Este artigo apresenta um método para estudar os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em fatias de cérebro de rato por nicotina uncaging. Quando acoplado com gravação de braçadeira do remendo simultânea e 2-fóton laser, microscopia eletrônica de varredura, nicotina uncaging conecta a função do receptor nicotínico com morfologia celular, proporcionando uma compreensão mais profunda da neurobiologia colinérgico.
A acetilcolina (ACh) age através de receptores para modular uma variedade de processos neuronais, mas isso tem sido desafiador para ligar a função de receptor de ACh com Localização subcellular dentro das células onde esta função é desempenhada. Para estudar a Localização subcellular de receptores nicotínicos da ACh (nAChRs) no tecido cerebral nativo, um método óptico foi desenvolvido para lançamento preciso de nicotina em locais discretos perto membranas neuronais durante gravações eletrofisiológicas. Patch-fixada neurônios no cérebro fatias são preenchidas com tingem para visualizar sua morfologia durante a microscopia do laser 2-fóton, e uncaging de nicotina é executado com um flash de luz, concentrando-se um feixe de laser 405 nm perto de uma ou mais membranas celulares. Celulares atuais deflexões são medidos, e uma imagem tridimensional de alta resolução de (3D) do neurônio gravado é feita para permitir a reconciliação do nAChR respostas com morfologia celular. Este método permite a análise detalhada da distribuição funcional nAChR em preparações de tecido complexo, prometendo para melhorar a compreensão da neurotransmissão colinérgico.
Sinalização colinérgicos modula numerosos processos cerebrais, incluindo controle de atenção, movimento volitivos e recompensa1,2. Drogas que melhoram a transmissão da acetilcolina (ACh) são usadas para tratar o impairment cognitive associado com a doença de Alzheimer, sugerindo um papel importante para sistemas colinérgicos na cognição3. Uma melhor compreensão dos receptores colinérgicos e circuitos nos Estados saudáveis e doentes pode levar a melhor abordagens terapêuticas para várias doenças/distúrbios neurológicos.
Receptores nicotínicos da ACh (nAChRs) são uma família de canais iônicos ligante que flux cações em resposta a ACh endógena ou exógena nicotina de produtos do tabaco. Dado o fato de que eles estavam entre os receptores de neurotransmissores primeiros ser descrito4, nAChR farmacologia e localização em fibras musculares é bem compreendida pelos receptores do tipo muscular. Por outro lado, comparativamente pouco é conhecido sobre a farmacologia e a distribuição subcellular de nativo nAChRs no cérebro. Esta lacuna no conhecimento recentemente foi abordada através do desenvolvimento de uma sonda de romance química que permite a ativação rápida e espacialmente restrita do nAChRs no tecido cerebral durante cellular imaging e gravação eletrofisiológicas5. Aqui, são descritas as etapas envolvidas nesta abordagem metodológicas, com o objectivo geral de reforçar a capacidade de conectar nAChR função com estrutura neuronal.
Photoactivatable nicotina (PA-Nic; nome químico: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] cumarina-4-yl] metil-nicotina) pode ser photolyzed com ~ 405 nm laser flashes eficientemente liberar a nicotina5,6. Antes da uncaging, PA-Nic é estável em solução e exibe sem características farmacológicas ou fotoquímicos desagradável5. Após a fotólise, nicotina liberada previsivelmente ativa nAChRs e os uncaging subprodutos são farmacologicamente inerte5. Um laser assemelhace é usado como a fonte luminosa fotólise com uma potência de saída > 1 mW medido na amostra. Quando localizado, alvo de foto-estimulação é combinada com a capacidade de localizar as membranas celulares com laser 2-fotão microscopia (2PLSM), e as duas principais vantagens desta abordagem são plenamente realizadas: fotólise velocidade e precisão espacial.
Em muitos aspectos, a fotólise do PA-Nic é superior aos outros métodos de entrega de nAChR ligantes aos receptores dentro de fatias de cérebro. Essas abordagens incluem banho aplicação7 e drogas local entrega através de uma pipeta de baiacu8. Considerando que a primeira abordagem tende a super enfatizar os efeitos a longo prazo da droga aplicada, a última abordagem pode sofrer de variabilidade na cinética de resposta entre ensaios e através de células. Nenhuma dessas abordagens alternativas adequadamente pode distinguir as atividades do receptor em locais diferentes de celulares do mesmo neurônio. Optogenetically-ativado a liberação de ACh tem sido utilizada para investigação de nativo nAChRs9,10,11, mas não tem sido útil para locais de mapeamento nAChR subcellular. Além disso, a maioria dos estudos utilizando esta abordagem têm invocado um ChR2-expressando cromossomo artificial bacteriano transgénico mouse com transmissão colinérgicas anormal12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotólise não é a abordagem apenas ótica para estudar os receptores colinérgicos. Um enjaulado carbacol foi usado funcionalmente mapear atividades de receptores ACh em pilhas cultivadas18 e cérebro fatias19, mas não era comercialmente disponível para estudos comparativos durante o desenvolvimento do PA-NIC. Um bis de rutênio (bipiridina)-complexo de nicotina (RuBi-nicotina) foi relatada para permitir a nicotina uncaging20, mas estudo de preparações comerciais de RuBi-nicotina provou ser inferior ao PA-Nic em uma comparação Head-to-5. Pode ser útil repetir tais experimentos comparativos com não-comercial, altamente purified RuBi-nicotina, como sua absorção visível poderia elogiar características do PA-Nic para estudos colinérgicos. Finalmente, nAChRs têm também sido opticamente manipulados usando uma combinação de foto-comutável ligantes e receptores geneticamente modificados21. Esta abordagem é complementar a fotólise de PA-Nic no tecido cerebral, com a capacidade/exigência do alvo genético do nAChR modificado, visto como uma vantagem e uma desvantagem.
Devem notar-se vários requisitos chaves desta abordagem. Primeiro, um método de visualização adequada é necessária para localizar com precisão a membrana neuronal. Imagem com microscopia de fluorescência-epi convencional pode ser suficiente quando estudar culturas de células, mas para a gravação de neurônios em fatias de cérebro ou outras preparações de tecido grosso, 2PLSM ou a microscopia confocal é uma exigência. Em segundo lugar, um método adequado é necessário para posicionar o feixe de laser de fotólise. Esta abordagem utiliza uma cabeça de digitalização dual-galvanômetro com dois espelhos de independente x-y para a digitalização de varredura do feixe de imagem e ponto photoactivation usando o uncaging do laser feixe22,23,24. Outras soluções mais limitadas são possíveis, tais como (1) uma cabeça de varredura de single-galvanômetro que alternativamente raster faz a varredura do feixe de imagem e o feixe de uncaging ou (2) simplesmente dirigir o feixe de uncaging para o centro do campo de visão tal que a célula é trazida Esta posição por fotólise de flash. Em terceiro lugar, um sistema é necessário para simultânea eletrofisiológicos gravação se deseja coletar sinais fisiológicos durante as experiências. As condições acima mencionadas podem ser atendidas com uma técnica de imagem todos-óptico adequada, como recentemente descrito5. Abaixo, um protocolo detalhado está incluído que descreve as principais etapas desta abordagem.
A escolha do método de aplicação/entrega de PA-Nic é o passo mais crítico nesta técnica de foto-estimulação localizadas. Os dois métodos, aplicação de banho e perfusão local, cada um para oferecer limitações e vantagens distintas. A escolha em grande parte é afetada pelo nível de expressão funcional de nAChR no tipo de célula de interesse. Muitas vezes é preferível usar aplicativo de banho quando os níveis de expressão funcional são elevados, como aplicação de banho permite uma concentração de sonda uniforme em torno da célula gravada, facilitando a interpretação dos dados. Aplicação de banho também elimina a necessidade de uma segunda pipeta de perfusão do tecido, facilitando todo o processo. No entanto, aplicação de banho de caro compostos custos mais por experiência.
Comumente, solução de problemas envolve tentando entender por que nenhuma ativação nAChR é visto seguir fotólise de flash. Ao trabalhar com um tipo de célula que não foi previamente estudado com PA-Nic, o investigador deve executar sopro-aplicação local de ACh ou nicotina para determinar se os receptores suficientes são funcionalmente expressa5. Para validar que o sistema é capaz de detectar respostas de fotólise, experimentos de controle deve ser feitos nos neurônios habenula medial que expressam grandes quantidades de receptores30. Nesta área do cérebro, aplicação de banho PA-Nic é possível, que é preferível para experimentos de validação. Somente após a realização desses experimentos de validação deve um passar para um tipo de célula espontâneo. Se o sistema experimental foi validado e respostas permanecem indetectáveis ou muito pequeno, pode ser garantido para aumentar a concentração de PA-Nic, aumentar a intensidade do flash ou duração do pulso, adicionar um modulador alostérico positivo de nAChR realçar nAChR atividade6, ou alguma combinação destes.
Ocasionalmente, uncaging respostas são grandes demais…, com ativação de nAChR significativa, resultando em tensão indireta gated at+ canal ativação e destravadas correntes para dentro devido a braçadeira espaço pobre. Esses artefatos, que completamente obscurecem nAChR correntes para dentro e impossibilitam a interpretação dos dados, podem ser eliminados pela inclusão de QX-314 (2mm) na gravação de pipeta. Eles também podem ser eliminados, reduzindo a concentração de PA-Nic ou reduzindo a intensidade do flash ou duração do pulso. Em todos os experimentos de foto-estimulação de luz visível, deve ter cuidado ao selecionar locais de estimulação para evitar estimulação involuntária/fotólise acima ou abaixo do plano focal desejado. Além disso e quando aplicável, a potência do laser deve ser sempre titulada para reproduzir respostas fisiológicas. É especialmente importante estar ciente do eixo z photostimulation ao trabalhar com ligantes enjaulados, como ligantes são ativadas acima/abaixo do ponto focal podem ainda difusa e interagir com o sistema biológico (ou seja, receptores de, ), em estudo.
PA-Nic do laser flash fotólise pode não ser apropriado para todos os investigadores, como existem várias limitações. O primeiro é o custo relativamente alto de uma configuração adequada. Ao trabalhar com fatias de cérebro intacto, uncaging perto de estruturas de pequeno diâmetro como dendrites requer um sistema de visualização sofisticados, tais como um microscópio 2-fóton. Além do alto custo de um Ti:sapphire, sintonizável laser pulsado de IR para desempenho 2-fotão microscopia, um sistema de dual-galvanômetro capaz de forma independente posicionamento dois feixes de laser mais aumenta o custo do sistema. Os custos do sistema total podem ser reduzidos usando um sistema de repouso-construído, se o investigador tem suficientes conhecimentos e tempo para construir, solucionar problemas e manter um sistema desse tipo. Uma segunda limitação muitas vezes envolve nAChR baixa expressão funcional, que pode ser parcialmente atenuado, dando passos como mencionado acima, mas isto não pode garantir o sucesso. Normalmente, se um não pode medir correntes ligante ativado após o sopro-aplicação dos agonistas, fotólise de flash PA-Nic sob grampo de tensão não pode produzir resultados aceitáveis. Uma terceira limitação envolve o intrínseco fluorescência de PA-NIC. PA-Nic absorve luz de ~ 405 nm e emite em uma faixa similar como proteína verde fluorescente (GFP) ou Alexa 4885. Quando PA-Nic concentrações excedem ~ 1 mM, esta propriedade de fluorescência pode torná-lo difícil de Visualizar simultaneamente estruturas neuronais. Para atenuar isso, é fundamental para ser capaz de controlar facilmente o fluxo de PA-Nic da pipeta perfusão. Periodicamente, o fluxo de PA-Nic foi interrompido para permitir moléculas fluorescentes difundir afastado. Isto permitiu re-imagem latente do neurônio para verificar a posição do feixe de uncaging. Uma quarta limitação potencial mencionar envolve o uso de luz de nm 405 por fotólise. Comprimentos de onda mais curtos tais como 405 nm são mais propensas a dispersão no tecido complexo como uma fatia do cérebro. Assim, em um determinado flash intensidade e duração, amplitudes de resposta uncaging e cinética de decomposição podem ser diferencialmente afectadas pela profundidade do foco uncaging dentro da fatia. Conclusões sobre aspectos biológicos de nAChRs devem considerar esta advertência importante.
Esta técnica de fotólise flash laser localizada recentemente serviu para descobrir novos detalhes sobre neurobiologia nAChR. Por exemplo, exposição crônica de nicotina aumenta a perisomatic e função nAChR dendríticas em habenula medial neurônios5. Ele também foi usado para ajudar a demonstrar, pela primeira vez, que os neurônios glutamato de área tegmental ventral expressam nAChRs funcional em suas perisomatic e compartimentos celulares dendríticas6. Existem que muitos potencial futuro usa essa técnica, e a abordagem poderia ser aplicada a outros tipos de neurônio de chave que são conhecidos por nAChRs expressa, tais como os neurônios piramidais corticais31 ou interneurônios no córtex cerebral32, striatum33 e o hipocampo19. Esta técnica também pode ser combinada com gene farmacologia e/ou nAChR edição34 para localizar subtipos de receptores específicos para diferentes compartimentos neuronais. A abordagem pode ser facilmente adaptada para outros compostos de cumarina-enjaulado, incluindo, mas não limitado a, aqueles desenvolvidos em paralelo com PA-Nic5. Finalmente, PA-Nic flash fotólise um de pode dia ser usado em um animal acordado/se comportando para estudar a ação da nicotina em paradigmas de romance farmacologia comportamental.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecer laboratório membros dos seguintes investigadores principais noroeste: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy e empreiteiro de Anis. Este trabalho foi apoiado pela nos National Institutes of Health (NIH) (subsídios, DA035942 e DA040626 para R.M.D.), a Fundação PhRMA (comunhão para M.C.A) e HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |