Denne artikel præsenterer en metode til at studere nicotinsyre acetylcholin receptorer (nAChRs) i mus hjernen skiver af nikotin uncaging. Når kombineret med samtidige patch klemme optagelse og 2-foton laser scanning mikroskopi, forbinder nikotin uncaging nicotinsyre receptoren funktion med cellulære morfologi, giver en dybere forståelse af kolinerge neurobiologi.
Acetylkolin (ACh) fungerer via receptorer til at graduere en bred vifte af neuronal processer, men det har udfordrende for at sammenkæde ACh receptor funktion med subcellulært placering i celler hvor denne funktion er udført. For at studere subcellulært placeringen af nicotinsyre ACh receptorer (nAChRs) i native hjernevæv, blev en optisk metode udviklet til præcise frigivelse af nikotin diskrete steder nær neuronal membraner under elektrofysiologiske optagelser. Patch-fastspændt neuroner i hjernen skiver er fyldt med farvestof til at visualisere deres morfologi i løbet af 2-foton laser scanning mikroskopi, og nikotin uncaging er udført med en lys flash ved at fokusere en 405 nm laserstråle i nærheden af en eller flere cellemembraner. Cellulære nuværende omlaegninger måles, og en høj opløsning tredimensional (3D) billede af indspillede neuron er lavet til at tillade afstemning af nAChR svar med cellulære morfologi. Denne metode giver mulighed for detaljeret analyse af nAChR funktionelle fordeling i komplekse væv præparater, lovede at øge forståelsen af kolinerge neurotransmission.
Kolinerge signalering modulerer talrige hjernen processer, herunder attentional kontrol, viljesmæssige bevægelse og belønning1,2. Lægemidler, der forbedrer acetylkolin (ACh) transmission bruges til at behandle kognitiv svækkelse forbundet med Alzheimers sygdom, hvilket indebærer en vigtig rolle for kolinerge systemer i kognition3. En bedre forståelse af kolinerge receptorer og kredsløb i raske og syge stater kan føre til bedre terapeutiske tilgange til flere neurologiske sygdomme/lidelser.
Nicotinsyre ACh receptorer (nAChRs) er en familie af ligand-gated Ionkanaler, der flux kationer reaktion på endogene ACh eller eksogen nikotin fra tobaksvarer. I betragtning af at de var blandt de allerførste neurotransmitter receptorer er beskrevet4, er nAChR farmakologi og placering i muskelfibre velforståede for muskel-type receptorer. Derimod er relativt lidt kendt om farmakologi og subcellulært distribution af indfødte nAChRs i hjernen. Denne forskel i viden var for nylig rettet ved at udvikle en roman kemiske sonde, der giver mulighed for rumligt begrænset og hurtig aktivering af nAChRs i hjernevæv under cellulære imaging og elektrofysiologiske optagelse5. Her, er de vigtige metodologiske trin i denne fremgangsmåde beskrevet, med det overordnede mål om at forbedre evnen til at forbinde nAChR funktion med neuronal struktur.
Photoactivatable nikotin (PA-Nic, kemisk navn: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] cumarin-4-yl] methyl-nikotin) kan være photolyzed med ~ 405 nm laser blinker effektivt frigive nikotin5,6. Før uncaging, PA-Nic er stabil i løsning og udviser ingen uheldige farmakologiske eller fotokemisk funktioner5. Efter fotolyse, frigivne nikotin forudsigeligt aktiverer nAChRs og den uncaging biprodukter er farmakologisk inaktive5. En kontinuerte laser bruges som fotolyse lyskilde med en udgangseffekt > 1 mW målt på prøven. Når lokaliseret, målrettede foto-stimulation er kombineret med evnen til at finde cellemembranerne med 2-foton laser scanning mikroskopi (2PLSM), og de to vigtigste fordele ved denne tilgang er fuldt realiseret: fotolyse hastighed og rumlige præcision.
I de fleste henseender er fotolyse af PA-Nic overlegen i forhold til andre metoder til at levere nAChR ligander til receptorer i hjernen skiver. Sådanne strategier omfatter bad ansøgning7 og lokale stof levering via en kuglefisk pipette8. Der henviser til, at den tidligere strategi har tendens til at over understrege de langsigtede virkninger af det anvendte stof, kan den sidstnævnte tilgang lider af variation i respons kinetik mellem forsøg og på tværs af celler. Ingen af disse alternative tilgange kan tilstrækkeligt skelne receptor aktiviteter i forskellige cellulære steder fra den samme neuron. Optogenetically-aktiveret frigivelse af ACh har været brugt i undersøgelsen af indfødte nAChRs9,10,11, men det har ikke vist sig nyttigt for kortlægning subcellulært nAChR placeringer. Endvidere, de fleste undersøgelser udnytter denne tilgang har påberåbt sig en ChR2-udtrykker bakteriel kunstige kromosom Transgene mus med unormale kolinerge transmission12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolyse er ikke kun optisk tilgang til at studere kolinerge receptorer. En bur carbachol blev brugt til funktionelt kort ACh receptor aktiviteter i kulturperler celler18 og hjernen skiver19, men var ikke kommercielt tilgængelige for sammenlignende undersøgelser under udviklingen af PA-Nic. En ruthenium bis (bipyridine)-nikotin komplekse (RuBi-nikotin) blev rapporteret til at gøre det muligt for nikotin uncaging20, men kommercielle præparater af RuBi-nikotin viste sig ringere end PA-Nic i et head-to-head sammenligning studere5. Det kan være nyttigt at gentage sådanne sammenlignende forsøg med ikke-kommercielle, meget renset RuBi-nikotin, som dens synlige absorption kunne komplimentere PA-NICs funktioner til kolinerge undersøgelser. Endelig har nAChRs også været optisk manipuleres ved hjælp af en kombination af foto-omstillelig ligander og genetisk modificerede receptorer21. Denne tilgang er et supplement til PA-Nic fotolyse i hjernevæv med evnen/kravet om genetiske målretning af den ændrede nAChR opfattes som både en fordel og en ulempe.
Flere vigtige krav af denne fremgangsmåde skal bemærkes. Først, en passende Visualisering metode er nødvendigt til præcist lokalisere neuronal membranen. Billedbehandling med konventionelle epi-Fluorescens mikroskopi kan være tilstrækkelig, når man studerer kulturperler celler, men for optagelse fra neuroner i hjernen skiver eller andre præparater, tykt væv, 2PLSM eller Konfokal mikroskopi er et krav. For det andet en egnet metode er nødvendig for at placere fotolyse laserstråle. Denne metode udnytter en dual-Drejespoleinstrument scan hoved med to uafhængige x-y spejle til raster scanning af imaging stråle og punkt photoactivation ved hjælp af den uncaging laser stråle22,23,24. Andre, mere begrænset løsninger er mulige, som (1) en enkelt-Drejespoleinstrument scan hoved at alternativt raster scanner imaging strålen og uncaging bom, eller (2) blot lede uncaging bjælken til midten af synsfeltet, således, at cellen er bragt til denne holdning til flash fotolyse. For det tredje, et system er nødvendig for samtidige elektrofysiologiske optagelse, hvis man ønsker at indsamle fysiologiske signaler under eksperimenter. Ovenstående krav kan opfyldes med en egnet all-optiske billeddannelse teknik, som for nylig beskrevet5. Nedenfor, en detaljeret protokol er inkluderet, der beskriver de vigtigste trin i denne fremgangsmåde.
Valget af PA-Nic anvendelse/levering metode er den mest afgørende skridt i denne teknik, lokaliserede foto-stimulation. De to metoder, bad ansøgning og lokale perfusion, tilbyder hver forskellige fordele og begrænsninger. Valget er i vid udstrækning påvirket af niveauet nAChR funktionelle udtryk i celletype af interesse. Det er ofte at foretrække at bruge bad program når funktionelle udtryk niveauer er høje, som bad ansøgningen giver mulighed for en ensartet sonde koncentration omkring de indspillede celle, lette data fortolkning. Bad ansøgning også eliminerer behovet for en anden perfusion pipette i vævet, hvilket gør hele processen lettere. Dog forbindelser bad anvendelse af dyre koster mere pr. eksperiment.
Almindeligt, indebærer fejlfinding forsøger at forstå, hvorfor ikke nAChR aktivisering er set følgende flash fotolyse. Når du arbejder med en celletype, der ikke er tidligere blevet undersøgt med PA-Nic, investigator skal udføre lokale puff-anvendelse af ACh eller nikotin til at afgøre, om tilstrækkelig receptorer er funktionelt udtrykt5. For at validere, at systemet er i stand til at opdage fotolyse svar, foretages kontrol eksperimenter i mediale habenula neuroner, der udtrykker store mængder af receptor30. I denne hjerne område er PA-Nic bad ansøgning mulige, hvilket er at foretrække for validering eksperimenter. Kun efter at have udført disse validering eksperimenter bør man gå videre til en unstudied celletype. Hvis den eksperimentelle system er blevet valideret og svar er fortsat meget små eller ikke målbart, det kan være berettiget til at øge koncentrationen af PA-Nic, øge flash intensitet eller impulslængde, tilføje en nAChR positive allosteriske modulator til at forbedre nAChR aktivitet6, eller en kombination af disse.
Lejlighedsvis, uncaging svar er for stor, med betydelige nAChR aktivering resulterer i indirekte spænding gated Na+ kanal aktivering og unclamped indad strømninger på grund af dårlig plads klemme. Disse artefakter, som helt obskure nAChR indad strømninger og umuliggør data fortolkning, kan elimineres ved optagelse af QX-314 (2 mM) i optagelse pipette. De kan også fjernes ved at reducere koncentrationen af PA-Nic eller ved at reducere flash intensitet eller impulslængde. I alle synlige lys foto-stimulation eksperimenter, skal der udvises forsigtighed til når du vælger stimulation websteder for at undgå utilsigtede stimulation/fotolyse over eller under den ønskede fokalplan. Derudover og da gældende, laser power skal altid titreres til at reproducere fysiologiske reaktioner. Det er især vigtigt at være opmærksom på z-aksen photostimulation, når du arbejder med bur ligander, som ligander, der aktiveres over/under den fokale sted kan stadig diffus og interagere med det biologiske system (dvs., receptorer) under undersøgelsen.
PA-Nic laser flash fotolyse kan ikke være egnet til alle efterforskere, som flere begrænsninger findes. Først er den relativt høje pris på et passende set-up. Når du arbejder med intakt hjernen skiver, uncaging nær lille diameter strukturer som dendritter kræver et avanceret visualisering system som en 2-foton mikroskop. Bortset fra den høje pris på en Ti:sapphire, afstemmelige IR pulserende laser til højtydende 2-foton mikroskopi, øger en dual-Drejespoleinstrument system i stand til uafhængigt positionering to laserstråler yderligere system omkostninger. Samlede system omkostninger kan reduceres ved hjælp af et hjem-bygget system hvis investigator har tilstrækkelig ekspertise og tid til at konstruere, fejlfinding og vedligeholde et sådant system. En anden begrænsning ofte indebærer lav nAChR funktionelle udtryk, som kan være delvis mindsket ved at træffe foranstaltninger som ovenfor nævnt, men dette kan ikke garantere succes. Typisk, hvis man ikke kan måle ligand-aktiveret strømme efter puff-anvendelse af agonister, kan PA-Nic flash fotolyse under spænding klemme ikke give acceptable resultater. En tredje begrænsning indebærer den iboende fluorescens af PA-Nic. PA-Nic absorberer ~ 405 nm lys og udsender i et lignende udvalg som grøn fluorescerende proteiner (NGL) eller Alexa 4885. Når PA-Nic koncentrationerne overstiger ~ 1 mM, kan denne fluorescens egenskab gøre det udfordrende at samtidig visualisere neuronal strukturer. For at afbøde dette, er det kritisk at kunne nemt styre strømmen af PA-Nic fra perfusion pipette. Med jævne mellemrum, blev PA-Nic flow stoppet for at tillade fluorescerende molekyler til diffuse væk. Dette er tilladt re-tænkelig af neuron til at kontrollere den spot placering af uncaging bjælken. En fjerde potentielle begrænsning at nævne indebærer brug af 405 nm lys for fotolyse. Kortere bølgelængder som 405 nm er mere tilbøjelige til spredning i komplekse væv som en hjerne skive. Således, på en given flash intensitet og varighed, uncaging svar amplituder og decay kinetik kan varierende påvirkes af dybden af uncaging fokus i Skive. Konklusioner om biologiske aspekter af nAChRs bør tage denne vigtige forbehold i betragtning.
Denne lokaliserede laser flash fotolyse teknik er for nylig blevet brugt til at afdække nye detaljer om nAChR neurobiologi. For eksempel, forbedrer kronisk nikotin eksponering perisomatic og dendritiske nAChR funktion i mediale habenula neuroner5. Det blev også brugt til at hjælpe vise, for første gang, at ventrale tegmentale område glutamat neuroner express funktionelle nAChRs i deres perisomatic og dendritiske cellulære rum6. Der er mange potentielle fremtidige anvendelser af denne teknik, og tilgangen kunne anvendes på andre centrale neuron typer, der er kendt for at udtrykke nAChRs, såsom kortikale pyramideformet neuroner31 eller interneurons i hjernebarken32, striatum33 , og hippocampus19. Denne teknik kan også kombineres med farmakologi og/eller nAChR-gen redigering34 for at lokalisere specifikke receptor undertyper til forskellige neuronal rum. Metoden kan være let tilpasses til andre cumarin fra burhøns forbindelser, herunder, men ikke begrænset til, dem udviklet parallelt med PA-Nic5. Endelig, PA-Nic flash fotolyse måske en dag bruges i dyrets vågen/opfører sig til at studere Nikotins indsats i romanen adfærdsmæssige farmakologi paradigmer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke laboratorium medlemmer af de følgende nordvestlige delforsøgsledere: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy og Anis entreprenør. Dette arbejde blev støttet af os National Institutes of Health (NIH) (tilskud DA035942 og DA040626 til R.M.D.), PhRMA Foundation (fellowship til M.C.A.) og HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |