Denna artikel presenterar en metod för att studera nikotinacetylkolinreceptorer (nAChRs) i mus hjärnan skivor av nikotin uncaging. När tillsammans med samtidiga patch clamp inspelning och 2-foton mikroskopi för laserscanning, ansluter nikotin uncaging nikotinhaltiga receptorn funktion med cellulära morfologi, att ge en djupare förståelse av kolinerga neurobiologi.
Acetylkolin (ACh) verkar via receptorer att modulera olika neuronala processer, men det har svårt för att länka ACh receptor funktion med subcellulär läge inom celler där denna funktion utförs. För att studera subcellulär placeringen av nikotinreceptorer ACh (nAChRs) i native hjärnvävnad, utvecklades en optisk metod för exakt release av nikotin på diskreta platser nära neuronala membran under elektrofysiologiska inspelningar. Patch-fastklämd nervceller i hjärnan skivor är fyllda med färga för att visualisera deras morfologi under 2-photon laser scanning mikroskopi och nikotin uncaging utförs med en ljus blixt genom att fokusera en 405 nm laser beam nära en eller flera cellulära membran. Cellulära aktuella omläggningar mäts, och en högupplöst tredimensionella (3D) bild av inspelade neuron är gjord för att möjliggöra avstämning av nAChR svaren med cellulära morfologi. Denna metod möjliggör detaljerad analys av nAChR funktionell distribution i komplexa vävnad preparat, lovar att förbättra förståelsen av kolinerg neurotransmission.
Kolinerg signalering modulerar många processer i hjärnan, inklusive uppmärksamhet kontroll, viljande rörelse och belöning1,2. Läkemedel som ökar acetylkolin (ACh) överföring används för behandling av kognitiv svikt vid Alzheimers sjukdom, vilket innebär en viktig roll för kolinerga system i kognition3. En förbättrad förståelse av kolinerga receptorer och kretsar i friska och sjuka kan leda till bättre behandlingsmetoder för flera neurologiska sjukdomar/störningar.
ACh nikotinreceptorer (nAChRs) är en familj av ligandreglerade jonkanaler som flux katjoner som svar på endogena ACh eller exogena nikotin från tobaksvaror. Tanke på att de var bland de allra första signalsubstansen receptorerna att vara beskrivna4, är nAChR farmakologi och läge i muskelfibrer väl förstått för muskel-typ receptorer. Däremot är jämförelsevis lite känt om farmakologi och subcellulär distribution av infödda nAChRs i hjärnan. Denna lucka i kunskap togs nyligen upp genom att utveckla en ny kemiska sond som möjliggör rumsligt inskränkt och snabb aktivering av nAChRs i hjärnvävnad under cellular imaging och elektrofysiologiska inspelning5. Här beskrivs de viktigaste metodologiska stegen som är inblandade i detta tillvägagångssätt, med det övergripande målet att förbättra förmågan att ansluta nAChR funktion med neuronala struktur.
Photoactivatable nikotin (PA-Nic, kemiskt namn: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] kumarin-4-yl] metyl-nikotin) kan vara photolyzed med ~ 405 nm laser blinkar för att effektivt frigöra nikotin5,6. Före uncaging, PA-Nic är stabil i lösning och uppvisar inga ogynnsamma farmakologisk eller fotokemisk funktioner5. Efter fotolys, släppt nikotin aktiverar förutsägbart nAChRs och uncaging biprodukter är farmakologiskt inerta5. En continuous-wave laser används som fotolys ljuskälla med en uteffekt > 1 mW mätt vid provet. När lokaliserad, riktade foto-stimulering är kombinerat med möjligheten att lokalisera cellulära membran med 2-foton mikroskopi (2PLSM) för laserscanning, och de två viktigaste fördelarna med detta tillvägagångssätt är fullt insåg: fotolys hastighet och rumsliga precision.
I de flesta avseenden är fotolys av PA-Nic överlägsen andra metoder för att leverera nAChR ligander till receptorer i hjärnan skivor. Sådana metoder inkluderar bad ansökan7 och lokal drog leverans via en puffer pipett8. Medan det tidigare tillvägagångssättet tenderar att överbetona de långsiktiga effekterna av tillämpad drogen, kan den senare metoden lida av variabilitet i svar kinetik mellan prövningar och mellan celler. Ingen av dessa alternativa metoder kan adekvat skilja receptor aktiviteter i olika cellulära platser från samma neuron. Optogenetically-aktiverat frisläppandet av ACh har använts för utredning av inhemska nAChRs9,10,11, men det har inte visat sig användbar för mappning subcellulär nAChR platser. Dessutom de flesta studier utnyttjar detta tillvägagångssätt har förlitat sig på en ChR2-uttryckande bakteriella artificiella kromosom transgena möss med onormal kolinerga transmissionen12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolys är inte bara optisk metod för att studera kolinerga receptorer. En bur carbachol användes till funktionellt karta ACh receptor aktiviteter i odlade celler18 och hjärnan skivor19, men var inte kommersiellt tillgängliga för jämförande studier under utvecklingen av PA-Nic. En rutenium bis (bipyridine)-nikotin komplexa (RuBi-nikotin) rapporterades för nikotin uncaging20, men reklamfilmförberedelser RuBi-nikotin visade sämre än PA-Nic i en head-to-head jämförelse studera5. Det kan vara lämpligt att upprepa sådana jämförande experiment med icke-kommersiella, höggradigt renat RuBi-nikotin, som dess synliga absorption kan komplimang PA-nätverkskortets funktioner för kolinerga studier. Slutligen manipulerats nAChRs också optiskt med en kombination av foto-omkopplingsbar ligander och genetiskt modifierade receptorer21. Detta tillvägagångssätt är ett komplement till PA-Nic Fotolys i hjärnvävnad, med förmåga/kravet av genetiska inriktning av den modifierade nAChR ses som både en fördel och en nackdel.
Flera viktiga krav av detta tillvägagångssätt bör noteras. Först behövs en lämplig visualisering metod att exakt lokalisera den neuronala membranen. Imaging med konventionella påljusfluorescens mikroskopi kan räcka när man studerar odlade celler, men för inspelning från nervceller i hjärnan skivor eller andra tjock vävnad preparat, 2PLSM eller konfokalmikroskopi är ett krav. För det andra behövs en lämplig metod att placera fotolys laserstrålen. Denna strategi använder tredjeparts en dual-galvanometer scan huvud med två oberoende x-y speglar för raster skanning av imaging beam och punkt ljusaktivering använder uncaging laser beam22,23,24. Andra, mer begränsade lösningar är möjliga, såsom (1) ett enda-galvanometer scan huvud att alternativt raster File imaging balken och uncaging balken, eller (2) helt enkelt rikta uncaging strålen till mitten av synfältet så att cellen förs till Denna position för flash fotolys. För det tredje krävs ett system för samtidiga elektrofysiologiska inspelning om man vill samla in fysiologiska signaler under experiment. Ovanstående krav kan uppfyllas med en lämplig all-optisk imaging teknik, som nyligen beskriven5. Nedan, ett detaljerat protokoll ingår som beskriver de viktigaste stegen i denna strategi.
Valet av PA-Nic ansökan/leverans metod är det mest kritiska steget i denna lokaliserade foto-stimulering teknik. Två metoder, bad ansökan och lokala perfusion, erbjuder varje olika fördelar och begränsningar. Valet påverkas till stor del av nivån nAChR funktionella uttryck i celltyp av intresse. Det är ofta bättre att använda bad ansökan när funktionella uttryck är höga, som bad ansökan gör för en enhetlig sonden koncentration kring inspelade cellen, att underlätta tolkning av data. Bad ansökan eliminerar också behovet av en andra perfusion pipett i vävnaden, vilket gör hela processen enklare. Dock föreningar bad tillämpningen av dyra kostar mer per experiment.
Felsökning innebär vanligen, försöker förstå varför ingen nAChR aktivering är sett följande flash fotolys. När du arbetar med en celltyp som inte har tidigare studerats med PA-Nic, utredaren bör utföra lokala puff-tillämpningen av ACh eller nikotin att avgöra huruvida tillräcklig receptorer är funktionellt uttryckt5. För att verifiera att systemet är kan upptäcka fotolys svaren, bör kontroll experiment göras i mediala habenula nervceller som uttrycker stora mängder receptor30. I detta hjärnområde är PA-Nic bad program möjligt, vilket är att föredra för validering experiment. Endast efter att ha utfört dessa validering experiment bör man gå vidare till ett outforskat celltyp. Om det experimentella systemet har validerats och svaren förblir mycket små eller omätbara, det kan vara befogat att öka koncentrationen av PA-Nic, öka blixtintensitet eller pulslängd, lägga till en nAChR positiv Alloster modulator att förbättra nAChR verksamhet6, eller någon kombination av dessa.
Ibland, uncaging svaren är alltför stora, med betydande nAChR aktivering resulterar i indirekta spänning gated Na+ kanal aktivering och unclamped inåtgående strömmar på grund av dålig utrymme klämman. Dessa artefakter, som helt skymmer nAChR inåtgående strömmar och omöjliggöra tolkning av data, kan elimineras genom införandet av QX-314 (2 mM) i inspelning pipetten. De kan också elimineras genom att minska koncentrationen av PA-Nic eller att minska blixtintensitet eller pulslängd. I alla synliga ljus foto-stimulering experiment, måste försiktighet iakttas när man väljer stimulering platser att undvika oavsiktlig stimulering/fotolys ovanför eller under önskad fokalplanet. Dessutom och när tillämpligt, laser makt måste alltid titreras för att reproducera fysiologiska reaktioner. Det är särskilt viktigt att vara medveten om z-photostimulation när du arbetar med bur ligander, som ligander som aktiveras ovanför/nedanför fokal plats kan fortfarande diffusa och interagera med det biologiska systemet (dvs., -receptorer) under studien.
PA-Nic laser flash fotolys kanske inte lämpliga för alla utredare, som flera begränsningar finns. Först är de relativt höga kostnaderna för en lämplig set-up. När du arbetar med intakt hjärnan skivor, uncaging nära liten diameter strukturer som dendriter kräver en sofistikerad visualiseringssystem såsom 2-photon Mikroskop. Bortsett från de höga kostnaderna för en Ti:sapphire, avstämbara IR pulsad laser för presterande 2-foton mikroskopi, ökar ett dual-galvanometer system kan självständigt positionering två laserstrålar ytterligare system kostnaden. Systemets totala kostnader kan minskas genom att använda en hembyggda system om Utredaren har tillräcklig kompetens och tid att konstruera, felsöka och underhålla ett sådant system. En andra begränsning ofta innebär låg nAChR funktionella uttryck, som kan mildras delvis genom att vidta åtgärder som nämnts ovan, men detta kan inte garantera framgång. Vanligtvis, om man inte kan mäta ligand-aktiverat strömmar efter puff-applicering av agonister, PA-Nic flash fotolys under spänningen klämman kan inte ge acceptabla resultat. En tredje begränsning innebär den inneboende fluorescens av PA-Nic. PA-Nic absorberar ~ 405 nm ljus och avger i ett liknande utbud som grönt fluorescerande protein (GFP) eller Alexa 4885. När PA-Nic koncentrationerna överskrider ~ 1 mM, kan detta fluorescens boende göra det utmanande att samtidigt visualisera neuronala strukturer. För att minska detta, är det viktigt att kunna enkelt styra flödet av PA-Nic från perfusion pipetten. Regelbundet, stoppades PA-Nic flödet för att tillåta fluorescerande molekyler för att diffundera bort. Detta tillåtet ny avbildning av neuron för att kontrollera avistapositionen i uncaging balken. En fjärde potentiella begränsning att nämna innebär användning av 405 nm ljus för fotolys. Kortare våglängder såsom 405 nm är mer benägna att spridningen i komplexa vävnad såsom ett hjärnan segment. Således, vid en given blixt intensitet och varaktighet, uncaging svar amplituder och decay kinetik differentially påverkas av djupet av uncaging fokus inom segmentet. Slutsatser om biologiska aspekter av nAChRs bör beakta denna viktig varning.
Denna lokaliserade laser flash fotolys teknik har använts nyligen att avslöja nya detaljer om nAChR neurobiologi. Exempelvis förbättrar kronisk nikotin exponering perisomatic och dendritiska nAChR funktion i mediala habenula nervceller5. Det användes också för att visa, för första gången att ventral tegmental area glutamat nervceller uttrycka funktionella nAChRs i sin perisomatic och dendritiska cellulära fack6. Det finns många potentiella framtida använder denna teknik, och metoden skulle kunna tillämpas på andra typer av nyckel neuron som är kända för att uttryckliga nAChRs, såsom kortikala pyramidala nervceller31 eller interneuroner i hjärnbarken32, striatum33 , och hippocampus19. Denna teknik kan också kombineras med farmakologi eller nAChR gen redigering34 för att lokalisera specifik receptor undertyper till olika neuronala fack. Metoden kan lätt anpassas till andra kumarin-bur föreningar, inklusive men inte begränsat till, de utvecklas parallellt med PA-Nic5. Slutligen, PA-Nic flash fotolys kan en dag användas i ett vaket/beter sig djur för att studera nikotins action i romanen beteendemässiga farmakologi paradigm.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar laboratorium medlemmar av de följande nordvästra Forskargruppsledare: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy och Anis entreprenör. Detta arbete stöddes av oss National Institutes of Health (NIH) (bidrag DA035942 och DA040626 till R.M.D.), PhRMA Foundation (gemenskap till M.C.A.) och HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |