Denne artikkelen presenterer en metode for å studere nikotinsyre acetylkolin reseptorer (nAChRs) i musen hjernen skiver av nikotin uncaging. Når kombinert med samtidige oppdateringen klemme opptak og 2-fotonet laserskanning mikroskopi, forbinder nikotin uncaging nikotinsyre reseptoren funksjonen med cellular morfologi, gir en dypere forståelse av cholinergic nevrobiologi.
Acetylcholin (ACh) fungerer gjennom reseptorer å modulere en rekke neuronal prosesser, men det har vært utfordrende koble ACh reseptor funksjon subcellular beliggenhet i celler der denne funksjonen blir utført. For å studere subcellular plasseringen av nikotinsyre ACh reseptorer (nAChRs) i native hjernevev, ble en optisk metoden utviklet for presis utgivelsen av nikotin diskret steder nær neuronal membraner under elektrofysiologiske innspillinger. Patch-festet nerveceller i hjernen skiver er fylt med fargestoff visualisere deres morfologi under 2-fotonet laser skanning mikroskopi og nikotin uncaging utføres med en lys flash ved å fokusere en 405 nm laserstråle nær én eller flere mobilnettet membraner. Mobilnettet gjeldende avvisninger er måles og tredimensjonale (3D) oppløsning av innspilte Nevron er laget for å tillate avstemming av nAChR svar med cellular morfologi. Denne metoden gir detaljert analyse av nAChR funksjonelle distribusjon i komplekse vev preparater, lovende å forbedre forståelsen av cholinergic neurotransmission.
Cholinergic signalering modulerer tallrike hjernen prosesser, inkludert attentional kontroll, volitional bevegelse og belønning1,2. Stoffer som forbedrer acetylkolin (ACh) overføring brukes til å behandle kognitiv svekkelse forbundet med Alzheimers sykdom, antyder en viktig rolle for cholinergic systemer i kognisjon3. En bedre forståelse av cholinergic reseptorer og krets i friske og syke tilstander kan føre til bedre terapeutiske metoder for flere nevrologiske sykdommer/lidelser.
Nikotinsyre ACh reseptorer (nAChRs) er en familie av ligand-gated ionekanaler som flux kasjoner svar på endogene ACh eller eksogene nikotin fra tobakksprodukter. Gitt det faktum at de var blant første nevrotransmitter receptors skal beskrives4, er nAChR farmakologi og beliggenhet i muskelfibre lett å forstå for muskel-type reseptorer. Derimot er relativt lite kjent om farmakologi og subcellular fordeling av innfødte nAChRs i hjernen. Dette gapet i kunnskap ble nylig behandlet ved å utvikle en roman kjemiske sonde som tillater romlig begrenset og rask aktivering av nAChRs i hjernevevet under mobil bildebehandling og elektrofysiologiske innspillingen5. Her, er de viktigste metodologiske trinnene involvert i denne tilnærmingen beskrevet, med det overordnede målet for å styrke evnen til å koble nAChR fungere med neuronal struktur.
Photoactivatable nikotin (PA-Nic, kjemisk navn: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] kumarin-4-yl] metyl-nikotin) kan photolyzed med ~ 405 nm laser blinker å gi effektivt nikotin5,6. Før uncaging, PA-Nic er stabil i løsningen og utstillinger ingen uheldige farmakologiske eller fotokjemisk funksjoner5. Etter photolysis, utgitt nikotin forutsigbart aktiverer nAChRs og uncaging biprodukter er farmakologisk inert5. En continuous-wave laser brukes som photolysis lyskilden med en utgangseffekt > 1 mW målt på prøven. Når lokalisert, målrettet Foto-stimulering er kombinert med muligheten til å finne mobilnettet membraner med 2-fotonet laserskanning mikroskopi (2PLSM), og de to viktigste fordelene med denne tilnærmingen er fullt ut realisert: photolysis fart og romlig presisjon.
I de fleste henseender er photolysis av PA-Nic overordnet andre metoder for å levere nAChR ligander til reseptorer i hjernen skiver. Disse inkluderer bad programmet7 og lokale stoffet levering via en puffer pipette8. Mens tidligere tilnærming tendens til å over-understreke de langsiktige effektene av brukte stoffet, kan sistnevnte tilnærming lide av variasjon i svaret kinetics mellom forsøk og i celler. Ingen av disse alternative metodene kan tilstrekkelig skille reseptor aktiviteter i mobilnettet steder fra samme Nevron. Optogenetically-aktivert versjon av ACh er brukt for undersøkelse av innfødte nAChRs9,10,11, men det har ikke vist seg nyttig for kartlegging subcellular nAChR steder. Videre, de fleste studier utnytte denne tilnærmingen har stolt på ChR2-uttrykke bakteriell kunstig kromosom transgene mus med unormal cholinergic overføring12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic photolysis er ikke bare optisk tilnærming for å studere cholinergic reseptorer. En bur carbachol ble brukt til å tilordne funksjonelt ACh reseptor aktiviteter i kulturperler celler18 og hjernen skiver19, men var ikke kommersielt tilgjengelig for komparative studier under utviklingen av PA-nettverkskortet. En selskapets bis (bipyridine)-nikotin komplekse (RuBi-nikotin) ble rapportert å ha nikotin uncaging20, men kommersielle preparater av RuBi-nikotin viste seg underlegne PA-Nic i en head-to-head sammenligning studere5. Det kan være nyttig å gjenta slike sammenlignende eksperimenter med ikke-kommersielle svært renset RuBi-nikotin, som sine synlig absorpsjon kan kompliment PA-nettverkskortets funksjoner for cholinergic studier. Til slutt, nAChRs har også blitt optisk manipulert ved hjelp av en kombinasjon av foto-valgbar ligander og genetisk endret reseptorer21. Denne tilnærmingen er utfyllende til PA-Nic photolysis i hjernevev, med evne til/kravet til genetisk målretting av den endrede nAChR sett både en fordel og en ulempe.
Flere viktige krav av denne tilnærmingen bør bemerkes. Først er en passende visualisering metode nødvendig for å nøyaktig finne neuronal membranen. Bildebehandling med konvensjonelle epi-fluorescens mikroskopi kan være tilstrekkelig når studere kulturperler celler, men for opptak fra nerveceller i hjernen skiver eller andre tykk vev preparater, 2PLSM eller AC confocal mikroskopi er et krav. Andre er en egnet metode nødvendig å plassere photolysis laserstrålen. Denne tilnærmingen utnytter en dual-galvanometer Skannerhodet med to uavhengige XY speil for raster skanning av tenkelig strålen, og punktet photoactivation med de uncaging laser stråle22,23,24. Andre, mer begrenset løsninger er mulig, for eksempel (1) en enkelt-galvanometer Skannerhodet at alternativt raster skanner tenkelig strålen og uncaging strålen, eller (2) bare beordrer uncaging strålen til midten av synsfeltet slik at cellen er brakt til denne posisjonen for flash photolysis. Tredje, et system er nødvendig for samtidige elektrofysiologiske opptak hvis man ønsker å samle fysiologiske signaler under eksperimenter. Kravene ovenfor kan bli møtt med en egnet all-optisk tenkelig teknikk, som nylig beskrevet5. Nedenfor en detaljert protokoll er inkludert som beskriver de viktigste trinnene av denne tilnærmingen.
Valget av PA-Nic/levering metoden er det mest avgjørende skrittet i denne lokaliserte Foto-stimulering teknikken. To metoder, bad programmet og lokale perfusjon, tilbyr hver forskjellige fordeler og begrensninger. Valget er i stor grad påvirket av hvilket nAChR funksjonelle uttrykk i celle type interesse. Ofte er det best å bruke bad program når funksjonelle uttrykk nivået er høyt, som bad program gir en ensartet sonde konsentrasjon rundt innspilte cellen, tilrettelegge data tolkning. Bad applikasjonen også eliminerer behovet for en andre perfusjon pipette vev, gjør hele prosessen lettere. Men forbindelser bad anvendelse av dyre koster mer per forsøk.
Vanligvis omfatter feilsøking prøver å forstå hvorfor nei nAChR aktivisering er sett følgende flash photolysis. Når du arbeider med en celle som ikke har blitt tidligere studert med PA-Nic, etterforskeren skal utføre lokale puff-anvendelse av ACh eller nikotin fastslå om tilstrekkelig reseptorer er funksjonelt uttrykt5. For å bekrefte at systemet er i stand til å oppdage photolysis svar, bør kontroll eksperimenter gjøres i mediale habenula nerveceller som uttrykker store mengder reseptor30. I dette hjernen området er PA-Nic bad programmet mulig, som er å foretrekke for validering eksperimenter. Etter utfører disse validering eksperimenter bør man gå videre til en unstudied celle type. Hvis eksperimentelle systemet er validert og svar er fortsatt svært liten eller uoppdagbar, det kan være berettiget å øke konsentrasjonen av PA-Nic, øke glimtet intensiteten eller puls varighet, legge til en nAChR positiv allosteric modulator å forbedre nAChR aktivitet6, eller en kombinasjon av disse.
Noen ganger uncaging svar er for stor, med betydelige nAChR aktivisering resulterer i indirekte spenning gated Na+ kanal aktivisering og unclamped innover strøm på grunn av dårlig plass klemme. Disse gjenstander, som helt obskure nAChR innover strømninger og gjøre data tolkning umulig, kan elimineres ved inkludering av QX-314 (2 mM) i innspillingen pipette. De kan også bli eliminert ved å redusere konsentrasjonen av PA-Nic eller ved å redusere glimtet intensiteten eller puls varighet. Alle synlig lys bilde-stimulering eksperimenter, må varsomhet utøves når stimulering nettsteder for å unngå utilsiktet stimulering/photolysis over eller under ønsket fokalplanet. I tillegg og når aktuelt, laser makt må alltid være titreres reprodusere fysiologiske responser. Det er spesielt viktig å være klar over z photostimulation når du arbeider med bur ligander, som ligander som aktiveres over/under focal stedet kan fortsatt diffuse og samhandle med de biologiske system (dvs., reseptorer) under studien.
PA-Nic laser flash photolysis kanskje ikke passer for alle etterforskere, som flere begrensninger finnes. Først er den relativt høye kostnadene ved et passende oppsett. Når du arbeider med intakt hjernen skiver, uncaging nær liten diameter strukturer som dendrites krever et sofistikert visualisering system som 2-fotonet mikroskop. Bortsett fra de høye kostnadene ved en Ti:sapphire, tunable IR pulsed laser for resultater 2-fotonet mikroskopi, øker en dual-galvanometer system i stand til selvstendig posisjonering to laserstråler ytterligere systemet kostnadene. Totale systemet kostnadene kan reduseres ved hjelp av en hjemme-bygget system hvis etterforskeren har tilstrekkelig kompetanse og tid til å bygge, feilsøke og vedlikeholde et slikt system. En andre begrensning ofte innebærer lav nAChR funksjonelle uttrykk som kan være delvis motvirket av tiltak som nevnt ovenfor, men dette kan ikke garantere suksess. Vanligvis, hvis man ikke kan måle ligand-aktivert strøm etter puff-anvendelse av agonister, PA-Nic flash photolysis under spenning klemme kan ikke gi akseptable resultater. En tredje begrensning innebærer den iboende fluorescens av PA-Nic. PA-Nic absorberer ~ 405 nm lys og slipper ut i et lignende område som grønne fluorescerende protein (GFP) eller Alexa 4885. Når PA-Nic konsentrasjoner overskrider ~ 1 mM, kan fluorescens egenskapen gjøre det utfordrende å visualisere samtidig neuronal strukturer. For å løse dette, er det avgjørende å kunne enkelt kontrollere flyten av PA-Nic fra perfusjon pipette. Regelmessig ble PA-Nic flyten stoppet for å tillate fluorescerende molekyler å spre bort. Dette tillatt re-tenkelig av Nevron for å sjekke uncaging strålen spot posisjon. En fjerde potensielle begrensning å nevne innebærer bruk av 405 nm lys for photolysis. Kortere bølgelengder som 405 nm er mer utsatt for spredning i komplekse vev som en hjerne skive. Dermed på en gitt blits intensitet og varighet påvirkes uncaging svar amplitudes og forfall kinetics narkotikalovgivningen av dybden på uncaging fokus i stykket. Konklusjoner om biologiske aspekter av nAChRs ta dette viktig påminnelse.
Denne lokaliserte laser flash photolysis teknikken har nylig blitt brukt å avdekke nye detaljer om nAChR nevrobiologi. For eksempel forbedrer kronisk nikotin eksponering perisomatic og dendrittiske nAChR funksjon i mediale habenula neurons5. Det ble også brukt til å demonstrere, for første gang, at ventrale tegmental området glutamat neurons uttrykke funksjonell nAChRs i perisomatic og dendrittiske mobilnettet rom6. Det er mange mulige fremtidige bruker denne teknikken, og tilnærmingen kan brukes på andre viktige Nevron typer som er kjent for å uttrykke nAChRs, som kortikale pyramidale nevroner31 eller interneurons i hjernebarken32, striatum33 , og hippocampus19. Denne teknikken kan også kombineres med farmakologi og/eller nAChR gene redigering34 for å lokalisere bestemt reseptor undertypene til forskjellige neuronal avdelinger. Tilnærming kan lett tilpasses andre kumarin-bur forbindelser, inkludert men ikke begrenset til, de utviklet parallelt med PA-Nic5. Endelig bli PA-Nic flash photolysis kan en dag brukt i en våken/oppføre dyr for å studere nikotin er handlingen i romanen atferdsmessige farmakologi paradigmer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker laboratorium medlemmer av følgende nordvest viktigste etterforskerne: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy og Anis entreprenør. Dette arbeidet ble støttet av oss National Institutes of Health (NIH) (gir DA035942 og DA040626 til R.M.D.), PhRMA Foundation (fellesskap til M.C.A.) og HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |