Dit artikel presenteert een methode voor het bestuderen van nicotinerge acetylcholine-receptoren (nAChRs) in muis hersenen plakjes door nicotine uncaging. Wanneer in combinatie met de gelijktijdige patch klem opname en 2-foton laser scanning microscopie, verbindt nicotine uncaging nicotinerge receptor functie met cellulaire morfologie, bieden een dieper begrip van cholinerge neurobiologie.
Acetylcholine (ACh) werkt via receptoren te moduleren van een verscheidenheid van neuronale processen, maar het heeft zijn uitdagend te koppelen ACh receptor functie met subcellular locatie in cellen waar deze functie wordt uitgevoerd. Studeren de subcellular locatie van nicotinerge ACh-receptoren (nAChRs) in native hersenweefsel, werd een optische methode ontwikkeld voor precieze release van nicotine op afzonderlijke locaties in de buurt van neuronale membranen tijdens elektrofysiologische opnames. Patch-geklemd neuronen in de hersenen segmenten zijn gevuld met kleurstof te visualiseren van hun morfologie tijdens 2-foton laser scanning microscopie, en nicotine uncaging wordt uitgevoerd met een lichte flits door zich te richten een 405 nm laserstraal in de buurt van een of meer van de cellulaire membranen. Cellulaire huidige verlegging worden gemeten, en een hoge resolutie driedimensionale (3D) beeld van de opgenomen neuron is getroffen op grond waarvan verzoening van nAChR reacties met cellulaire morfologie. Deze methode zorgt voor een gedetailleerde analyse van de functionele verdeling van de nAChR in complexe weefsel preparaten, belooft om het inzicht van cholinerge transmissie te vergroten.
Cholinerge signalering moduleert talrijke processen van de hersenen, waaronder attentional controle, bewuste beweging en beloning1,2. Geneesmiddelen die verbeteren van acetylcholine (ACh) transmissie worden gebruikt voor de behandeling van cognitieve stoornissen geassocieerd met de ziekte van Alzheimer, impliceert een belangrijke rol voor de cholinerge systemen in cognitie3. Een beter begrip van cholinerge receptoren en circuits in gezonde en zieke Staten kan leiden tot betere therapeutische benaderingen voor verschillende neurologische ziekten/aandoeningen.
Nicotinerge ACh-receptoren (nAChRs) zijn een familie van ligand-gated ionenkanalen die flux caties in reactie op ACh endogene of exogene nicotine van tabaksproducten. Gezien het feit dat ze behoorden tot de allereerste receptoren van de neurotransmitter beschreven4, is nAChR farmacologie en locatie in spiervezels goed begrepen voor spier-achtige receptoren. Daarentegen, is relatief weinig bekend over de farmacologie en subcellular distributie van inheemse nAChRs in de hersenen. Deze lacunes in de kennis werd onlangs behandeld door het ontwikkelen van een nieuwe chemische sonde die voorziet in ruimtelijk beperkte en snelle activering van nAChRs in hersenweefsel tijdens cellulaire beeldvorming en elektrofysiologische opname5. Hier worden de belangrijkste methodologische stappen betrokken bij deze aanpak beschreven, met het algemene doel van verbetering van de mogelijkheid om nAChR functie verbinding met neuronale structuur.
Photoactivatable nicotine (PA-Nic; chemische naam: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] cumarine-4-yl] methyl-nicotine) kunnen photolyzed met ~ 405 nm laser knippert om efficiënt release nicotine5,6. Voorafgaand aan uncaging, PA-Nic is stabiel in de oplossing en vertoont geen ongewenst farmacologische of fotochemische functies5. Na fotolyse, vrijgegeven nicotine voorspelbaar activeert nAChRs en de uncaging bijproducten zijn farmacologisch inert5. Een continuous-wave laser wordt gebruikt als de fotolyse lichtbron met een uitgangsvermogen > 1 mW gemeten bij het monster. Wanneer gelokaliseerd, gerichte foto-stimulatie wordt gecombineerd met de mogelijkheid om te zoeken van cellulaire membranen met 2-foton laser scanning microscopie (2PLSM), en de twee belangrijkste voordelen van deze benadering volledig worden gerealiseerd: fotolyse snelheid en ruimtelijke precisie.
In de meeste opzichten is fotolyse van PA-Nic superieur aan andere methoden van het leveren van nAChR liganden aan receptoren in de hersenen segmenten. Dergelijke benaderingen omvatten Bad toepassing7 en lokale drug levering via een puffer Pipetteer8. Overwegende dat de voormalige aanpak heeft de neiging om te benadrukken over de langetermijneffecten van de toegepaste drug, kan de laatste benadering last van variabiliteit in reactie-kinetiek tussen proeven en over cellen. Geen van deze alternatieve benaderingen kan adequaat receptor activiteiten in verschillende cellulaire locaties uit de dezelfde neuron onderscheiden. Optogenetically-geactiveerde versie van ACh is gebruikt voor onderzoek van inheemse nAChRs9,10,11, maar het is niet bewezen nuttig voor toewijzing subcellular nAChR locaties. Bovendien, de meeste studies met behulp van deze aanpak hebben vertrouwd op een ChR2-uiten bacteriële kunstmatig chromosoom transgene muis met abnormale cholinerge transmissie12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolyse is niet de alleen optische aanpak voor het bestuderen van cholinerge receptoren. Een gekooide carbachol werd gebruikt om functioneel kaart ACh receptor activiteiten in gekweekte cellen18 en hersenen segmenten19, maar was niet commercieel beschikbaar voor vergelijkende studies tijdens de ontwikkeling van PA-Nic. Een ruthenium-bis (bipyridine)-nicotine complexe (RuBi-nicotine) werd gemeld dat voor nicotine uncaging20, maar commerciële preparaten van RuBi-nicotine bewezen inferieur aan PA-Nic in een head-to-head vergelijking studeren5. Het wellicht nuttig om te herhalen van dergelijke vergelijkende experimenten met niet-commerciële, sterk gezuiverd RuBi-nicotine, zoals haar zichtbaar absorptie PA-Nic’s functies voor cholinerge studies kan complimenteren. Tot slot, nAChRs zijn ook optisch gemanipuleerd met behulp van een combinatie van foto-schakelbare liganden en genetisch gemodificeerde receptoren21. Deze aanpak vormt een aanvulling op de PA-Nic fotolyse in hersenweefsel, met de mogelijkheid/eis van genetische doelgerichtheid van de gewijzigde nAChR gezien als zowel een voordeel als een nadeel.
Verschillende belangrijke vereisten van deze aanpak moeten worden opgemerkt. Eerst, is een passende visualisatie methode nodig om nauwkeurig het vinden van de neuronale membraan. Beeldbewerking met conventionele epi-fluorescentie microscopie kan het volstaan bij de studie van gekweekte cellen, maar voor het opnemen van neuronen in de hersenen segmenten of andere preparaten dik weefsel, 2PLSM of confocale microscopie is een vereiste. Ten tweede, een geschikte methode is nodig om de positie van de laserstraal fotolyse. Deze aanpak maakt gebruik van een dual-galvanometer scan hoofd met twee onafhankelijke x-y spiegels voor het scannen van het raster van de beeldvorming en punt photoactivation met behulp van de uncaging laser beam22,23,24. Andere, meer beperkte oplossingen zijn mogelijk, zoals (1) een honkslag-galvanometer scan hoofd dat als alternatief raster scant de imaging lichtbundel en de uncaging-straal of (2) gewoon regisseren de uncaging balk naar het midden van het gezichtsveld, zodanig dat de cel wordt gebracht Dit standpunt voor flash fotolyse. Ten derde, een systeem is vereist voor gelijktijdige elektrofysiologische opnemen als men wil verzamelen van fysiologische signalen tijdens experimenten. De bovengenoemde eisen kunnen worden voldaan met een geschikt geheel optische beeldvormende techniek, als recent beschreven5. Hieronder een gedetailleerd protocol is opgenomen dat beschrijft de belangrijkste stappen van deze aanpak.
De keuze van PA-Nic toepassing/leveringsmethode is de meest kritische stap in deze techniek gelokaliseerde foto-stimulatie. De twee methoden, de toepassing van het bad en de lokale perfusie, biedt elk verschillende voordelen en beperkingen. De keuze wordt grotendeels beïnvloed door de nAChR functionele expressie niveau in het celtype van belang. Het is handiger bad om toepassing te gebruiken als functionele expressie niveaus hoog, zijn omdat Bad toepassing voor een uniforme sonde concentratie rond de opgenomen cel zorgt, data interpretatie te vergemakkelijken. Bad toepassing elimineert ook de behoefte aan een tweede perfusie pipet in het weefsel, waardoor het hele proces makkelijker. Bad toepassing van dure verbindingen echter kosten meer per experiment.
Algemeen, gaat probleemoplossing proberen te begrijpen waarom geen nAChR activering gezien volgende flash fotolyse is. Wanneer u werkt met een celtype die niet eerder met PA-Nic onderzocht is, lokale bladerdeeg-toepassing van ACh moet worden uitgevoerd door de onderzoeker of nicotine vaststellen of voldoende receptoren functioneel zijn uitgedrukte5. Om te controleren dat het systeem geschikt is voor het opsporen van fotolyse reacties, moet controle experimenten in mediale habenula neuronen die uitdrukking geven aan grote hoeveelheden receptor30gebeuren. Op dit gebied van de hersenen is PA-Nic Bad toepassing mogelijk, dat is beter voor validatie experimenten. Alleen na het uitvoeren van deze experimenten validatie moet men overgaan tot een ongedwongen celtype. Als de experimenteel systeem is gevalideerd en reacties erg klein of niet detecteerbaar blijven, het gerechtvaardigd kan zijn om te verhogen de concentratie van PA-Nic, verhogen van de intensiteit van de flits of de impulstijd, het toevoegen van een positieve allosteric modulator nAChR ter verbetering van nAChR activiteit6, of een combinatie van deze.
Af en toe, uncaging reacties zijn te groot, met aanzienlijke nAChR activering resulterend in indirecte spanning gated nb+ channel activering en unclamped naar binnen stromen toe te schrijven aan slechte ruimte klem. Deze artefacten, die volledig duistere nAChR naar binnen stromen en data interpretatie onmogelijk maken, kunnen door opname van QX-314 (2 mM) in de pipet opname worden geëlimineerd. Ze kunnen ook worden geëlimineerd door vermindering van de concentratie van PA-Nic of door het verminderen van de intensiteit van de flits of de impulstijd. In alle zichtbaar licht foto-stimulatie experimenten, moet voorzichtigheid worden betracht bij de keuze van de stimulatie sites om te voorkomen dat onbedoelde stimulatie/fotolyse boven of onder het gewenste brandvlak. Daarnaast en wanneer van toepassing, de kracht van de laser moet altijd worden getitreerd om te reproduceren van fysiologische reacties. Het is vooral belangrijk om te beseffen van de z-as photostimulation bij het werken met gekooide liganden, zoals liganden die zijn geactiveerd boven/onder de focale plek kunnen nog diffuus en interactie met het biologische systeem (dwz, -receptoren) bestudeerd.
PA-Nic laser flash fotolyse wellicht niet geschikt voor alle onderzoekers, zoals verschillende beperkingen bestaan. De eerste is de relatief hoge kosten van een geschikt set-up. Bij het werken met intact hersenen segmenten, uncaging in de buurt van kleine diameter structuren zoals dendrites vereist een geavanceerde visualisatie systeem zoals een 2-foton microscoop. Afgezien van de hoge kosten van een Ti:sapphire, afstembare IR gepulste laser voor presterende 2-foton microscopie, verhoogt een dual-galvanometer systeem dat kan zelfstandig verder positionering twee laserstralen de kosten van het systeem. Totale systeemkosten kunnen worden verlaagd met behulp van een huis-gebouwde systeem als de onderzoeker beschikt over voldoende deskundigheid en tijd om te bouwen, oplossen en onderhouden van een dergelijk systeem. Een tweede beperking vaak gaat om lage nAChR functionele expressie, die kan gedeeltelijk worden opgevangen door maatregelen te nemen zoals hierboven vermeld, maar dit kan geen garantie voor succes. Meestal, als een ligand-geactiveerde stromingen na bladerdeeg-toepassing van agonisten niet kunt meten, PA-Nic flash fotolyse onder spanning klem kan geen aanvaardbare resultaten opleveren. Een derde beperking betreft de intrinsieke fluorescentie van PA-Nic. PA-Nic ~ 405 nm licht absorbeert en stoot in een vergelijkbaar bereik als de groen fluorescente proteïne (GFP) of Alexa 4885. Als PA-Nic concentraties ~ 1 mM overschrijden, kan deze eigenschap fluorescentie maken het uitdagend om te visualiseren gelijktijdig neuronale structuren. Om te verhelpen dit, is het van cruciaal belang om gemakkelijk de transportbesturing van PA-netwerkkaart uit de perfusie-pipet te kunnen. Van tijd tot tijd werd de PA-Nic stroom gestopt zodat fluorescerende moleculen te verspreiden weg. Dit toegestaan opnieuw beeldvorming van het neuron voor het controleren van de contante positie van de uncaging lichtbundel. Een vierde mogelijke beperking wil impliceert het gebruik van 405 nm licht voor fotolyse. Kortere golflengten zoals 405 nm zijn meer vatbaar voor verstrooiing in complexe weefsel zoals een segment van de hersenen. Dus, op een bepaalde flash intensiteit en duur, uncaging reactie amplitudes en verval kinetiek kunnen worden differentieel beïnvloed door de diepte van de focus van de uncaging binnen het segment. Conclusies over de biologische aspecten van nAChRs moeten rekening houden met dit belangrijke voorbehoud.
Deze gelokaliseerde laser flash fotolyse techniek is onlangs gebruikt om te ontdekken van nieuwe details over nAChR neurobiologie. Bijvoorbeeld verbetert chronische nicotine blootstelling perisomatic en dendritische nAChR functie in mediale habenula neuronen5. Het werd ook gebruikt om te helpen tonen, voor de eerste keer, dat ventrale tegmental gebied glutamaat neuronen express functionele nAChRs in hun perisomatic en dendritische cellulaire compartimenten6. Er zijn dat veel potentiële toekomstige gebruik van deze techniek, en de aanpak kan worden toegepast op andere belangrijke neuron typen waarvan bekend is dat uitdrukkelijke nAChRs, zoals corticale piramidale neuronen31 of interneuronen in de hersenschors32, striatum33 , en hippocampus19. Deze techniek kan ook worden gecombineerd met farmacologie en/of nAChR gen bewerken34 om te lokaliseren specifieke receptor subtypes aan verschillende neuronale compartimenten. De aanpak kan gemakkelijk aangepast worden aan andere cumarine-caged verbindingen, met inbegrip van maar niet beperkt tot, parallel met PA-Nic5ontwikkeld. Ten slotte, PA-Nic flash fotolyse kan een dag worden gebruikt in een dier wakker/gedragen om nicotine van actie in de roman gedrags farmacologie paradigma’s te bestuderen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken laboratorium leden van de volgende noordwesten belangrijkste onderzoekers: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy en Anis aannemer. Dit werk werd ondersteund door de ons National Institutes of Health (NIH) (subsidies DA035942 en DA040626 naar R.M.D.), de PhRMA Foundation (Genootschap voor M.C.A.) en HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |