Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung von Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) in Maus Hirnschnitten von Nikotin uncaging. Wenn gepaart mit gleichzeitiger Patch Clamp Aufnahme und 2-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie, verbindet Nikotin uncaging Nikotinsäure Rezeptor-Funktion mit zellulären Morphologie, bietet ein tieferes Verständnis der cholinergen Neurobiologie.
Acetylcholin (ACh) wirkt durch Rezeptoren eine Vielzahl von neuronalen Prozessen zu modulieren, aber es ist eine Herausforderung gewesen, um ACh-Rezeptor-Funktion mit subzelluläre Lage innerhalb der Zellen zu verknüpfen, wo diese Funktion durchgeführt wird. Um die subzelluläre Lage von Nikotinsäure ACh-Rezeptoren (nAChRs) im nativen Hirngewebe zu untersuchen, wurde eine optische Methode für die genaue Version von Nikotin an diskreten stellen in der Nähe von neuronalen Membranen bei elektrophysiologische Aufnahmen entwickelt. Patch eingespannten Neuronen im Gehirn, die Scheiben mit gefüllt sind färben ihre Morphologie während 2-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie zu visualisieren und Nikotin uncaging mit einem hellen Blitz durch die Konzentration einer 405 nm-Laser-Strahl in der Nähe von einem oder mehreren Zellmembranen ausgeführt. Zelluläre aktuelle Umlenkungen werden gemessen, und eine hochauflösende dreidimensionale (3D) Darstellung der aufgezeichneten Neuron erfolgt um Versöhnung der nAChR Antworten mit zellulären Morphologie zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht detaillierte Analyse der nAChR funktionale Verteilung in komplexen Gewebe Vorbereitungen, verspricht, das Verständnis der cholinerge Neurotransmission zu verbessern.
Cholinerge Signal moduliert zahlreiche Vorgänge im Gehirn, einschließlich Aufmerksamkeitskontrolle, willentlichen Bewegung und Belohnung1,2. Medikamente, die Acetylcholin (ACh) Übertragung zu verbessern sind zur Behandlung von kognitiven Beeinträchtigung, die Alzheimer-Krankheit, was bedeutet eine wichtige Rolle für die cholinerge Systeme in Wahrnehmung3zugeordnet. Ein verbessertes Verständnis von cholinergen Rezeptoren und Schaltungen in gesunden und Kranken Staaten könnten bessere therapeutische Ansätze für verschiedene neurologische Krankheiten/Störungen.
Nicotinsäure ACh-Rezeptoren (nAChRs) sind eine Familie der Liganden-gated Ionenkanäle, die kationen auf endogene ACh oder exogene Nikotin von Tabakerzeugnissen flux. Angesichts der Tatsache, dass sie zu den allerersten Neurotransmitter-Rezeptoren beschrieben4gehörten, ist nAChR Pharmakologie und Lage in Muskelfasern für Muskel-Typ Rezeptoren gut verstanden. Im Gegensatz dazu, ist über die Pharmakologie und subzelluläre Verteilung von native nAChRs im Gehirn vergleichsweise wenig bekannt. Diese Wissenslücke wurde vor kurzem durch eine neuartige chemische Sonde, die räumlich beschränkt und schnelle Aktivierung der nAChRs im Gehirngewebe während zelluläre Bildgebung und elektrophysiologische Aufnahme5ermöglicht die Entwicklung behoben. Hier werden die wichtigsten methodischen Schritte beteiligt in diesem Ansatz beschrieben, mit dem übergeordneten Ziel der Verbesserung der Fähigkeit, nAChR Funktion mit neuronalen Struktur zu verbinden.
Photoactivatable Nikotin (PA-Nic; chemische Bezeichnung: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] Cumarin-4-Yl] Methyl-Nikotin) können Photolyzed mit ~ 405 nm Laserblitze effizient Nikotin5,6veröffentlichen werden. Vor uncaging, PA-Nic ist in Lösung stabil und weist keine unerwünschten pharmakologischen oder photochemische Funktionen5. Nach Photolyse freigesetzte Nikotin aktiviert wie vorauszusehen war nAChRs und die uncaging Nebenprodukte sind pharmakologisch inert5. Ein Dauerstrich-Laser dient als die Photolyse Lichtquelle mit einer Leistung > 1 mW an der Probe gemessen. Wenn lokalisiert, gezielte Foto-Stimulation wird kombiniert mit der Fähigkeit, die Zellmembranen mit 2-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie (2PLSM) zu finden, und die zwei wichtigsten Vorteile dieses Ansatzes sind vollständig realisiert: Photolyse Geschwindigkeit und räumliche Präzision.
In den meisten Punkten ist Photolyse von PA-Nic besser als andere Methoden liefern nAChR Liganden an Rezeptoren im Gehirnscheiben. Solche Ansätze sind Bad Anwendung7 und lokalen Medikament Lieferung über ein Kugelfisch Pipette8. Während die ehemaligen Ansatz neigt dazu, die langfristigen Auswirkungen des angewandten Medikaments genug betonen, leiden Letzteres Variabilität in der Reaktionskinetik zwischen Studien und zellenübergreifend. Keiner dieser alternative Ansätze können angemessen Rezeptor-Aktivitäten in verschiedenen zellulären Orten aus der gleichen Neuron unterscheiden. Optogenetically-aktivierte Version von ACh dient zur Untersuchung von native nAChRs9,10,11, aber es hat sich nicht bewährt für Zuordnung subzelluläre nAChR Standorte. Darüber hinaus haben die meisten Studien unter Verwendung dieser Ansatz auf eine ChR2 exprimierenden bakterielle künstliches Chromosom transgenen Maus mit abnormen cholinerge Übertragung12,13,14, verlassen. 15 , 16 , 17.
PA-Nic Photolyse ist nicht nur optische Ansatz für das Studium von cholinerger Rezeptoren. Ein Käfig Carbachol wurde verwendet, um funktionell ACh-Rezeptor-Aktivitäten in kultivierten Zellen18 und Gehirn Scheiben19zuzuordnen, aber wurde nicht im Handel erhältlich für vergleichende Studien während der Entwicklung des PA-NIC. Ein Ruthenium-BIZ (Bipyridine)-Nikotin-Komplex (RuBi-Nikotin) wurde berichtet, dass Nikotin uncaging20zu ermöglichen, aber kommerzielle Vorbereitungen von RuBi-Nikotin erwies sich schlechter als PA-Nic in einem Direktvergleich studieren5. Es kann sinnvoll sein, solche vergleichende Versuche mit nicht-kommerziellen, wiederholen hoch gereinigt RuBi-Nikotin, wie seine sichtbare Absorption PA-Nic-Funktionen für cholinerge Studien ergänzen könnte. Schließlich wurden nAChRs auch optisch manipuliert mit einer Kombination von Foto-schaltbare Liganden und Rezeptoren genetisch veränderten21. Dieser Ansatz ist komplementär zur PA-Nic Photolyse im Hirngewebe, mit der Fähigkeit/Anforderung der genetischen Angriffe auf die veränderten nAChR als einen Vorteil und einen Nachteil.
Mehrere wichtige Anforderungen dieses Ansatzes hingewiesen. Zunächst wird eine geeignete Visualisierungsmethode musste die neuronale Membran genau zu lokalisieren. Bildgebung mit konventionellen Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie kann ausreichend sein, wenn man kultivierte Zellen studiert, aber für die Aufnahme von Neuronen im Gehirnscheiben oder andere dicke Gewebe-Präparate, 2PLSM oder der konfokalen Mikroskopie ist eine Voraussetzung. Zweitens ist eine geeignete Methode erforderlich, um die Photolyse Laserstrahl zu positionieren. Dieser Ansatz nutzt einen Dual-Galvanometer Scankopf mit zwei unabhängige X-y-Spiegel für das Raster Scannen der bildgebenden Strahl und Punkt Photoaktivierungen mit dem uncaging Laser Beam22,23,24. Begrenzte Lösungen sind möglich, z. B. (1) eine Single-Galvanometer Scankopf, dass Alternativ Raster scannt der bildgebenden Strahl und der uncaging Strahl oder (2) einfach Regie des uncaging Strahls in die Mitte des Sichtfeldes, so dass die Zelle gebracht wird Diese Position für Flash Photolyse. Drittens ist ein System für gleichzeitige elektrophysiologische aufzeichnen will man physiologische Signale während der Experimente zu sammeln. Die oben genannten Anforderungen können mit einem geeigneten rein optischen bildgebendes Verfahren, wie kürzlich beschriebenen5erfüllt werden. Unten ist ein detailliertes Protokoll enthalten, beschreibt die wichtigsten Schritte dieses Ansatzes.
Die Wahl der PA-Nic Anwendungsbereitstellung/Methode ist der wichtigste Schritt in diese lokalisierten Foto-Stimulationstechnik. Zwei Methoden, Bad Anwendung und lokalen Perfusion, bietet jedes deutliche Vorteile und Einschränkungen. Die Wahl wird weitgehend durch die nAChR funktionelle Expression in der Zelle Art von Interesse beeinflusst. Es empfiehlt sich, Bad-Anwendung zu verwenden, wenn funktionelle Expression Ebenen hoch sind, denn Bad Anwendung eine einheitliche Sonde Konzentration rund um die aufgezeichneten Zelle ermöglicht, Interpretation der Daten zu erleichtern. Bad Anwendung beseitigt auch die Notwendigkeit einer zweiten Perfusion Pipette in das Gewebe, so dass des gesamten Prozess leichter. Bad Anwendung von teuren Verbindungen jedoch kostet mehr pro Versuch.
Im Allgemeinen beinhaltet Problembehandlung versuchen zu verstehen, warum keine nAChR Aktivierung gesehen folgende Flash Photolyse. Umgang mit einem Zelltyp, die zuvor nicht mit PA-Nic untersucht wurden, sollten die Ermittler lokale Blätterteig-Anwendung von ACh durchführen oder Nikotin um festzustellen, ob genügende Rezeptoren funktional sind ausgedrückt5. Um zu überprüfen, dass das System in der Lage erkennen Photolyse Antworten sollten Experimente in medialen Habenulae Neuronen erfolgen, die große Mengen an Rezeptor30ausdrücken. In diesem Bereich des Gehirns ist PA-Nic Bad Anwendung möglich, was für Validierung Experimente vorzuziehen. Erst nach dieser Validierung experimentieren sollte man auf ein rezenter Zelltyp bewegen. Fügen Sie wenn das experimentelle System validiert wurde und Antworten sehr klein oder nicht nachweisbar bleiben, kann es gerechtfertigt sein, zur Erhöhung der Konzentration von PA-Nic, erhöhen die Blitzintensität oder Pulsdauer, eine nAChR positive allosterische Modulator nAChR verbessern Aktivität-6, oder eine Kombination davon.
Gelegentlich uncaging Antworten sind zu groß, mit signifikanten nAChR Aktivierung wiederum indirekte Spannung gated Na+ Kanal Aktivierung und ausgespannt nach innen Ströme aufgrund schlechter Platz Klemme. Diese Artefakte, die vollständig verdecken nAChR nach innen Strömungen und Interpretation der Daten unmöglich machen, können durch die Aufnahme von QX-314 (2 mM) in die Aufnahme Pipette beseitigt werden. Sie können auch durch eine Verringerung der Konzentration von PA-Nic oder durch eine Verringerung der Blitzintensität oder Pulsdauer beseitigt werden. In allen sichtbaren Foto-Lichtstimulation versuchen müssen die Sorgfalt bei der Auswahl der Stimulation Websites, um unbeabsichtigte Stimulation/Photolyse oberhalb oder unterhalb der gewünschten Brennebene zu vermeiden. Zusätzlich und wenn zutreffend, die Laserleistung muss immer titriert werden, um physiologische Reaktionen zu reproduzieren. Es ist besonders wichtig zu wissen der z-Achse Photostimulation beim Arbeiten mit Käfig Liganden als Liganden, die oberhalb/unterhalb der Brennfleck aktiviert werden können noch diffus und Interaktion mit dem biologischen System (d. h., Rezeptoren) untersucht.
PA-Nic Laser Flash Photolyse möglicherweise nicht geeignet für alle Forscher, wie mehrere Einschränkungen vorhanden sind. Die erste ist die relativ hohen Kosten für eine geeignete Einrichtung. Beim Arbeiten mit intakten Gehirnscheiben uncaging in der Nähe von kleinem Durchmesser Strukturen wie Dendriten erfordert eine ausgefeilte Visualisierung wie ein 2-Photonen-Mikroskop. Abgesehen von der hohen Kosten für eine Exklusivrepräsentation abstimmbaren IR gepulsten Lasers für leistungsstarke 2-Photonen-Mikroskopie, erhöht ein Dual-Galvanometer-System in der Lage, selbständig Positionierung zwei Laserstrahlen weiter die Systemkosten. Gesamtsystem Kosten können reduziert werden, mit einem selbstgebauten System, wenn die Ermittler verfügt über ausreichend Fachwissen und Zeit zu konstruieren, zu beheben und pflegen ein solches System. Eine zweite Einschränkung oft beinhaltet niedrige nAChR funktionelle Expression, die teilweise entschärft werden kann, durch Maßnahmen wie oben erwähnt, aber dies kann keine Garantie für Erfolg. In der Regel einem Liganden aktiviert Strömungen nach Blätterteig-Anwendung des Agonisten nicht messen kann, können PA-Nic Flash Photolyse unter Spannung Klemme nicht akzeptable Ergebnissen führen. Eine dritte Einschränkung betrifft die intrinsische Fluoreszenz von PA-NIC PA-Nic ~ 405 nm Licht absorbiert und strahlt in einem ähnlichen Bereich wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) oder Alexa 488-5. Wenn PA-Nic Konzentrationen ~ 1 mM überschreiten, machen diese Fluoreszenz-Eigenschaft eine Herausforderung, gleichzeitig neuronale Strukturen visualisieren es. Um dies zu mindern, ist es wichtig, den Fluss der PA-Nic aus der Perfusion Pipette leicht kontrollieren zu können. In regelmäßigen Abständen wurde die PA-Nic-Strömung gestoppt, um fluoreszierende Moleküle entfernt diffundieren zu lassen. Dies erlaubt die Neuerstellung des Neurons für die Überprüfung der Kassaposition des uncaging Strahls. Eine vierte mögliche Einschränkung zu erwähnen beinhaltet die Verwendung von 405 nm Licht für Photolyse. Kürzere Wellenlängen wie 405 nm sind anfälliger für Streuung in komplexen Gewebe wie ein Gehirn-Scheibe. So bei einem bestimmten Flash-Intensität und Dauer, können uncaging Resonanz-Amplituden und Verfall Kinetik differentiell die Schärfentiefe der uncaging innerhalb der Schicht betroffen sein. Rückschlüsse auf biologische Aspekte der nAChRs sollte diese wichtige Einschränkung berücksichtigt werden.
Diese lokalisierten Laser Flash Photolyse Technik hat kürzlich neue Details über nAChR Neurobiologie aufzudecken eingesetzt. Zum Beispiel verbessert chronische Nikotinexposition Perisomatic und dendritischen nAChR Funktion im medialen Habenulae Neuronen5. Es wurde auch verwendet, um zum ersten Mal zu demonstrieren, dass ventralen Haubengebiet Glutamat Nervenzellen funktionalen nAChRs in ihren Perisomatic und dendritischen Zellen Fächer6ausdrücken. Gibt es viele mögliche zukünftige dieser Technik verwendet, und der Ansatz angewandt werden, zu anderen wichtigen Neuron, die ausdrückliche nAChRs wie kortikale pyramidale Neuronen31 oder Interneuronen in der Großhirnrinde32, Striatum33 bekannt sind , und Hippocampus19. Diese Technik kann auch mit Pharmakologie und/oder nAChR gen Bearbeiten34 zum spezifischen Rezeptor-Subtypen zu verschiedenen neuronalen Kompartimenten lokalisieren kombiniert werden. Der Ansatz kann an andere Cumarin-Käfig Verbindungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, diejenigen mit PA-Nic5parallel entwickelt leicht angepasst werden. Zu guter Letzt werden PA-Nic Flash Photolyse vielleicht eines Tages verwendet ein Tier wach/Verhalten, um Nikotin Aktion im Roman Verhaltens Pharmakologie Paradigmen zu studieren.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Labor-Mitglieder der folgenden nordwestlichen Hauptprüfer: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy und Anis Auftragnehmer. Diese Arbeit wurde durch die US National Institute of Health (NIH) (Zuschüsse, DA035942 und DA040626, R.M.D.), der PhRMA Stiftung (Stipendium, M.C.A) und HHMI unterstützt.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |