Questo articolo presenta un metodo per lo studio dei recettori nicotinici per l’acetilcolina (nAChR) nelle fette del cervello del mouse di nicotina uncaging. Quando accoppiato con simultanea patch clamp registrazione e microscopia a scansione laser di 2 fotoni, nicotina uncaging collega la funzione del recettore nicotinico con morfologia cellulare, fornendo una più profonda comprensione della neurobiologia colinergico.
Acetilcolina (ACh) atti tramite i ricevitori per modulare una varietà di processi neuronali, ma esso è stato impegnativo per collegare la funzione del recettore ACh con subcellulare posizione all’interno delle cellule dove questa funzione è svolta. Per studiare la posizione subcellulare dei recettori nicotinici ACh (nAChR) in tessuto cerebrale nativo, un metodo ottico è stato sviluppato per uscita precisa di nicotina a luoghi discreti vicino a membrane di un neurone durante registrazioni elettrofisiologiche. Patch-premuta di neuroni nel cervello fette sono pieni di tingono di visualizzare la loro morfologia durante la microscopia a scansione laser 2-fotone e nicotina uncaging viene eseguito con un lampo di luce puntando un raggio laser di nanometro 405 vicino a uno o più membrane cellulari. Cellulare attuale deviazioni sono misurati, e immagine in alta risoluzione tridimensionale (3D) del neurone registrato è fatto per permettere la riconciliazione delle risposte dei nAChR con morfologia cellulare. Questo metodo permette l’analisi dettagliata della distribuzione funzionale dei nAChR nelle preparazioni di tessuto complesso, promettente per migliorare la comprensione della neurotrasmissione colinergica.
Segnalazione colinergici modula numerosi processi cerebrali, tra cui controllo attentivo, movimento volitivo e ricompensa1,2. Farmaci che migliorano la trasmissione dell’acetilcolina (ACh) sono usati per trattare deficit cognitivo associato a malattia di Alzheimer, che implica un ruolo importante per i sistemi colinergici nella cognizione3. Una migliore comprensione dei recettori colinergici e circuiti negli stati sani e malati potrebbe portare a migliori approcci terapeutici per varie malattie neurologiche.
Recettori nicotinici di ACh (nAChR) sono una famiglia di canali ionici ligando che flusso di cationi in risposta a ACh endogeno o esogena nicotina da prodotti del tabacco. Dato il fatto che essi erano tra i recettori del neurotrasmettitore molto primi di essere descritto4, farmacologia dei nAChR e posizione nelle fibre muscolari è ben capito per recettori di tipo muscolare. Al contrario, comparativamente piccolo è conosciuto circa la farmacologia e la distribuzione subcellulare di nativo recettori nicotinici nel cervello. Questa lacuna nella conoscenza è stato recentemente affrontata attraverso lo sviluppo di una sonda chimica romanzo che permette per spazialmente limitato e rapida attivazione di recettori nicotinici nel tessuto cerebrale durante imaging cellulare e registrazioni elettrofisiologiche5. Qui, sono descritti i passaggi metodologici chiave coinvolti in questo approccio, con l’obiettivo generale di rafforzare la capacità di collegare dei nAChR funzione con struttura di un neurone.
Fuse nicotina (PA-Nic; nome chimico: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-ammino] cumarina-4-yl] metile-nicotina) possono essere photolyzed con ~ 405 nm laser lampeggia per rilasciare in modo efficiente nicotina5,6. Prima del uncaging, PA-Nic è stabile in soluzione ed esibisce senza spiacevoli caratteristiche farmacologiche o fotochimica5. Dopo fotolisi, nicotina rilasciata prevedibilmente attiva i nAChR e i sottoprodotti uncaging sono farmacologicamente inerte5. Un laser continuo-fluttuano è utilizzato come la sorgente luminosa di fotolisi con potenza > 1 mW misurata al campione. Quando localizzate, foto-stimolazione mirata è combinata con la capacità di individuare le membrane cellulari con laser 2-fotone microscopia (2PLSM), e i due vantaggi chiavi di questo approccio sono pienamente realizzati: fotolisi velocità e precisione spaziale.
In molti aspetti, la fotolisi di PA-Nic sono superiore ad altri metodi di consegna dei nAChR ligandi per recettori all’interno di fette del cervello. Tali approcci includono vasca applicazione7 e droga locale consegna tramite una pipetta di palla8. Considerando che il primo approccio tende a enfatizzare eccessivamente gli effetti a lungo termine del farmaco applicato, quest’ultimo approccio può soffrire di variabilità nella cinetica di risposta tra prove e attraverso le cellule. Nessuno di questi approcci alternativi in grado di distinguere adeguatamente attività del ricevitore in luoghi diversi cellulari dal neurone stesso. Optogenetically-attiva il rilascio di ACh è stato utilizzato per le indagini di nAChR nativi9,10,11, ma non si è dimostrato utile per percorsi di mapping subcellulare dei nAChR. Inoltre, la maggior parte degli studi che utilizzano questo approccio hanno contato su un topo di transgenico artificiali batterici del cromosoma ChR2-esprimendo con trasmissione colinergica anormale12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolisi non sono l’approccio solo ottica di studio dei recettori colinergici. Una gabbia carbachol era utilizzato per il mapping funzionale attività di recettore ACh in cellule coltivate18 e cervello fette19, ma non era disponibile in commercio per studi comparativi durante lo sviluppo del PA-nic. Un bis di rutenio (bipyridine)-nicotina complessa (RuBi-nicotina) è stata segnalata per consentire nicotina uncaging20, ma le preparazioni commerciali di RuBi-nicotina si è rivelata inferiore a PA-Nic in un confronto testa a testa studiano5. Può essere utile ripetere tali esperimenti comparativi con non-commerciale, altamente purificato RuBi-nicotina, come suo assorbimento visibile potrebbe complimento caratteristiche di PA-Nic per studi colinergici. Infine, i nAChR sono anche stati otticamente manipolati utilizzando una combinazione di foto-commutabile ligandi e recettori geneticamente21. Questo approccio è complementare alla PA-Nic fotolisi in tessuto cerebrale, con il requisito di capacità di targeting genetici per i nAChR modificate visto come sia un vantaggio e uno svantaggio.
Diversi requisiti chiavi di questo approccio dovrebbero essere notati. In primo luogo, un metodo di visualizzazione appropriato è necessario per individuare con precisione la membrana di un neurone. Imaging con microscopia convenzionale epi-fluorescenza può essere sufficiente quando studiare cellule coltivate, ma per la registrazione da neuroni in fettine di cervello o altre preparazioni di tessuto spesso, 2PLSM o la microscopia confocale è un requisito. In secondo luogo, è necessario un metodo adatto per posizionare il raggio laser fotolisi. Questo approccio utilizza una testa di scansione dual-galvanometro con due specchi indipendente x-y per raster scansione del fascio imaging e punto fotoattivazione utilizzando il uncaging laser fascio22,23,24. Altri, più limitati soluzioni sono possibili, come (1) una testa di scansione single-galvanometro che in alternativa raster analizza il fascio di imaging e il fascio uncaging o (2) semplicemente dirigere il fascio uncaging al centro del campo di vista tale che la cella è portata a Questa posizione per fotolisi. In terzo luogo, occorre un sistema per la registrazione simultanea di elettrofisiologici se si vuole raccogliere segnali fisiologici durante gli esperimenti. I suddetti requisiti possono essere soddisfatte con una tecnica di imaging ottico adatta, come recentemente descritto5. Di seguito è incluso un protocollo dettagliato che descrive i passaggi chiave di questo approccio.
La scelta del metodo di applicazione/consegna PA-Nic è il punto più critico in questa tecnica di foto-stimolazione localizzata. I due metodi, applicazione vasca e perfusione locale, ciascuno offrono diversi vantaggi e limitazioni. La scelta è in gran parte influenzata dal livello di espressione funzionale di nAChR nel tipo di cella di interesse. Spesso è preferibile utilizzare bagno applicazione quando i livelli di espressione funzionale sono alti, come vasca applicazione permette una concentrazione uniforme sonda che circonda la cella registrata, facilitando l’interpretazione dei dati. Applicazione di vasca elimina anche la necessità di una seconda pipetta di aspersione nel tessuto, rendendo l’intero processo più facile. Tuttavia, applicazione vasca dei costosi composti costi ulteriori per esperimento.
Risoluzione dei problemi coinvolge comunemente, cercando di capire perché nessuna attivazione dei nAChR è visto fotolisi seguente. Quando si lavora con un tipo di cellula che precedentemente non è stato studiato con PA-Nic, l’investigatore deve eseguire puff-applicazione locale di ACh o nicotina per determinare se sufficienti recettori sono funzionalmente espresso5. Per convalidare che il sistema è in grado di rilevare le risposte fotolisi, esperimenti di controllo dovrebbe essere fatto in neuroni habenula mediale che esprimono grandi quantità di recettori30. In questa zona del cervello, PA-Nic vasca applicazione è possibile, che è preferibile per esperimenti di convalida. Solo dopo aver eseguito questi esperimenti di convalida dovrebbe uno spostare un tipo di cella. Se il sistema sperimentale è stato convalidato e le risposte rimangono molto piccoli o non rilevabili, esso può essere giustificata per aumentare la concentrazione di PA-Nic, aumentare l’intensità del flash o la durata dell’impulso, aggiungere un modulatore allosterico positivo di nAChR ad usufruire dei nAChR attività6, o una combinazione di questi.
Occasionalmente, uncaging risposte sono troppo grandi, con attivazione dei nAChR significativo conseguente indiretto tensione gated Na+ canale attivazione e sbloccaggio correnti interne a causa di morsetto povero spazio. Questi manufatti, che completamente oscurano correnti interne dei nAChR e rendono impossibile la interpretazione dei dati, possono essere eliminati con l’inclusione di QX-314 (2 mM) nella pipetta di registrazione. Essi possono anche essere eliminati riducendo la concentrazione di PA-Nic o riducendo l’intensità del flash o la durata dell’impulso. In tutti gli esperimenti di foto-stimolazione luminosa visibile, si deve prestare attenzione quando si seleziona siti di stimolazione per evitare indesiderate stimolazione/fotolisi sopra o sotto il piano focale desiderato. Inoltre e quando applicabile, la potenza del laser deve essere titolata sempre per riprodurre risposte fisiologiche. È particolarmente importante essere consapevoli di fotostimolazione asse z quando si lavora con ligandi in gabbia, come ligandi che vengono attivate sopra/sotto la macchia focale possono ancora diffusa e interagire con il sistema biologico (cioè recettori, ) in fase di studio.
PA-Nic laser fotolisi potrebbe non essere appropriato per tutti gli investigatori, come esistono diverse limitazioni. Il primo è il costo relativamente elevato di un allestimento adatto. Quando si lavora con le fette di cervello intatto, uncaging vicino a strutture di piccolo diametro come dendriti richiede un sistema di visualizzazione sofisticata come un microscopio 2-fotone. A parte il costo elevato di una ti, tunable laser pulsato IR per microscopia 2-fotone performante, un sistema dual-galvanometro capace di indipendentemente due fasci laser di posizionamento ulteriormente aumenta il costo del sistema. Costo totale del sistema può essere ridotto utilizzando un sistema casa costruita se il ricercatore ha sufficiente competenza e tempo per costruire, risolvere i problemi e mantenere un tale sistema. Una seconda limitazione spesso comporta dei nAChR bassa espressione funzionale, che può essere parzialmente mitigato adottando misure come accennato in precedenza, ma questo non può garantire il successo. In genere, se uno non può misurare correnti ligando-attivati seguendo puff-applicazione di agonisti, PA-Nic fotolisi sotto morsetto di tensione non può produrre risultati accettabili. Un terzo limite comporta l’intrinseca fluorescenza del PA-NIC PA-Nic assorbe la luce di ~ 405 nm ed emette in una gamma simile come proteina fluorescente verde (GFP) o Alexa 4885. Quando le concentrazioni di PA-Nic superano ~ 1 mM, questa proprietà di fluorescenza può rendere difficile da visualizzare contemporaneamente strutture neuronali. Per ovviare a questo inconveniente, è fondamentale essere in grado di controllare facilmente il flusso di PA-Nic dalla pipetta aspersione. Periodicamente, il flusso di PA-Nic è stata interrotta per consentire molecole fluorescenti diffondere la distanza. Questo permesso di re-imaging del neurone per controllare la posizione spot del fascio uncaging. Una limitazione potenziale quarta parlare implica l’uso di 405 nm luce per fotolisi. Lunghezze d’onda più corta come 405 nm sono più inclini a dispersione nel complesso tessuto come una fetta di cervello. Così, a una determinata intensità del flash e durata, uncaging risposta ampiezze e cinetica di decadimento possono differenzialmente risentire la profondità del fuoco uncaging all’interno della slice. Conclusioni sugli aspetti biologici di nAChR dovrebbero tener conto questo avvertimento importante.
Questa tecnica di fotolisi localizzata laser è stata utilizzata recentemente per scoprire nuovi dettagli sulla neurobiologia dei nAChR. Ad esempio, esposizione cronica alla nicotina migliora la perisomatic e la funzione dei nAChR dendritiche in habenula mediale neuroni5. È stato utilizzato anche per aiutare a dimostrare, per la prima volta, che area tegmentale ventrale del glutammato neuroni esprimono recettori nicotinici funzionale nel loro perisomatic e compartimenti cellulari dendritiche6. Ci sono che molti potenziali futuri usi di questa tecnica, e l’approccio potrebbe essere applicato ad altri tipi di neurone chiave che sono noti per i nAChR espresso, quali neuroni piramidali corticali31 o interneuroni in corteccia cerebrale32, striato33 e ippocampo19. Questa tecnica potrebbe anche essere combinata con gene farmacologia e/o dei nAChR34 per localizzare i sottotipi recettoriali specifici per diversi compartimenti neuronali di editing. L’approccio può essere facilmente adattato ad altri composti di cumarina-messo in gabbia, tra cui, ma non limitati a, quelle sviluppate in parallelo con PA-Nic5. Infine, PA-Nic fotolisi un giorno potrebbe essere utilizzato in un animale sveglio/comportarsi per studiare l’azione di nicotina in paradigmi di romanzo farmacologia comportamentale.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano i membri di laboratorio dei seguenti ricercatori principali nord-occidentale: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy e Anis appaltatore. Quest’opera era supportata da il noi National Institutes of Health (NIH) (sovvenzioni DA035942 e DA040626 a R.M.D.), PhRMA Foundation (fellowship per M.C.A) e HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |