמקדות קרן לייזר 405 ננומטר ליד אחד או יותר ממברנות הסלולר. Deflections הנוכחי הסלולר נמדדים, תמונה (3D) תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של מוקלטת הנוירון עשוי לאפשר התאמה של תגובות nAChR עם מורפולוגיה הסלולר. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של התפלגות פונקציונלי nAChR רקמות מורכבות ההכנות, מבטיח לשפר את ההבנה של שימוש עצבית.
שימוש באיתות ממיקרו תהליכים מוחיים רבים, כולל שליטה כל מעסיק, תנועה ופרסומיה פרס1,2. תרופות המשפרים את שידור אצטילכולין (ACh) משמשים לטיפול ליקוי קוגנטיבי הקשורים עם מחלת אלצהיימר, רומז תפקיד חשוב עבור מערכות שימוש קוגניציה3. הבנה משופרת של קולטנים שימוש ואת המעגלים במצבים בריאים וחולים עלול להוביל יותר גישות טיפוליות עבור מספר מחלות/הפרעות נוירולוגיות.
ACh nicotinic קולטנים (nAChRs) הם משפחה של תעלות יונים ממותגת ליגנד זה שטף קטיונים בתגובה אנדוגני ACh או ניקוטין אקסוגני של מוצרי טבק. בהתחשב בעובדה כי הם היו בין קולטני עצבי הראשון שתואר4, פרמקולוגיה nAChR מיקום בתוך סיבי השריר הוא מובנות על רצפטורים שרירים-סוג. לעומת זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על פרמקולוגיה, subcellular והפצה של יליד nAChRs במוח. פער זה מתוך ידיעה זו נדונה לאחרונה על ידי פיתוח מכשיר בדיקה כימית הרומן המאפשר הפעלה במרחב מוגבל ומהירה של nAChRs ברקמת המוח במהלך דימות הסלולר, הקלטה אלקטרופיזיולוגיות5. . הנה, השלבים מתודולוגי המפתח מעורבים בגישה זו מתוארים, עם המטרה הכוללת של שיפור היכולת להתחבר nAChR פונקציה עם מבנה עצביים.
Photoactivatable ניקוטין (PA-Nic; שם כימי: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-אמינו] קומרין-4-yl] מתיל-ניקוטין) יכול להיות photolyzed עם ~ 405 ננומטר לייזר הבזקים לשחרר ביעילות ניקוטין5,6. לפני uncaging, הרשות הפלסטינית-Nic יציב בפתרון ותערוכות לא רע לא תרופתי או פוטו אטמוספרי תכונות5. לאחר פוטוליזה, שפורסמו ניקוטין מפעיל כצפוי nAChRs, uncaging לוואי פרמקולוגית אינרטי5. לייזר מכ משמש מקור האור פוטוליזה עם כוח פלט > 1 mW נמדד ב המדגם. כאשר מקומי, צילום יישוב-גירוי בשילוב עם היכולת לאתר ממברנות הסלולר עם לייזר הפוטונים 2 סריקה מיקרוסקופ (2PLSM), שני יתרונות מרכזיים של גישה זו הם הבינו במלואם: פוטוליזה מהירות ודיוק מרחבית.
בכל הכבוד, פוטוליזה של הרשות הפלסטינית-Nic עדיפה בשיטות אחרות של העברת nAChR ליגנדים לקולטנים בתוך פרוסות המוח. גישות כאלה כוללים אמבט יישום7 , סמים מקומי משלוח באמצעות פיפטה puffer8. בעוד הגישה נוטה להדגיש יתר על המידה את ההשפעות ארוכות הטווח של הסם יישומית, הצגנו יכולה סובלים השתנות ב קינטיקה התגובה בין ניסויים על-פני תאים. גם גישות חלופיות אלה יכולים להבחין שלמאחה קולטן הפעילויות במיקומים שונים הסלולר של נוירון אותו. מופעל Optogenetically שחרור ACh שימש במשך החקירה של יליד nAChRs9,10,11, אבל זה לא הוכיח שימושי עבור מיפוי subcellular nAChR מקומות. יתר על כן, רוב המחקרים ניצול גישה זו צריכים לסמוך על הבעת ChR2 חיידקי מלאכותי כרומוזום עכבר עם שידור שימוש חריג12,13,14, 15 , 16 , 17.
הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה אינה הגישה אופטי רק ללמוד שימוש קולטנים. Carbachol בכלובים שימש למיפוי פונקציונלית ACh פעילות הקולטן תאים בתרבית18 ו המוח פרוסות19, אבל לא היה זמינים מסחרית עבור מחקרים השוואתיים, במהלך הפיתוח של הרשות הפלסטינית-nic. Bis רותניום (bipyridine)-ניקוטין מורכבים (RuBi-ניקוטין) דווח כדי לאפשר uncaging ניקוטין20, אבל ההכנות מסחרי של רובי-ניקוטין הוכיחה הרשות הפלסטינית-Nic נחות בהשוואה עפות ללמוד5. זה עשוי להיות שימושי לחזור על ניסויים אלה השוואתית עם מסחרי, מאוד מטוהרים RuBi-ניקוטין, כמו בליעה גלוי יכול להחמיא התכונות של הרשות הפלסטינית-Nic ללימודי שימוש. לבסוף, nAChRs יש גם שטיחות תומרנו באמצעות שילוב של קולטנים מהונדס גנטית21של ליגנדים צילום-להחלפה. גישה זו היא משלימה את הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה ברקמת המוח, עם הדרישה/היכולת של התמקדות גנטי nAChR ששונה לראות גם יתרון וגם חיסרון.
ראוי לציין מספר דרישות המפתח של גישה זו. ראשית, שיטת הדמיה המתאימה נחוץ כדי לאתר במדויק את הקרום עצביים. הדמיה עם מיקרוסקופ אפינפרין קונבנציונלי-ידי קרינה פלואורסצנטית עשוי להיות מספיק כשלמדתי תאים בתרבית, אך עבור הקלטה של נוירונים במוח פרוסות או תכשירים אחרים רקמות עבות, 2PLSM או מיקרוסקופיה קונפוקלית היא דרישה. שנית, שיטה מתאימה יש צורך למקם את קרן הלייזר פוטוליזה. גישה זו מנצל ראש כפול-גלוונומטר סריקה עם שתי מראות עצמאיות x-y עבור סריקה סריקה של קרן הדמיה, נקודת photoactivation באמצעות uncaging לייזר קרן22,23,24. פתרונות מוגבלת יותר אפשריות, כגון (1) ראש חד-גלוונומטר סריקה כי לחלופין רסטר סורקת קרן הדמיה, קרן uncaging, או פשוט (2) בבימוי קרן uncaging למרכז שדה הראייה כך התא הוא הביא עמדה זו עבור פלאש פוטוליזה. שלישית, מערכת נדרש אלקטרופיזיולוגיות הקלטה סימולטני אם אדם רוצה לאסוף אותות פיזיולוגיים במהלך הניסויים. הדרישות לעיל ניתן נפגשו עם טכניקה מתאימה כל-אופטיים הדמיה, כמו תיאר לאחרונה5. להלן, פרוטוקול מפורט נכלל זה מתאר את השלבים החשובים של גישה זו.
הבחירה של שיטת יישום/מסירה של הרשות הפלסטינית-Nic היא השלב הקריטי ביותר בטכניקה זו צילום מקומי-גירוי. שתי השיטות, אמבט יישום זלוף מקומיים, אחד מציעים יתרונות ומגבלות. הבחירה מושפע במידה רבה רמת הביטוי פונקציונלי nAChR בסוג התא עניין. לעיתים קרובות עדיף להשתמש ביישום אמבט כאשר הביטוי פונקציונלי רמות גבוהות, כמו אמבט היישום מאפשר ריכוז בדיקה אחידה סביב התא מוקלטות, דבר המקל על פרשנות הנתונים. אמבט היישום גם מבטלת את הצורך פיפטה זלוף השני בתוך הרקמה, המקל על התהליך כולו. עם זאת, יישום אמבט של יקר תרכובות עולה יותר לכל ניסוי.
בדרך כלל, פתרון בעיות כרוך מנסה להבין למה אין הפעלת nAChR היא לראות הבאים פלאש פוטוליזה. בעת עבודה עם סוג התא לא היה בעבר למדה עם הרשות הפלסטינית-Nic, החוקר צריך לבצע פאף-יישום מקומי של ACh או ניקוטין כדי לקבוע אם מספיק רצפטורים פונקציונלית הביע5. כדי לאמת כי המערכת היא מסוגלת לאתר פוטוליזה תגובות, בקרת ניסויים צריך להיעשות בנוירונים habenula המדיאלי לבטא כמויות גדולות של קולטן30. באזור זה של המוח, הרשות הפלסטינית-Nic אמבט יישום אפשרי, אשר עדיפה לניסויים אימות. רק לאחר ביצוע ניסויים אימות אלה צריך אחד לעבור מסוג תא מחקר כלשהו. אם מערכת ניסויית אומתה ולהישאר תגובות מאד קטנה, או לא לגילוי, זה עשוי להיות מוצדקת כדי להגביר את הריכוז של הרשות הפלסטינית-Nic, להגביר את עוצמת פלאש או משך פעימה, להוסיף אפנן חיובי nAChR allosteric כדי לשפר את nAChR פעילות6, או שילוב של אלה.
לעיתים, תגובות uncaging גדולים מדי, עם הפעלת nAChR משמעותי וכתוצאה מכך מתח עקיף מגודרת Na+ ערוץ הפעלה וזרמים פנימה unclamped עקב ענייה שטח קלאמפ. ניתן לסלק לכלוכים אלה, אשר לחלוטין מטשטשים זרמי פנימה nAChR, לעשות פרשנות הנתונים בלתי אפשרי, על ידי הכללת QX-314 (2 מ מ) בפיפטה ההקלטה. הם עשויים להימחק גם על-ידי הפחתת הריכוז של הרשות הפלסטינית-Nic או על-ידי הפחתת בעוצמה פלאש או משך פעימה. בניסויים צילום-גירוי אור לעין כל, החייבים אימון טיפול בעת בחירת אתרי גירוי כדי למנוע גירוי לא מכוונות/פוטוליזה מעל או מתחת למטוס מוקד הרצוי. בנוסף, בעת הצורך, עוצמת הלייזר חייב תמיד להיות טיטרציה להתרבות תגובות פיזיולוגיות. במיוחד חשוב להיות מודעים photostimulation ציר z, כאשר עובדים עם ליגנדים בכלוב, כמו ליגנדים אשר מופעלים מעל/מתחת נקודת מוקד עדיין ייתכן לפזר ולקיים אינטראקציה עם מערכת ביולוגית (קרי קולטנים, ) שנבחנה.
הרשות הפלסטינית-Nic לייזר פלאש פוטוליזה לא ייתכן המתאימה עבור כל החוקרים, כפי קיימות מספר מגבלות. הראשון הוא העלות הגבוהה יחסית של תרגיל מתאים. בעת עבודה עם פרוסות המוח ללא פגע, uncaging ליד מבנים בקוטר קטן כמו דנדריטים דורש מערכת הדמיה מתוחכמות כגון מיקרוסקופ 2-פוטון. מלבד העלות הגבוהה של Ti:sapphire, tunable IR לייזר פעמו עבור ביצוע 2-פוטון מיקרוסקופ, מערכת כפולה-גלוונומטר מסוגל באופן עצמאי מיצוב שתי קרני לייזר נוסף מגדיל את עלות המערכת. מערכת כוללת עלויות ניתן לצמצם באמצעות מערכת מתוצרת בית, אם החוקר מספיק מתמחה ובעל זמן לבנות, פתרון בעיות, ולשמור על מערכת כזו. מגבלה נוספת לעתים קרובות כרוך הביטוי פונקציונלי nAChR נמוך, אשר יכולה להיות חלקית חמאני נקיטת פעולות כאמור לעיל, אבל זה אינו מבטיח הצלחה. בדרך כלל, אם אי אפשר למדוד זרמים מופעל ליגנד בעקבות פאף-בקשה של אגוניסטים, הרשות הפלסטינית-Nic פלאש פוטוליזה תחת מתח קלאמפ לא תניב תוצאות מתקבלות על הדעת. מגבלה שלישית כרוכה מהותי זריחה של הרשות הפלסטינית-nic. הרשות הפלסטינית-Nic סופג אור ~ 405 ננומטר ויפלטו בטווח דומה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או אלקסה 4885. הרשות הפלסטינית-Nic ריכוזים חורגים ~ 1 מ מ, מאפיין זה קרינה פלואורסצנטית יכול לעשות את זה מאתגר בו-זמנית להמחיש מבנים עצביים. כדי להמתיק את זה, זה קריטי כדי להיות מסוגל לשלוט בקלות את הזרימה של הרשות הפלסטינית-Nic מ פיפטה זלוף. מעת לעת, הזרימה הרשות הפלסטינית-Nic הופסק כדי לאפשר מולקולות פלורסנט לנטרל את זה משם. זה מותר מחדש הדמיה של הנוירון לבדיקת המיקום ספוט של קרן uncaging. מגבלה פוטנציאליים הרביעי להזכיר כרוכה בשימוש של 405 ננומטר אור עבור פוטוליזה. באורכי גל קצרים יותר כגון 405 ננומטר נוטים יותר הפיזור ברקמות מורכבות כגון פרוסה המוח. לפיכך, נתון ההבזקה, משך, uncaging amplitudes התגובה וקינטיקה דעיכה באופן שונה מושפעת העומק של המוקד uncaging בתוך הפרוסה. מסקנות על היבטים ביולוגיים nAChRs צריך לקחת זה הקונה חשובים בחשבון.
זו טכניקה פלאש פוטוליזה לייזר מקומי לאחרונה שימש לחשוף פרטים חדשים אודות נוירוביולוגיה nAChR. לדוגמה, חשיפה כרונית ניקוטין מגבירה את perisomatic ואת nAChR דנדריטים פונקציה habenula המדיאלי נוירונים5. היא שימשה גם כדי לסייע בהמחשת, בפעם הראשונה, כי אזור הטגמנטום הגחוני גלוטמט נוירונים להביע nAChRs תפקודית שלהם perisomatic, תאים דנדריטים הסלולר6. ישנם שרבים הפוטנציאל בעתיד שימושים של טכניקה זו, וכל הגישה יכול לחול על סוגים אחרים של הנוירון מפתח הידועות nAChRs אקספרס, כגון נוירונים בקליפת המוח כפירמידה31 או interneurons של קליפת המוח32סטריאטום33 , ההיפוקמפוס19. טכניקה זו יכול גם להיות משולב עם הגן פרמקולוגיה ו/או nAChR עריכה34 כדי להתאים לשפה קולטן ספציפי יחוברו אל תאים עצביים שונים. הגישה עשוי להיות מותאם בקלות תרכובות אחרות קומרין כלואים, לרבות אך לא רק, אלה שפותחו במקביל עם הרשות הפלסטינית-Nic5. לבסוף, הרשות הפלסטינית-Nic פלאש פוטוליזה אולי יום אחד לשמש חיה ער/מתנהג ללמוד הפעולה של ניקוטין פרדיגמות הרומן פרמקולוגיה התנהגותית.
The authors have nothing to disclose.
המחברים תודה מעבדה חברי החוקרים העיקרי מערבי הבאים: ריאן Drenan, ד ג’יימס Surmeier, יבגניה Kozorovitskiy ו קבלן אניס. עבודה זו נתמכה על ידי אותנו במכון הלאומי של בריאות (NIH) (מענקים DA035942 ו- DA040626 כדי R.M.D.), חברת פארמה קרן (מלגת אל תיתן) ו HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |