Summary
Denne artikkelen presenterer en metode for å studere nikotinsyre acetylkolin reseptorer (nAChRs) i musen hjernen skiver av nikotin uncaging. Når kombinert med samtidige oppdateringen klemme opptak og 2-fotonet laserskanning mikroskopi, forbinder nikotin uncaging nikotinsyre reseptoren funksjonen med cellular morfologi, gir en dypere forståelse av cholinergic nevrobiologi.
Abstract
Acetylcholin (ACh) fungerer gjennom reseptorer å modulere en rekke neuronal prosesser, men det har vært utfordrende koble ACh reseptor funksjon subcellular beliggenhet i celler der denne funksjonen blir utført. For å studere subcellular plasseringen av nikotinsyre ACh reseptorer (nAChRs) i native hjernevev, ble en optisk metoden utviklet for presis utgivelsen av nikotin diskret steder nær neuronal membraner under elektrofysiologiske innspillinger. Patch-festet nerveceller i hjernen skiver er fylt med fargestoff visualisere deres morfologi under 2-fotonet laser skanning mikroskopi og nikotin uncaging utføres med en lys flash ved å fokusere en 405 nm laserstråle nær én eller flere mobilnettet membraner. Mobilnettet gjeldende avvisninger er måles og tredimensjonale (3D) oppløsning av innspilte Nevron er laget for å tillate avstemming av nAChR svar med cellular morfologi. Denne metoden gir detaljert analyse av nAChR funksjonelle distribusjon i komplekse vev preparater, lovende å forbedre forståelsen av cholinergic neurotransmission.
Introduction
Cholinergic signalering modulerer tallrike hjernen prosesser, inkludert attentional kontroll, volitional bevegelse og belønning1,2. Stoffer som forbedrer acetylkolin (ACh) overføring brukes til å behandle kognitiv svekkelse forbundet med Alzheimers sykdom, antyder en viktig rolle for cholinergic systemer i kognisjon3. En bedre forståelse av cholinergic reseptorer og krets i friske og syke tilstander kan føre til bedre terapeutiske metoder for flere nevrologiske sykdommer/lidelser.
Nikotinsyre ACh reseptorer (nAChRs) er en familie av ligand-gated ionekanaler som flux kasjoner svar på endogene ACh eller eksogene nikotin fra tobakksprodukter. Gitt det faktum at de var blant første nevrotransmitter receptors skal beskrives4, er nAChR farmakologi og beliggenhet i muskelfibre lett å forstå for muskel-type reseptorer. Derimot er relativt lite kjent om farmakologi og subcellular fordeling av innfødte nAChRs i hjernen. Dette gapet i kunnskap ble nylig behandlet ved å utvikle en roman kjemiske sonde som tillater romlig begrenset og rask aktivering av nAChRs i hjernevevet under mobil bildebehandling og elektrofysiologiske innspillingen5. Her, er de viktigste metodologiske trinnene involvert i denne tilnærmingen beskrevet, med det overordnede målet for å styrke evnen til å koble nAChR fungere med neuronal struktur.
Photoactivatable nikotin (PA-Nic, kjemisk navn: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] kumarin-4-yl] metyl-nikotin) kan photolyzed med ~ 405 nm laser blinker å gi effektivt nikotin5,6. Før uncaging, PA-Nic er stabil i løsningen og utstillinger ingen uheldige farmakologiske eller fotokjemisk funksjoner5. Etter photolysis, utgitt nikotin forutsigbart aktiverer nAChRs og uncaging biprodukter er farmakologisk inert5. En continuous-wave laser brukes som photolysis lyskilden med en utgangseffekt > 1 mW målt på prøven. Når lokalisert, målrettet Foto-stimulering er kombinert med muligheten til å finne mobilnettet membraner med 2-fotonet laserskanning mikroskopi (2PLSM), og de to viktigste fordelene med denne tilnærmingen er fullt ut realisert: photolysis fart og romlig presisjon.
I de fleste henseender er photolysis av PA-Nic overordnet andre metoder for å levere nAChR ligander til reseptorer i hjernen skiver. Disse inkluderer bad programmet7 og lokale stoffet levering via en puffer pipette8. Mens tidligere tilnærming tendens til å over-understreke de langsiktige effektene av brukte stoffet, kan sistnevnte tilnærming lide av variasjon i svaret kinetics mellom forsøk og i celler. Ingen av disse alternative metodene kan tilstrekkelig skille reseptor aktiviteter i mobilnettet steder fra samme Nevron. Optogenetically-aktivert versjon av ACh er brukt for undersøkelse av innfødte nAChRs9,10,11, men det har ikke vist seg nyttig for kartlegging subcellular nAChR steder. Videre, de fleste studier utnytte denne tilnærmingen har stolt på ChR2-uttrykke bakteriell kunstig kromosom transgene mus med unormal cholinergic overføring12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic photolysis er ikke bare optisk tilnærming for å studere cholinergic reseptorer. En bur carbachol ble brukt til å tilordne funksjonelt ACh reseptor aktiviteter i kulturperler celler18 og hjernen skiver19, men var ikke kommersielt tilgjengelig for komparative studier under utviklingen av PA-nettverkskortet. En selskapets bis (bipyridine)-nikotin komplekse (RuBi-nikotin) ble rapportert å ha nikotin uncaging20, men kommersielle preparater av RuBi-nikotin viste seg underlegne PA-Nic i en head-to-head sammenligning studere5. Det kan være nyttig å gjenta slike sammenlignende eksperimenter med ikke-kommersielle svært renset RuBi-nikotin, som sine synlig absorpsjon kan kompliment PA-nettverkskortets funksjoner for cholinergic studier. Til slutt, nAChRs har også blitt optisk manipulert ved hjelp av en kombinasjon av foto-valgbar ligander og genetisk endret reseptorer21. Denne tilnærmingen er utfyllende til PA-Nic photolysis i hjernevev, med evne til/kravet til genetisk målretting av den endrede nAChR sett både en fordel og en ulempe.
Flere viktige krav av denne tilnærmingen bør bemerkes. Først er en passende visualisering metode nødvendig for å nøyaktig finne neuronal membranen. Bildebehandling med konvensjonelle epi-fluorescens mikroskopi kan være tilstrekkelig når studere kulturperler celler, men for opptak fra nerveceller i hjernen skiver eller andre tykk vev preparater, 2PLSM eller AC confocal mikroskopi er et krav. Andre er en egnet metode nødvendig å plassere photolysis laserstrålen. Denne tilnærmingen utnytter en dual-galvanometer Skannerhodet med to uavhengige XY speil for raster skanning av tenkelig strålen, og punktet photoactivation med de uncaging laser stråle22,23,24. Andre, mer begrenset løsninger er mulig, for eksempel (1) en enkelt-galvanometer Skannerhodet at alternativt raster skanner tenkelig strålen og uncaging strålen, eller (2) bare beordrer uncaging strålen til midten av synsfeltet slik at cellen er brakt til denne posisjonen for flash photolysis. Tredje, et system er nødvendig for samtidige elektrofysiologiske opptak hvis man ønsker å samle fysiologiske signaler under eksperimenter. Kravene ovenfor kan bli møtt med en egnet all-optisk tenkelig teknikk, som nylig beskrevet5. Nedenfor en detaljert protokoll er inkludert som beskriver de viktigste trinnene av denne tilnærmingen.
Protocol
Arbeid knyttet til hjernen stykke forberedelse ble vurdert og godkjent av Northwestern University Animal Care og bruk Committee (protocol #IS00003604).
Forsiktig: Laserne brukte for punkt Foto-stimulering er synlig KlasseIIIb lasere som har potensial til å skade øynene. 2PLSM krever en nær-infrarøde (NIR) klasse IV laser (> 500 mW), som har potensial til å forårsake alvorlig skade på øynene og selv brannskader i andre vev. Riktig laser strålen forvaring, systemet sikkerhetsanordninger, samt utvikling og administrative kontroller kreves for å sikre trygg bruk av laser-basert utstyr. Alltid oppsøke lokale laser vernepersonell når du arbeider med lasere.
1. kalibrering og verifisering av Uncaging Laser(s)
-
Kvantifisere laser makt leveres til prøven.
- Slå på 405 nm laser (100 mW maksimal effekt med 5 V-kontrollsignal) og la Lasersystemet varme opp om 10 min.
Merk: Laseren er fortsatt shuttered (med 0 V-stasjon), og det er ingen utgangseffekt til laser blir sendt en kontroll spenning å modulere utgangseffekten. - Plass en strømmåleren i vev eksempel flyet eller i stedet for kondensatoren linsen. Manuelt senter måleren i forhold til den optiske banen/linsen.
- Angi måleren riktig bølgelengdeområde (400-1100 nm). Null måleren av nedslående den aktuelle knappen.
- Bruk programvarekontroller velge 100 (ut av maks 1000, 1000 = 5 V) for 405 nm laser makt, som setter laseren 10% full strøm. Eventuelt laser kontroll spenningen kan også mates inn den PrairieView system via VoltageRecord til å registrere digitale kommandoen signal timing og nivå.
- Registrere lesing fra strømmåleren.
- Velg 150 (15% maks 1000) for 405 nm laser strømforbruket og registrere lesing fra strømmåleren. Gjenta dette for følgende utdata krefter til å samle en laser strøm kurve: 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, og 1000.
- Slå på 405 nm laser (100 mW maksimal effekt med 5 V-kontrollsignal) og la Lasersystemet varme opp om 10 min.
-
Kalibrere uncaging laser galvanometers. Utfør følgende trinn når det er endringer i optiske komponentene i systemet, når det er en bekymring om nøyaktig sted plassering eller regelmessig hver måned.
- Installere 60 x vann-dipping mikroskop linsen som skal brukes i photostimulation og tenkelig eksperimenter. I oppkjøpet tenkelig programvare, Velg 60 x linsen og en optisk zoom-innstilling på 1 (se trinn 3.1.4.2.).
- Merke en fylt sirkel på et rent glass mikroskopi lysbilde med en rød permanent markør. Plass lysbildet på mikroskopet scenen, med merket mot målet.
- Pre-fokus mikroskopet på rød markør regionen med en 4 x eller 10 x mål. Legge til 1-2 mL vann til toppen av rød markør dot/sted og deretter bytte til 60 x målet og senk målet i vannet. Fokus på linsen på tynn rød markør regionen.
- Bytt til 2-fotonet laserskanning. For de fleste systemer, flytte turret plasser #1, flytte trinocular prisme av lys banen, flytte skanning hodet speilet foran og sette laser bølgelengden til ~ 900 nm. Velg alternativet 512 x 512 piksler boksen for bilde oppkjøpet parameterne, som er standard pixel element for stimulering speil kalibrering rutine.
- Start-system skanning med bilde laser makt større enn minimum og finjustere objektive fokus på tynn rød markør fluorescens lag. Velg et felt i feltet fluorescens klar av rusk og jevnt belagt med markør.
Merk: Oppsettet i denne protokollen bruker PrairieView 5.4 oppkjøpet tenkelig programvare. - Åpne funksjonen Uncaging Galvo kalibrering verktøy-kalibrering/justering menyen av programvaren. Gå gjennom brenne flekker opplæringen for romlig kalibreringen av andre galvanometer speilet par.
- I brenne flekker opplæringen, velge 405 nm laser, velge en laser stimulering makt på 400 og stimulering varighet 20 ms. dette bør gi liten (~ 1-5 µm diameter) hull i den røde markøren.
Merk: Innstillinger for eksempel ~ 2-4 mW og 1-10 ms brukes vanligvis, men innstillingene fastslås av utvalget. PA-Nic Foto-stimulering strøminnstillinger er sannsynlig å være langt lavere enn kraft som kreves under kalibrering å ablate synlig hull i røde merke lysbildet. Denne kalibreringen rutinen er nyttig for å finne photostimulation steder, men bør ikke brukes til å overvåke absolutt photostimulation volumer under fysiologiske responser. - Velg oppdateringen å stimulere og oppdatere bildet etter midten stedet brenne og flytte den runde røde indikatoren til spot plassering. Gjør dette for center stedet, høyre center stedet, lavere center stedet, og til slutt for et rutenett av ni steder (alle hjørner og kanter pluss midten av bildet).
Merk: Center, right og lavere korrigert spot steder bestemmer stimulering galvanometer spenning å definere sanne sentrum og X og Y skalering faktorer å matche stimulering speil paret å tenkelig speil paret. Programvaren vil skalere, og oppdaterer, alle etterfølgende MarkPoints eksperimenter utført på zoom-innstillinger som er forskjellig fra romlige kalibrering zoom.
- I brenne flekker opplæringen, velge 405 nm laser, velge en laser stimulering makt på 400 og stimulering varighet 20 ms. dette bør gi liten (~ 1-5 µm diameter) hull i den røde markøren.
- Teste kalibreringen ved å åpne vinduet MarkPoints og manuelt aktivere stimulering parameterne i definerte spot(s) i et nytt område av prøven. Kontroller at riktig, siste kalibrering filen lastes inn i MarkPoints -vinduet. Aktivere funksjonen MarkPoints/gruppe eller MarkPoints serien på en definert spot(s) eller bruke funksjonen Live/ablasjon høyre/venstre klikker musen på bildet under bor skanning for å bruke en test-puls og for å bekrefte riktig kalibrering.
Merk: Laser brenne spot skal nå være perfekt sentrert på indikatoren for MarkPoints . - Overvåke og registrere aktivering av laser puls kraften og tidsmessige varighet ved å trykke av stasjonen spenning inn programmet VoltageRecord (se trinn 1.1.4). Tilsvarende registrere plasseringen av hver stimulering spot med et skalert spenningen signalet fra tilbakemelding signaler fra par Foto-stimulering galvanometer speil.
2. forberedelse av Photoactivatable nikotin (PA-Nic)
- Hent en aliquot av lyofilisert photoactivatable stoffet fra.
Merk: Følgende protokollen er spesifikke for PA-Nic; Juster etter behov for andre photoactivatable stoffer. Selv om PA-Nic viser eksepsjonell stabilitet5, ta rimelige forholdsregler for å beskytte den mot eksponering for lys under forberedelse og/eller eksperimenter. Dette kan oppnås ved bare arbeider i dårlig lys; Det er ikke nødvendig å begrense til rød filtrert lys. -
Utføre lokal anvendelse av PA-nettverkskortet.
- Trekk glass brønnene med en åpning diameter på 20-40 µm med en programmerbar pipette avtrekker.
- Filtrere ~ 1 mL innspillingen løsning med filtere 0.22 µm. Resuspend en mengde PA-Nic i filtrert innspillingen løsning å gi en endelig konsentrasjon av 2 mM. For eksempel oppløse en 100 nmol lyofiliserte aliquot i 50 µL av filtrerte innspillingen løsning.
Merk: En foreslått innspillingen løsning komposisjon kan finnes i siste publikasjoner5,6 ansette PA-Nic photolysis. - Tilbake-fylle det lokale programmet pipette med 50 µL av 2 mM PA-nettverkskortet.
- Sikre lokalt program Pipetter i en pipette holder montert på en micromanipulator. Koble pipette holderen via riktig slangen til press utstøting systemet i stand til vedvarende lavt trykk anvendelse (1-2 psi).
- Bruker micromanipulator, manøvrere lokalt program pipette den ekstracellulære opptak og posisjon pipette spissen litt over hjernevev musen ligger ~ 50 μm fra cellen rundt. Se en tidligere rapport for detaljert protokollen musen hjernen stykke forberedelse og patch klemme opptak8.
- Kontrollere parameterne program ved kort pressmiddel (1-2 psi). Det bør være minimal å ingen forskyvning av cellen rundt. Hvis det forekommer betydelig bevegelse, flytte den lokale programmet pipette lenger unna (i laterale og/eller aksial retning) fra cellen rundt.
- Etter å oppnå stabil hele cellen oppdateringen klemme (detaljer som er inkludert i en tidligere publikasjon8), slå på lavtrykk (1-2 PSI) programmet bruker riktig manuell bryteren på press utstøting enheten. Mette i vevet rundt cellen med PA-Nic for 1-2 min før du fortsetter til neste trinn.
-
Utføre bad program (superfusion) av PA-Nic til hjernen stykke.
- Oppløse en mengde PA-Nic i et volum på innspillingen løsning passer for kontinuerlig resirkulering til en siste konsentrasjon av 100 μM. For eksempel oppløse en 1 μmol aliquot i 10 mL av innspillingen løsning ved hjelp av en standard 15 mL tube.
- Starte resirkulering av PA-Nic løsningen med en sats på 1,5-2 mL/min ved å åpne riktig flytkontrollen i perfusjon systemet. Resirkulering oppstår for varigheten av innspillingen. For å spare verdifull narkotika, redusere resirkulering volumet ved hjelp av rør med minimal indre diameter, og/eller kortere samlede rør brukes i perfusjon systemet.
Merk: Av disse tiltakene kan volumet badet resirkulering reduseres til 5 mL av PA-Nic løsning. PA-Nic løsninger ofte brukes for to påfølgende innspillingen dager i den samme uken hvis lagret beskyttes lys i 4 ° C. - Under resirkulering, kontinuerlig boble løsningen med carbogen (5% O2, 95% CO2) og vedlikeholde bad temperaturen på 32 ° C.
- Beholde hjernen sektoren i innspillingen løsning mens du arbeider med PA-Nic i dårlige lysforhold.
3. imaging Neurons med 2-fotonet laserskanning mikroskopi
- Utføre live visualisering av cellen.
- Identifisere/visualisere en mediale habenula (MHb) Nevron bruker lyset eller infrarød differensial forstyrrelser (IR/DIC) optikk og et videokamera og etablere et stabilt hele cellen oppdateringen klemme opptak. Se en forrige protokoll for detaljer om oppdateringen klemme innspillinger fra nerveceller i akutt forberedt musen hjernen skiver8.
- Etter etablering av høy-motstanden (> 1 GΩ) cellen tilknyttet konfigurasjon, men før innbrudd, bytte oppsett og programvare til laser skannemodus.
- Etter innbruddet bruker laserskanning for å bekrefte at en imaging fargestoff (utvannet til en siste konsentrasjon av 100-200 µM til en standard intracellulær pipette løsning beskrevet tidligere8) er passivt (spredning) fylle Nevron. Tillat fargestoff (f.eks Alexa Fluor 488 i grønne photomultiplier tube [avdrag]-kanal, avdrag 2; eller Alexa Fluor 568 594 i rød avdrag kanalen, avdrag 1) for å fylle mobilnettet seksjonene i minst 20-30 min før eksperimenter som krever visualisering av noen mobilnettet rom utenfor soma.
Merk: Distale rom (dendrittiske strukturer, spines, axons, etc.) krever 30-40 minutter å fylle helt25. - Bruke programvaren Live skanning funksjonen for å visualisere Nevron og subcellular kupé av interesse. Velg imaging parametere som tillater for nøyaktig live visualisering av neuronal funksjoner. Manipulere forskjellige innstillinger for å påvirke eller endre skjermen visualisering (kontrast), oppløsning, signal-å-bråk (S/N) forhold og bilde bilde oppkjøpet tid:
-
Look-opp-tabellen (LUT). Åpne vinduet LUT bruker det aktuelle ikonet på siden av noen bildevinduet. Når åpen, justere LUT gulvet (min) og taket (maks) innstilling av bestemt bilde kanalen å forbedre visualisering av signal kontrasten på skjermen. Lavere maksimumsverdien ~ 1000 (av 4096, 12-biters gjenkjenning), som vil hjelpe trekke ut den svakere signaler når du først søker etter celler, signalet og struktur.
Merk: Disse innstillingene påvirker bare viste signalet, ikke oppdaget/registrert verdiene. Menneskelige øyne er vanligvis bare ta ut kontrast til ~ 50 gråtoner26. -
Optisk zoom. Bruk programvarekontroller for å velge 1 X optisk zoom og bruk panorering for å finne ønsket område i vevet. Denne zoominnstillingen gir det største torget, skannet synsfelt og sender største spenninger/skanne vinkler, til galvanometer speil.
Merk: Standardkonfigurasjonen er for en 12 x 12 mm synsfelt inne Skannerhodet som betyr 12 mm delt objektive forstørrelse inne prøven. Derfor skannede en 60 x linsen gir bilder av 200 µm hver side på 1 x optisk zoom. Høyere optisk zoom verdier skanneområde mindre. 2 x optisk zoom er ofte nyttigst innstillingen for å visualisere hele neurons. 4 x kan være nyttig for å visualisere subcellular aspekter av neurons. -
Antall piksler. For å utfylle 1 x optisk zoom, Velg 1024 x 1024 piksler per linje med programvarekontroller. Angi antall piksler per linje i fanget og vises ikke miste detaljer mulig fra linsen. Bruk følgende praktiske bildepunktverdiene en 60 x / 1.0 numeriske blenderåpning (NA) mål: 1024 x 1024 for zoom 1, 512 x 512 for zoom 2 og 256 x 256 for zoom 4. Den slutt pikselstørrelsen (~0.17 µm; 12 mm/forstørrelse/zoom/piksler) bør være halvparten eller mindre, i laterale vedtaket definert av målet linsen.
Merk: Bildeoppløsningen defineres bare av laser bølgelengde og objektive NA (0,4 µm oppløsning fra to-fotonet spent [2PE] med 920 nm og et 1.0 NA mål)27. Kriteriene for full eksitasjon NA, som er oppført på objektivet, er at 1/e2 intensiteten av laser strålen diameter kamper (eller "fyller") inngang eleven (2 x rør objektivets brennvidde x NA / forstørrelse) av målet linsen. Rør linsen i systemet beskrevet her har en brennvidde på 180 mm. -
Pixel holdetiden . Bruk programvarekontroller for å velge 4 µs for pixel holdetiden, en nyttig standardverdi.
Merk: Endrer holdetiden pixel endres ikke bety signalet oppdaget; det påvirker bare intra-piksel snitt og endringene kan bli visualisert gjennom bildekvaliteten via S/N. Bilde piksel holdetiden er alltid et multiplum av 0,4 µs enheter, og større bor ganger 12-bit-begrenset intensiteten verdien av hver bilde piksel er gjennomsnittet av 0,4 µs prøvene. Siden S/N forholdet forbedrer som kvadratroten av antall eksempler per piksel holdetiden (4 µs er lik ti eksempler eller 3.16-fold forbedring i S/N), når forbedring i bildekvalitet avtagende avkastning for verdier som er mye større enn 12 µs. -
Rotasjon og områder av interesse (ROI). Angi bildet vinkelen til 0° rotasjon bruker programvarekontroller (ingen handling kanskje behøves, 0° rotasjon er standardinnstillingen for de fleste imaging-systemer). Hvis prøven er plassert i en "opp ned" retning, Velg 180° rotasjon å "vende" bildet.
Merk: Rotere bildet, i en gitt vinkel, kan gi en bedre passform for hele området rundt av en fylt celle. Rotasjonen kan også gi klarere grunnlag for å justere strukturelle endringer og for senere analyse. Velge et område av interesse i det skannede bildet på en gitt zoom (trinn 3.1.4.2) innstillingen beholder hvor innfødte pixel (trinn 3.1.4.3), men begrensningen i antall området og piksler kan dramatisk øke Rammehastigheten, gir forbedret midlertidig løsning signal endringer. -
Ramme snitt. Velg en start ramme gjennomsnittlig innstilling 2 rammer programvare kontroller.
Merk: Endelige bildekontrasten (S/N) er definert av totale fotoner samlet/funnet innenfor signal pikslene i bildet. Snitt av flere rammer kan forbedre S/N forholdet, forutsatt prøven flytter ikke eller er ikke bleket under bildebehandling. Relevante signaler forblir den samme verdien under ramme snitt mens støy i bildet reduseres av antall rammer gjennomsnitt. Små strukturer i fluorescens bilder krever ofte inter pixel gjennomsnitt, kombinere bildepunkt i det bildet (ofte kalt ROIs), og/eller ramme snitt. Ramme snitt øker skannetid på antall bilder som velger å gjennomsnitt.
-
Look-opp-tabellen (LUT). Åpne vinduet LUT bruker det aktuelle ikonet på siden av noen bildevinduet. Når åpen, justere LUT gulvet (min) og taket (maks) innstilling av bestemt bilde kanalen å forbedre visualisering av signal kontrasten på skjermen. Lavere maksimumsverdien ~ 1000 (av 4096, 12-biters gjenkjenning), som vil hjelpe trekke ut den svakere signaler når du først søker etter celler, signalet og struktur.
- Bruk Panorering, Skanne rotasjonog Optisk Zoom verktøy for å orientere prøven plasseringen under skanning. Hvis motor scenen manipulasjon er nødvendig for å plassere prøven, unngå stort skritt størrelser til X-, Y- og Z-aksen å hindre mål/kondensator kollisjoner, vibrasjoner eller eksponering av laserstrålen til reflekterende overflater.
- Samle Z stabel. Verktøyet Z-serien , Velg en start og stopp posisjon som inneholder cellen rundt. Velg en trinn størrelse (1 µm) og deretter fortløpende bilde Nevron i hver Z-fly som inneholder cellen.
Merk: Z-STACKS oppkjøpet vil variere mellom Nevron type og fylle fargestoff. Optimale parametere for Z-stack oppkjøp bør fastsettes uavhengig av parametere brukt for live bildebehandling. Z-stack oppkjøpet kan utføres før og/eller etter optopharmacology eksperimenter. Hvis mulig, utføre Z stabel oppkjøpet etter optopharmacology å unngå cellular skade forårsaket fra 2PLSM og å tillate for optimal fargestoff fylling av små mobilnettet avdelinger.
4. laser Flash Photolysis under elektrofysiologiske opptak
Merk: Bruke 405 nm eller 473 nm laser krefter ≥ 1 mW produserer Morelden i glass mål og kondensatoren linser. Dette genereres lys er direkte relatert til laser belysning kraften; utslipp i grønne og røde spectral windows og har begeistret statuser levetid i området ms. Denne bakgrunn stimulering gjenstand er sett i alle objektiver testet og vann-dipping målet objektiver fra alle, kjente produsenter av målet linser. Kondensatoren objektiver mye høyere Morelden enn målet linser. Denne "signal" motiverer bruk av mekaniske forskalinger for beskyttelse av sensitive galliumarsenid phosphide (GaAsP) avdrag katode under foto-stimulering hendelser. Bruke en vanligvis lukket mekanisk lukker (lukket når du ikke aktivt skanner) representerer den beste løsningen for beskyttelse av avkjølt GaAsP PMTs.
- Et timeglass-type photostimulation strålen geometri, fjerne noen fokus linser lys banen optikk som ville ellers smale/constrict laserstrålen som den kommer inn målet inngangen Eleven.
- Bruk MarkPointså velge innstillingen for enkelt spot.
Merk: Andre foto-stimulering innstillinger (flere steder, et rutenett av flekker, spiral skanning) er mulig innenfor MarkPoints. Enkelt sted er den enkleste. Eksperimentell mål og biologiske forskjellene kan nødvendiggjøre en annen innstilling. - Oppdatere bildet med alternativet Live skanne kort bilde og finne subcellular området av interesse. Regelmessig oppdatere bildet for å identifisere noen potensielle liten driver i fokus.
- Bruk programvare kontrollene for å øke den optiske zoomen (dvs. velge en høyere optisk zoom-innstilling enn den gjeldende), om nødvendig, å visualisere små strukturer (dvs. spines eller distale dendrites).
- Plass MarkPoints én stedet trådkorset umiddelbart tilstøtende (~0.5 μm) til cellemembranen. Ikke sted Foto-stimulering sted direkte over en mobilnettet funksjon, da dette kan føre til photodamage.
- Angi parametere for foto-stimulering bruke programvarekontroller i MarkPoints. Bruk Start retningslinjene som følger: 1-50 ms varighet, 1-4 mW laser makt og ≥1 prøve.
- Velg Kjør MarkPoints å starte MarkPoints protokollen og observere elektrofysiologi datainnsamling i sanntid.
- Gjenta trinn 4.2-4.7 flere ganger å evaluere konsistens og stabilitet, eller mangel derav, svar amplitude og kinetics.
Representative Results
Photolysis er stimulering, eksponering dose (intensitet og tid), eksponering plasseringen og strålen geometri viktige variabler. Systemet er beskrevet i denne artikkelen er dugelig av to forskjellige photostimulation bjelker, justerbar via flytte en linse inn/ut av photostimulation lys banen før strålen kommer inn i galvanometer-systemet. Uten dette objektivet, photostimulation strålen fyller inngangen eleven av 60 x / 1.0 NA vann-dipping [60 x WD] mål, produsere en nær-Diffraksjon-begrenset, sub-µm plass ved fokalplanet inne prøven. Dette er forbundet med photostimulation lys med en timeglass form, strekker seg over og under focal stedet symmetrisk med den optiske aksen. Med linsen inn banen, photostimulation laserlys er fokusert på inngangen elev av linsen og avslutter som en blyant-like bjelke. Denne stråle, som forventes å bli ~ 10 µm i diameter for en 60 x målsetting, plassert mellom/loddrett gjennom utvalget. I denne modusen blir lysintensiteten på gitt overalt i stimulering stedet ~ 1% av nær-Diffraksjon-begrenset liten flekk intensiteten. Dermed er høyere laser krefter vanligvis nødvendig ved ~ 10 µm spot stimulering. For alle eksperimenter i denne artikkelen, ble et timeglass-type photostimulation strålen brukt.
Leverte eksempel makt kan tegnes mot innstillingen inngangsspenning etter måling laser makt på prøven ved hjelp av en strømmåleren. Disse studiene bruker en 60 x WD målet med en arbeidsavstand 2 mm, men det er ikke senkes ned i vann for makt mål å unngå potensielle skader detektor elementet. Når målene listet NA > 0,95 måles i luften (uten nedsenkning væske), kan det være totalt interne refleksjon tap på linsen forsiden elementet på grunn av lavere indeksen (luft). I dette tilfellet for en mer nøyaktig utvalg ytelsesmåling (for å rette for total intern refleksjon tap), øke den målte strømmen av 1.0 NA objektiv (1.0/0,95)2 målt i luften. Figur 1a viser et typisk inndata/utdata-plott for 405 nm og 473 nm synlig lasere som er innlemmet i laser starte systemet i denne studien. Disse laser systemer er ideelle for foto-stimulering EKSPONERINGSKONTROLL dose av følgende årsaker: (1) de er pre kalibrert å gi direkte lineær effekt i forhold til Inngangsspenning (0-5 V), (2) de gir en stille utløser operasjon (med ingen laser utgang), og (3) de har rask, sub-ms intensitet pulsstyring varighet (0,1 ms respons). Når du bruker flekk Foto-stimulering med en laser/galvo, er rutinemessige kalibrering av MarkPoints en viktig oppgave. Figur 1b (venstre panel) viser et system er kalibrering (ønsket punkt å stimulere til Foto ikke fører nøyaktig stimulering av det punktet, som indikert av brannsår-plasseringen), med en tilbakevending til nøyaktig plassering av sted etter kalibrering ( Figur 1b, høyre panel).
PA-Nic er beskjedent fluorescerende (utslipp peak på ~ 510 nm), viser effektiv eksitasjon mellom 350-450 nm (1-fotonet eksitasjon) eller 700-900 nm (2-fotonet eksitasjon)5. For å visualisere PA-Nic under lokalt program, PA-Nic (1 mM) ble brukt i nærheten hjernevev etterfulgt av samtidige imaging (1) hjernen vev optisk delt overføring sammenhengen via Dodt kontrast og (2) slippes ut fluorescens fra eksitasjon (900 nm) av PA-Nic. PA-Nic 2PE fluorescens var lett synlig under press utstøting fra et lokalt program Pipetter (figur 2a). Nikotin og en monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-metyl kumarin, er de viktigste fotokjemisk produktene av PA-Nic photolysis reaksjon5. Bruker samme imaging innstillinger/parametere som ble brukt til PA-Nic imaging, ble vevet avbildet i enten den ene eller den andre av nikotin (1 mM) / 7-carboxymethylamino-4-metyl kumarin (1 mM). Ingen fluorescerende signal ble oppdaget (figur 2a, midterste og nedre paneler) viser spesifisitet av PA-Nic resultatene. Til slutt, PA-Nic ble brukt i hjernevevet og PA-Nic fluorescens utslipp ble avbildet (figur 2b). Dette bekrefter at PA-Nic finnes innenfor 100-200 µm av lokalt program pipette. Sammen bekrefte disse data at PA-Nic effektivt leveres til hjernen vev via lokale programmet.
Elektrofysiologi opptak med samtidige 2PLSM for visualisering av cellulære strukturer krever etterforsker til balanse betraktninger for begge komponentene av eksperimentet, og ofte en smale vinduet (~ 20 min) er tilgjengelig for gyldig eksempel datainnsamling fra en lappet celle. Uten betraktning mobilnettet visualisering, er det best å begynne innspillingen så snart som mulig etter innbrudd fordi innspillingen stabilitet tendens til å avta med tid. Men når imaging er et krav, må elektrofysiologiske hensyn tillate tilstrekkelig tid for fluorescens konsentrasjonen øker i små/eksterne strukturer. Dette er eksemplifisert ved å undersøke en dye konsentrasjon fylle kurve28, som er noen ganger nyttig å avlede når imaging en ny celle type. Figur 3 viser flere eksempel neurons avbildet som Z-stabler via 2PLSM og kollapset i en maksimale intensitet projeksjon for presentasjon formål. Figur 3a viser høy kvalitet bilder der neuronal morfologi synes å være komplett, støy er minimert og rusk forstyrrer ikke tolkning av mobilnettet morfologi. Figur 3b viser bilder av lavere kvalitet, en lavere signal-til-bakgrunn forhold og store rusk. Dette rusk vises ofte som sfærisk lommer av intens fluorescens, fremkommer fra utstøting imaging fargestoff fra oppdateringen pipette mens nærmer cellen. Spesielt inkludering av 100 µM PA-Nic i badekaret (når bad programmet) tendens til å redusere signal-til-bakgrunn forholdet og fører til sub-optimale bildekontrasten. Alexa Fluor 568 eller 594 er ofte ganske nyttig i lokalt program eksperimenter som en finder fargestoff eller en normalisering 2PE referanse/normalisering signal. En effektiv bølgelengde for to-fotonet magnetisering av disse fargestoffer er ~ 780 nm27, som tillater samtidig visualisering av PA-Nic og identifikasjon av mobilnettet avdelinger. Denne bølgelengde, men unngå ikke helt to-fotonet photolysis PA-Nic5. Alexa Fluor 488 er fordelaktig PA-Nic bad-program eksperimenter; Når opphisset med en egnet bølgelengde ≥900 nm, kan to-fotonet photolysis PA-Nic5 unngås samtidig opprettholde egnet visualisering mobilnettet rom.
Figur 4 viser eksempeldata for lokaliserte PA-Nic laser flash photolysis MHb nerveceller i hjernen skiver. Figur 4a (øvre panel) viser et eksempel på en "referanse", som er et skjermbilde av det siste 2PLSM bildet tatt før MarkPoints protokollen ble kjørt, kledde med foto-stimulering spot plasseringen. Figur 4a (lavere bilde paneler) viser en zoomet visning av foto-stimulering spot over mobilnettet morfologi. Den tilsvarende tid-korrelert elektrofysiologiske svaret på PA-Nic photolysis vises i den nedre paneler av figur 4a. Tidligere arbeid har vist at disse strømmer er følsomme for nAChR antagonister5. Figur 4b viser representant data fra forskjellige celler hvor enkelt spot photolysis ble utført på et intervall på enten 1 s eller 10 s. mens en 10 s intervall tillatt utvinning tid for den opprinnelige holder gjeldende, et kortere 1 s intervall førte til en gradvis økning i beholdning som protokollen fortsatte. Den økende gjeldende antyder at nikotin ikke har nok tid til å spre fra systemet med 1 Hz intervall29. Slike timelige respons analyser må være utført de novo på en ny celle type blir studert, som neuropharmacology av nAChRs kan variere mellom celletyper.
Figur 1: Photostimulation laser kalibrering. (en) Foto-stimulering laser utgangseffekt. Makt på prøven flyet (gjennom en 60 x / 1.0 NA vann-dipping mål) ble målt for 405 nm og 473 nm Foto-stimulering lasere på innstillingen angitt utdata. (b) Foto-stimulering laser kalibrering. Skjermen fange profilen viser romlige forholdet mellom tiltenkte Foto-stimulering stedet og den tilsvarende plasseringen der Foto-stimulering oppstod (brenne hull) før (venstre) og etter (til høyre) kjører kalibrering i MarkPoints. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: PA-Nic lokalt program. (en) oppdagelsen av PA-Nic fra en lokal applikasjon pipette. 1 mM PA-Nic, photolysis biprodukt eller nikotin ble oppløst i ACSF, lastes inn i et lokalt program pipette og utlevert på hjernevev under 2PLSM (900 nm eksitasjon) imaging med samme tenkelig innstillinger av hvert legemiddel. Laserskanning Dodt kontrast overføring bildet viser vev/pipette mens en GaAsP katode avdrag ble brukt til å fange fluorescens utslipp. (b) PA-Nic (1 mM) var parfyme i hjernevevet og fotografert via 2PLSM som (en) vise lateral spredning av PA-Nic med sin iboende fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: oppkjøp av 2-fotonet laserskanning mikroskopi bilder. (en) optimale 2PLSM Z-stabler. To eksempler på 2PLSM Z stabel maksimale intensitet anslag er vises MHb neurons med godt løst dendrites og lite til ingen forstyrrende rusk. (b) sub-optimale 2PLSM Z-stabler. To eksempler på 2PLSM Z stabel maksimale intensitet anslag vises for MHb neurons omgitt av rusk (fargestoff utvist fra pipette under cellen tilnærming). Slike bilder er vanskeligere å tolke enn bilder som de vises i (en). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Laser flash photolysis av PA-NIC (en) MarkPoints referanse bilder og innover strøm fremkalt av PA-Nic photolysis. For en MHb Nevron vises rå referanse bilder for MarkPoints Foto-stimulering forsøk på en enkelt (angitt) mobilnettet plassering. Merk at noen Foto-stimulering steder (høyre bildet i denne serien) dendrittiske strukturen er i fokus, men det soma og proksimale dendrite er ikke. Under hvert referanse bilde tegnes nikotin uncaging-utløste innover gjeldende. (b) mellom stimulans intervaller for PA-Nic photolysis. Exemplar opptak vises for MHb neurons der nikotin var gjentatte ganger uncaged på samme perisomatic sted med et intervall mellom stimulans 1 s eller 10 s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Valget av PA-Nic/levering metoden er det mest avgjørende skrittet i denne lokaliserte Foto-stimulering teknikken. To metoder, bad programmet og lokale perfusjon, tilbyr hver forskjellige fordeler og begrensninger. Valget er i stor grad påvirket av hvilket nAChR funksjonelle uttrykk i celle type interesse. Ofte er det best å bruke bad program når funksjonelle uttrykk nivået er høyt, som bad program gir en ensartet sonde konsentrasjon rundt innspilte cellen, tilrettelegge data tolkning. Bad applikasjonen også eliminerer behovet for en andre perfusjon pipette vev, gjør hele prosessen lettere. Men forbindelser bad anvendelse av dyre koster mer per forsøk.
Vanligvis omfatter feilsøking prøver å forstå hvorfor nei nAChR aktivisering er sett følgende flash photolysis. Når du arbeider med en celle som ikke har blitt tidligere studert med PA-Nic, etterforskeren skal utføre lokale puff-anvendelse av ACh eller nikotin fastslå om tilstrekkelig reseptorer er funksjonelt uttrykt5. For å bekrefte at systemet er i stand til å oppdage photolysis svar, bør kontroll eksperimenter gjøres i mediale habenula nerveceller som uttrykker store mengder reseptor30. I dette hjernen området er PA-Nic bad programmet mulig, som er å foretrekke for validering eksperimenter. Etter utfører disse validering eksperimenter bør man gå videre til en unstudied celle type. Hvis eksperimentelle systemet er validert og svar er fortsatt svært liten eller uoppdagbar, det kan være berettiget å øke konsentrasjonen av PA-Nic, øke glimtet intensiteten eller puls varighet, legge til en nAChR positiv allosteric modulator å forbedre nAChR aktivitet6, eller en kombinasjon av disse.
Noen ganger uncaging svar er for stor, med betydelige nAChR aktivisering resulterer i indirekte spenning gated Na+ kanal aktivisering og unclamped innover strøm på grunn av dårlig plass klemme. Disse gjenstander, som helt obskure nAChR innover strømninger og gjøre data tolkning umulig, kan elimineres ved inkludering av QX-314 (2 mM) i innspillingen pipette. De kan også bli eliminert ved å redusere konsentrasjonen av PA-Nic eller ved å redusere glimtet intensiteten eller puls varighet. Alle synlig lys bilde-stimulering eksperimenter, må varsomhet utøves når stimulering nettsteder for å unngå utilsiktet stimulering/photolysis over eller under ønsket fokalplanet. I tillegg og når aktuelt, laser makt må alltid være titreres reprodusere fysiologiske responser. Det er spesielt viktig å være klar over z photostimulation når du arbeider med bur ligander, som ligander som aktiveres over/under focal stedet kan fortsatt diffuse og samhandle med de biologiske system (dvs., reseptorer) under studien.
PA-Nic laser flash photolysis kanskje ikke passer for alle etterforskere, som flere begrensninger finnes. Først er den relativt høye kostnadene ved et passende oppsett. Når du arbeider med intakt hjernen skiver, uncaging nær liten diameter strukturer som dendrites krever et sofistikert visualisering system som 2-fotonet mikroskop. Bortsett fra de høye kostnadene ved en Ti:sapphire, tunable IR pulsed laser for resultater 2-fotonet mikroskopi, øker en dual-galvanometer system i stand til selvstendig posisjonering to laserstråler ytterligere systemet kostnadene. Totale systemet kostnadene kan reduseres ved hjelp av en hjemme-bygget system hvis etterforskeren har tilstrekkelig kompetanse og tid til å bygge, feilsøke og vedlikeholde et slikt system. En andre begrensning ofte innebærer lav nAChR funksjonelle uttrykk som kan være delvis motvirket av tiltak som nevnt ovenfor, men dette kan ikke garantere suksess. Vanligvis, hvis man ikke kan måle ligand-aktivert strøm etter puff-anvendelse av agonister, PA-Nic flash photolysis under spenning klemme kan ikke gi akseptable resultater. En tredje begrensning innebærer den iboende fluorescens av PA-Nic. PA-Nic absorberer ~ 405 nm lys og slipper ut i et lignende område som grønne fluorescerende protein (GFP) eller Alexa 4885. Når PA-Nic konsentrasjoner overskrider ~ 1 mM, kan fluorescens egenskapen gjøre det utfordrende å visualisere samtidig neuronal strukturer. For å løse dette, er det avgjørende å kunne enkelt kontrollere flyten av PA-Nic fra perfusjon pipette. Regelmessig ble PA-Nic flyten stoppet for å tillate fluorescerende molekyler å spre bort. Dette tillatt re-tenkelig av Nevron for å sjekke uncaging strålen spot posisjon. En fjerde potensielle begrensning å nevne innebærer bruk av 405 nm lys for photolysis. Kortere bølgelengder som 405 nm er mer utsatt for spredning i komplekse vev som en hjerne skive. Dermed på en gitt blits intensitet og varighet påvirkes uncaging svar amplitudes og forfall kinetics narkotikalovgivningen av dybden på uncaging fokus i stykket. Konklusjoner om biologiske aspekter av nAChRs ta dette viktig påminnelse.
Denne lokaliserte laser flash photolysis teknikken har nylig blitt brukt å avdekke nye detaljer om nAChR nevrobiologi. For eksempel forbedrer kronisk nikotin eksponering perisomatic og dendrittiske nAChR funksjon i mediale habenula neurons5. Det ble også brukt til å demonstrere, for første gang, at ventrale tegmental området glutamat neurons uttrykke funksjonell nAChRs i perisomatic og dendrittiske mobilnettet rom6. Det er mange mulige fremtidige bruker denne teknikken, og tilnærmingen kan brukes på andre viktige Nevron typer som er kjent for å uttrykke nAChRs, som kortikale pyramidale nevroner31 eller interneurons i hjernebarken32, striatum33 , og hippocampus19. Denne teknikken kan også kombineres med farmakologi og/eller nAChR gene redigering34 for å lokalisere bestemt reseptor undertypene til forskjellige neuronal avdelinger. Tilnærming kan lett tilpasses andre kumarin-bur forbindelser, inkludert men ikke begrenset til, de utviklet parallelt med PA-Nic5. Endelig bli PA-Nic flash photolysis kan en dag brukt i en våken/oppføre dyr for å studere nikotin er handlingen i romanen atferdsmessige farmakologi paradigmer.
Disclosures
D.L.W. fungerer som en betalt konsulent for Bruker Nano fluorescens mikroskopi.
Acknowledgments
Forfatterne takker laboratorium medlemmer av følgende nordvest viktigste etterforskerne: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy og Anis entreprenør. Dette arbeidet ble støttet av oss National Institutes of Health (NIH) (gir DA035942 og DA040626 til R.M.D.), PhRMA Foundation (fellesskap til M.C.A.) og HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
| Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
| (-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
| 7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
| 1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
| Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
| Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
| Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
| 6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
| QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
| Power Meter | ThorLabs | S120C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Solutions | |||
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Thiourea | Sigma | T8656 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components of 2-Photon Microscope | |||
| Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
| Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
| Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
| Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
| OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
| OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
| Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
| Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
| Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
| X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
| B&W CCD camera; Watec, 0.5 in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
| 595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
| 565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
| GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
| 525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
| High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |
References
- Zhang, C., et al. Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications. Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).
- Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).
- Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation. Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).
- Katz, B., Thesleff, S. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate. Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).
- Banala, S., et al. Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology. Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).
- Yan, Y., et al. Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission. Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).
- Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. α4α6β2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).
- Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Ren, J., et al. Habenula "cholinergic" neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes. Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).
- Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity. Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).
- Zhang, J., et al. Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression. Cell. 166 (3), 716-728 (2016).
- Chen, E., et al. Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).
- Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus. Neuroscience. 218, 1-11 (2012).
- Ting, J. T., Feng, G. Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).
- Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice. Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).
- Kolisnyk, B., et al. ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains. The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).
- Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).
- Denk, W. Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).
- Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons. The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).
- Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).
- Tochitsky, I., et al. Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).
- Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities. Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).
- Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons. Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).
- Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons. Elife. 6, (2017).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Science STKE. (219), pl5 (2004).
- Inoue, S., Spring, K. Video microscopy: The fundamentals. , 2 edn, Plenum Press. 163-186 (1997).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing. Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).
- Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses. Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).
- Shih, P. Y., et al. Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula. The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).
- Verhoog, M. B., et al. Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity. Nature Communications. 7, 12826 (2016).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Xiao, C., et al. Chronic nicotine selectively enhances α4β2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).
- Peng, C., et al. Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission. European Journal of Neuroscience. , (2018).
